β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.
Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.
β बैरल OMPs केवल माइटोकॉन्ड्रिया, क्लोरोप्लास्ट की बाहरी झिल्ली में पाया जा सकता है, और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया 1-3। जबकि वे α-पेचदार प्रोटीन के रूप में इसी तरह की भूमिकाओं की सेवा है, वे एक बहुत ही अलग 8-26 विरोधी समानांतर β-किस्में से लेकर हर कतरा परिचित दो पड़ोसी किस्में से जोड़ा जा रहा एक केंद्रीय झिल्ली एम्बेडेड β बैरल डोमेन से मिलकर गुना राशि (आंकड़े 1 और 2)। β बैरल डोमेन की पहली और आखिरी किस्में तो एक दूसरे के साथ, एक विरोधी समानांतर फैशन में (mitochondrial VDAC को छोड़कर), बातचीत लगभग विशेष रूप से बंद करने और आसपास के झिल्ली से β बैरल डोमेन सील करने के लिए। सभी β बैरल OMPs बदलती अनुक्रम और लंबाई के बाह्य छोरों जो इन छोरों कभी कभी ऐसी Neisserial transferrin में पाया समर्थक बंधन के रूप में 75 के अवशेष, के रूप में के रूप में बड़े होने के साथ ligand बातचीत और / या प्रोटीन, प्रोटीन संपर्क करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा हैTein एक (TbpA) 4। β बैरल OMPs भी एन टर्मिनल या सी टर्मिनल periplasmic एक्सटेंशन जो प्रोटीन के कार्यात्मक उद्देश्य के लिए के रूप में अतिरिक्त डोमेन की सेवा कर सकते हैं (जैसे, बामा 5-7, FimD 8,9, Fadl 10)। जबकि β बैरल OMPs के कई प्रकार मौजूद 11, और अधिक आम प्रकार के दो क्षेत्र, (1) TonB निर्भर ट्रांसपोर्टरों और (2) autotransporters के साथ कम परिचित लोगों के लिए उदाहरण के रूप में नीचे वर्णित हैं।
TonB निर्भर ट्रांसपोर्टरों (जैसे, FEPA, TbpA, BtuB, परि, आदि) पोषक तत्व आयात के लिए आवश्यक हैं और एक एन टर्मिनल प्लग डोमेन ~ 150 अवशेषों है कि एक सी टर्मिनल β- 22 असहाय अंदर tucked मिले मिलकर शामिल बैरल डोमेन बाहरी झिल्ली 12 (चित्रा 3) में एम्बेडेड। हालांकि इस प्लग डोमेन स्वतंत्र रूप से प्रति बैरल के डोमेन से गुजर से सब्सट्रेट को रोकता है, सब्सट्रेट बंधन प्लग डोमेन वीं के भीतर एक गठनात्मक परिवर्तन लाती हैसुराग में गठन के ध्यान में लीन होना करने के लिए (या तो प्लग पुनर्व्यवस्था द्वारा या प्लग का आंशिक / पूर्ण इंजेक्शन द्वारा) जो तब periplasm में बाहरी झिल्ली भर सब्सट्रेट परिवहन की सुविधा कर सकते हैं। TonB निर्भर ट्रांसपोर्टरों ऐसे नेइसेरिया meningitidis विशेष ट्रांसपोर्टरों कि इस तरह के मानव मेजबान प्रोटीन 4,13,14 से सीधे लोहे के रूप में पोषक तत्वों का अपहरण विकसित किया है कि के रूप में ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के कुछ रोगजनक उपभेदों के अस्तित्व के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं।
Autotransporters ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के प्रकार के वी स्राव प्रणाली के हैं और बीटा बैरल OMPs कि एक β बैरल डोमेन (एस्टा और ESPP साथ के रूप में आम तौर पर 12 किस्में) से मिलकर बनता है और एक यात्री डोमेन है कि या तो स्रावित या कम से प्रस्तुत कर रहे हैं सेल 15,16 (चित्रा 3) की सतह। ये β बैरल OMPs अक्सर यात्री डोमेन सेवा के साथ सेल अस्तित्व और डाह में महत्वपूर्ण भूमिका की सेवा या तो एक प्रोटीज, adhesin, और / या अन्य एफई के रूप मेंफेक्टर कि रोगजनन मध्यस्थता करता है।
इस तरह के एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) हमें परमाणु संकल्प पर OMPs जो बदले में समझने के लिए वास्तव में वे कैसे बाहरी झिल्ली के भीतर कार्य किया जा सकता है के लिए मॉडल निर्धारित करने की अनुमति के रूप में संरचनात्मक तरीकों। इस अमूल्य जानकारी तो यदि लागू नशीली दवाओं और वैक्सीन के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, transferrin बाध्यकारी एक प्रोटीन (TbpA) नेइसेरिया की सतह पर पाया जाता है और क्योंकि यह सीधे मानव transferrin बांधता है और फिर निकालता है और अपने स्वयं के अस्तित्व के लिए लोहे का आयात रोगजनन के लिए आवश्यक है। TbpA बिना, नेइसेरिया मानव मेजबान से लोहा मांजना नहीं कर सकते और गैर रोगजनक गाया जाता है। बाद TbpA 4 के लिए बाध्य मानव transferrin के क्रिस्टल संरचना हल किया गया था, यह बहुत स्पष्ट है कि कैसे दो प्रोटीन जुड़े बन गया, TbpA की क्या क्षेत्रों बातचीत की मध्यस्थता, क्या अवशेषों TbpA द्वारा लोहे की निकासी के लिए महत्वपूर्ण थे, औरकैसे एक को निशाना TbpA नेइसेरिया के खिलाफ चिकित्सा विज्ञान का विकास हो सकता है। इसलिए, अस्तित्व और रोगजनन के लिए ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया में β बैरल OMPs के महत्व दिया है, साथ ही माइटोकॉन्ड्रिया और क्लोरोप्लास्ट समारोह, और झिल्ली प्रोटीन के इस अनूठे वर्ग के बारे में अतिरिक्त जानकारी संरचनात्मक और प्रणालियों में वे कार्य के लिए जरूरत , सामान्य प्रोटोकॉल व्यक्त करने और संरचनात्मक विधियों द्वारा लक्षण वर्णन के लिए उच्च स्तर पर लक्ष्य OMPs सफ़ाई के समग्र लक्ष्य के साथ प्रस्तुत कर रहे हैं।
β बैरल OMPs ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया, माइटोकॉन्ड्रिया और क्लोरोप्लास्ट में आवश्यक भूमिकाओं की सेवा और कहा कि इन संबंधित अंगों की बाहरी झिल्ली पर आवश्यक आणविक तंत्र के बारे में जानकारी का खजाना प्रदा?…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).
Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | – | Any should work here, except for LCP crystallization |
PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | – | |
Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | – | |
UV-vis spectrometer | Eppendorf | – | |
SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
AkTA Prime | GE Healthcare | – | |
AkTA Purifier | GE Healthcare | – | |
Microcentrifuge | Eppendorf | – | |
Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | – | |
Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | – | |
SS34 rotor | Sorvall | – | |
Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
Emulsiflex | Avestin | – | |
Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | – | |
VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | – | |
Gas-tight syringe (100 mL) | Hamilton | ???? |