Abstract
側脳室の脳室下帯における神経幹細胞（NSCは）（SVZ）は、哺乳動物の脳での生活を通して、嗅覚神経新生を維持します。彼らは、連続的に、彼らは嗅球を統合した後ニューロンへの分化のトランジット増幅細胞（のTAC）および神経芽細胞を生成します。並べ替え新興蛍光活性化セル（FACS）技術は、NSCの分離ならびにそれらの子孫を許可されており、成人の神経性のニッチにおける遺伝子調節ネットワークを解明し始めています。私たちはここに従うとLEX / EGFR / CD24トリプル染色成人SVZから上記細胞集団の細胞周期動態を区別することを可能にする細胞選別技術を報告しています。単離した細胞は、その後、タイムラプスビデオ顕微鏡により、それらの細胞周期の進行を詳細に調査するために接着細胞としてプレーティングされます。この目的のために、我々は細胞がドゥリン赤蛍光である、トランスジェニック蛍光ユビキチン化細胞周期インジケータ（FUCCI）マウスを使用G G G 1、特定の赤CDT1レポーターによる1相。この方法は、最近、増殖するNSCは、徐々に神経発生の障害につながる、老化の間に彼らのG 1期を長くすることを明らかにしました。この方法は、他のシステムに容易に転移され、脳の病理の文脈における脳細胞の細胞周期動態の研究のために非常に重要であり得ます。
Introduction
静止神経幹細胞（NSCは）大人のニューロン新生1のソースであり、その増殖に変換できる形式は、EGFR（aNSCs）2を発現している 「活性化」。一旦活性化、彼らはアストロサイトの管を通って嗅球（OB）に移行し、最終的には、ニューロン4,5に分化後、トランジット増幅細胞（TACは）3および神経芽細胞を生じさせます。 NSCとその子孫は、それらの増殖6を制御する無数の要因が関与し、側脳室に沿って特殊な「ニッチ」のアーキテクチャで構成されています。 SVZ神経性細胞の単離および精製は、その増殖の複雑な分子調節を照明する必要があるが、原因特定のマーカーと適応技術の不足のために長い時間のための挑戦を続けています。
フローサイトメトリーを使用して新しいアプローチは、NSCのとtheiの単離を可能にレンダリングされています大人のSVZ 2,7-11からのR子孫。 、静止および活性化のNSC、のTAC： セル 2 増殖にEGFRにラベルを付けるために神経芽細胞マーカーCD24 13と蛍光EGFと一緒に幹細胞マーカーLEX 12を使用して、我々は最近、主SVZ神経性集団の5の精製を可能にする、FACS戦略を開発しました未熟なだけでなく、移行する神経芽9。ここでは、このセルが技術を分類し、どのように初めての両方の静止および活性化NSCの単離を可能にしたLEX / EGFR / CD24トリプル染色詳細に説明します。
神経発生は、成人期に持続するが、新たな神経細胞の生産が大幅に脳の老化14に減少します。ほとんどの研究は、SGZおよびSVZ 15-20で前駆細胞の増殖の数の漸進的削減に同意するものとします。 SVZにおける神経発生における加齢に伴う低下がnの減少を引き起こすような結果には無害ではありません高齢者の脳の嗅球におけるewbornニューロンは、最終的に老齢マウス18で嗅覚差別で障害につながります。神経前駆細胞の細胞周期動態を解明することは、老化の間に大人の神経新生の進化のメカニズムを理解するための重要なステップです。最近の研究は 、インビトロ21 およびインビボ 22 において成体神経幹細胞の細胞周期及び系統の進行を調べたが、それらはいずれも、単離された細胞の細胞周期相を可視化するため、細胞選別技術と遺伝的にコードされた蛍光細胞周期プローブの利点を取っていません単一細胞レベルで。
ここでは、G 1、SG 2 / M期の区別23を可能にすること 、細胞が細胞周期中に蛍光である、トランスジェニックFUCCIマウスを利用して、プロトコルを記述します。このプロトコルは、どのように将来のNSCの単離および成人FUCCIマイルからその子孫を示していますタイムラプスビデオ顕微鏡と組み合わせたCEは、単一細胞レベルでの細胞周期ダイナミクスの研究を可能にします。
Protocol
このプロトコルは、11月24日の欧州共同体理事会、1986（609分の86 / EEC）に準拠して設計されており、当社の動物福祉制度委員会（CETEA-CEA DSV IDF）によって承認されています。
培養前とビデオ顕微鏡1.基本設定
- 共焦点ビデオ顕微鏡用ガラス底培養プレートまたはμ-プレートを使用してください。 1の場合- 5×10 3細胞/ウェル、よく以上5×10 3細胞 / 96ウェルプレート、24ウェルプレートを使用しています。
- 少なくとも一日前に実験を開始し、接着単層培養のための滅菌ポリ-D-リジン（PDL）でコーティングしたプレートを準備します。各ウェルの底部を被覆するために十分なPDL（のdH 2 O中10μg/ mlの）を追加し、37℃でO / Nインキュベートします。 PDL溶液を除去し、プレートを層流の下で、少なくとも2時間の間にフードで乾燥させる前のdH 2 Oで3回すすいでください。すぐに使用しない場合は、でコーティングされたプレートを保存します-20℃。
- 9でNSC基礎培地およびNSC増殖サプリメントを混合することにより、培養液を準備：1の比率を2μg/ mlのヘパリン、20 ngの/ mlの精製ヒト組換え上皮増殖因子（EGF）、および10 ngの/ mlのと一緒に（材料表を参照してください）ヒト組み換え線維芽細胞増殖因子2（FGF-2）。使用前に37℃の水浴中に培地をウォームアップ。
- SVZ解離のために、パパイン溶液を調製：1mg / mlのパパイン0.2 mg / mlのL-システイン、0.2 mg / mlのEDTA、および0.01 mg / mlのDNアーゼIを含有するアールのバランス塩溶液（EBSS）中の（15 UI / ml）をPBSインチ0.2μmのフィルターを通過することにより、溶液を滅菌します。使用前に37℃で溶液を平衡化。
- DMEM：F12培地0.7 mg / mlのトリプシンインヒビターII型を含む酵素反応を停止するには、プロテアーゼ阻害剤溶液（オボムコイド）を準備します。 0.2μmのフィルターを使用してソリューションをフィルタリングします。
- 脳およびPBS 0.15％BSAのPBSを収集するために0.6％のグルコース溶液を調製します洗浄工程および抗体染色のためのolution。
- ハサミ、ピンセットを解剖し、結ぶ、メス：解剖ツールを準備します。 70％エタノールでそれらを浸します。
2.収穫成体マウスの脳とSVZ Microdissections
- 犠牲成人FUCCIマウス23（老化研究のための2から3ヶ月齢および/ または12ヶ月齢）は、適切な機関のガイドラインに従う頸椎脱臼を行います。
- 70％エタノールを用いてマウスをスプレーし、鋭いハサミを使用してヘッドをカット。
- 頭蓋骨を明らかにするために、頭皮に沿って切開してください。
- はさみの小さなペアを使用して嗅球に向けて頭蓋底から始まる縦正中線のカットを行います。はさみの刃で、基礎となる脳の損傷を避けるようにしてください。脳が露出するように湾曲鉗子で頭蓋骨の上部の開口部を削除します。
- PBS中の0.6％グルコースを含む15ミリメートルのペトリ皿に脳を収集します。
- D嗅球を離れissect。その背側表面に脳を置き、メスを用いて視交叉を通じて冠状断面を作ります。
- 解剖顕微鏡下では、実験者に向かって上向きにカットコロナル面で脳切片の吻側部分を配置します。
- 、SVZを分析細かい曲がったピンセットでセプタムを削除するには、次に心室にすぐ隣接する線条体に微細な鉗子の先端を挿入し、周囲の組織からSVZを切り離します。詳細については、Azari ら。24を参照してください。 PBS-0.6％グルコースの1ミリリットルを含むペトリ皿に解剖SVZを置きます。
3. SVZの組織解離
- 大きな作品が残っていないまで、ペトリ皿に解剖SVZをみじん切り。
- 5分間200×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機にPBS-0.6％グルコースと一緒にみじん切りの組織を転送します。
- 上清を捨て、予め温めておいたパパインの1ミリリットルを追加します（1mg / mlで、37℃の水浴中で10分間、0.01 mg / mlのDNアーゼIをインキュベートを補充した）ステップ1.4で調製しました。マウスあたりパパインの1ミリリットルを使用してください。
- 5分間200×gで遠心分離し、上清を捨てます。
- パパインの活動を停止する（0.7 mg / mlの、ステップ1.5で調製した）オボムコイド予め温めておいた1mlのを追加します。機械的に優しくP1000マイクロピペット先端を下に20回ピペッティングにより単一細胞懸濁液にさらに細分化した組織を解離します。気泡を避けてください。
- 新しい15mlチューブに無菌の20μmのフィルターを通して細胞懸濁液を渡します。細胞が失われないように、PBS 0.15％BSAで細胞フィルターを洗浄することを確認します。
- 10分間200×gで遠心分離し、上清を捨てます。再懸濁0.15％BSAを含む100μlのPBSで細胞を。
細胞選別のための4免疫蛍光染色
セルはFUCCIレッドマウス（ 図2A）を使用してソートするため、以下を使用します抗体：CD24フィコエリトリンcyanine7共役【PC7]; CD15 / LEXフルオレセインイソチオシアネート[FITC共役とAx647共役EGFリガンド。
注：LEX + EGFR +細胞およびEGFR +細胞は、成体SVZに豊富ではないが、それぞれ≈600〜1500細胞/マウス9。我々は十分な材料を持っている2〜3匹のマウスからのSVZ細胞をプールすることをお勧めします。細胞選別期間が3時間を超えないように、同じ日に12以上のマウスでは動作しません。同じ日にあまりにも多くのマウスでの作業は増加した細胞ソーティング期間はおそらく増加した細胞死および/または細胞分化の結果につながることを覚えておいてください。
- マウスあたり（または最適な染色のために2〜3匹のマウスのグループの200μl中）をPBS 0.15％BSAを含む100μlのFACS染色を実行します。
- 対照チューブを準備します。メーカーによると、単一色の対照チューブを準備するために、補償ビーズを使用9; sのプロトコル。細胞の割合（1マウスで十分ですから抽出した細胞の10分の1）を選択し、1ネガティブコントロールチューブ（マークされていない細胞）および3蛍光マイナス1（FMO）対照チューブを準備するために4チューブにそれを分けます。チューブあたりPBS 0.15％BSAを200μlの細胞を再懸濁します。
ヒント：LEX-FITC FMOの制御のために、CD24-PC7（1時50分）とAx647共役EGFリガンド（1：200）で細胞を標識します。 CD24-PC7 FMO制御のため、CD15 / LEX-FITC（1時50分）と細胞とAx647共役EGFリガンドラベル（1：200）とAx647共役EGFリガンドFMO制御のために、CD15 / LeX-で細胞を標識FITC（1：50）およびCD24-PC7（1：50）。 - 細胞選別のために使用されるチューブのために、PBS中に示された希釈率で0.15％BSAを以下の抗体を使用する：CD24-PC7（1時50分）、CD15 / LEX-FITC（1：50）とAx647共役EGFリガンド（1： 200）。
- 暗闇の中で4℃で20分間インキュベートします。 10分間200×gで1mlのPBS 0.15％BSAおよび遠心分離機で洗います。 200で細胞を再懸濁81;脳あたりPBS 0.15％のBSAのリットル。氷上で細胞選別管を維持し、細胞選別にすぐに進みます。
- LEX-FITC抗体株式としてFUCCI -緑色蛍光（ 図3A、B）と同じ発光波長を細胞選別前に分離カラムを使用して、個別のLEX陽性とLEX陰性画分をFUCCI -グリーンマウスを使用している場合。
- まず、PBS 0.15％BSAを含む100μlの暗所で4℃で15分間、マウス抗ヒトLEX抗体（1：50）で細胞を標識します。
- その後、暗所で4℃で15分間、抗マウスIgMマイクロビーズ（1:10）で細胞を標識、10分間200×gで1mlのPBS 0.15％BSAおよび遠心分離で細胞を洗浄します。
- 10分間200×gで1mlのPBS 0.15％BSAおよび遠心分離で細胞を洗浄します。 500μlのPBS 0.15％BSA中で細胞を再懸濁し、 図3のCに図式として磁場中で分離カラムを通して細胞を注ぐ。1mlのPBS 0.15％Bでカラムを洗浄SA LEX陰性画分を得ました。
- LEX陽性画分を得るために、磁場からの分離カラムを除去し、2 mlのPBS 0.15％BSAで細胞を溶出します。
- 4.2に示すように、CD24-PC7とAx647共役EGFリガンド染色に進みます。
5.セルソーティング
注：細胞を、86ミクロンnoozleで40 psiで、FACSソーターで選別しました。 520 / 35nmの（FITC）、575 / 26nm（PE）、670 / 20nmの（Ax647）及び740LP（PC7）：蛍光は、以下のフィルターセットを使用して収集しました。報酬は重複がFUCCI - 赤色蛍光およびPC7色素の発光スペクトルとの間で見られるような偽陽性シグナルを防ぐために必要です。
- 細胞選別の直前に、死細胞からのライブ区別する生体色素を追加します。私たちは、2 / mlの最終濃度でHOを（材料の表を参照）を使用しました。 FACS選別機を通して陰性対照チューブ（マークされていない細胞）を実行し、目を選択eは、細胞側方散乱（SSC）および前方散乱（FSC）のパラメータ（ 図1A）を使用 。
注：死細胞のみHO陰性画分（ 図1A '）をゲーティングすることによって除外し、次いで二重パルス幅陰性画分（ 図1（a）選択して除外された'を'）。 - （オフスケールすなわち陰性集団が高すぎるおよび/ または陽性細胞）必要に応じて電圧ステップ4.2で作成し、単一のカラーコントロールを実行し、光電子増倍管を調整する（PMT）。ソフトウェアの補正ウィンドウで色補正を行います。
- ファイル名を指定して実行FMOは、ステップ4.2（LEX-FITC FMO制御、CD24-PC7 FMO制御とAx647共役EGFリガンドFMO制御）で準備を制御するとソートゲート（ 図1）を描きます。 1.5ミリリットルのマイクロチューブ中の培養培地100μlに直接細胞をソートします。
顕微鏡用の細胞の6準備
- たてソート細胞をプレート1の密度でS - 3×10 3細胞/ウェルのポリ-D-リジンを培地300μlの96ウェルμ-プレートをコーティングしました。
- 細胞接着を可能にするために、少なくとも1時間、ビデオ顕微鏡検査の前に、37℃で培養プレートをインキュベートし、5％CO 2。
7.顕微鏡のセットアップと画像収集
- CO 2雰囲気の5％の下で37℃で反転サーモスタット室に取り付けられた共焦点レーザー走査顕微鏡システム上：プランアポVC 20倍DIC目標（0.75 NA）を使用してライブイメージングを実行します。
- あらかじめ温めて、平衡化温度調節チャンバー内に96ウェルμ-プレートを置き、サーモスタットカバーで蓋を交換してください。
- NIS-要素ソフトウェアを開き、メニューバーのをクリックタイムラプスのオプション（長さ、ステージ位置、共焦点のzセクション、...）、「取得/取得コントロールを選択し、「取得/取得は/ NDの取得を制御します」 / Tiのパッド221;メニューバーの各蛍光のためのPMTレベルを選択することが目標と「取得/取得コントロール/ A1plus設定」を選択します。データファイルを保存するフォルダを選択します。
- ND取得ウィンドウを使用して、各中心部だけでなく、ステージ位置を設定し、7×7mm²のに大きな画像のオプションを選択します。これは、各ウェルの中央付近でモザイク画像を作成します。 5％に大きなモザイク画像のオーバラップを設定します。 24時間ごとに20分写真を撮ります。チタンパッド]ウィンドウで：プランアポVC 20倍DIC目標（0.75 NA）を選択します。
- A1plus設定ウィンドウでは、1.26ミクロン/ピクセルの解像度で512×512ピクセル・フォーマットで高速レゾナントスキャナを使用して画像を取得します。セル形状を可視化するために明視野を使用してください。 FUCCIレッドマウスの場合には、561 nmの赤色蛍光を励起し、50分の595 nmのフィルターを用いて収集します。 FUCCIグリーンマウスの場合には、488 nmの緑色の蛍光を励起し、40分の530 nmのフィルターを用いて収集します。最適なPMを決定しますTレベル、波長ごとにオフセットレーザパワー。
注：私たちは、ソフトウェアがそれぞれ取得する前に、各ステージ位置でオートフォーカスを可能にするために明視野チャンネルに対してオートフォーカス機能を使用することをお勧めします。ヒント：プランアポVC 20倍DIC目標（NA：0.75）は油を必要とせずに、その優れた解像度のために使用されました。他の目的は、所望の光学解像度に応じて使用することができます。 - 取得を開始するためにND取得ウィンドウの[今すぐ実行]ボタンを選択します。
ヒント：正常に動作してのすべてそれを確認するために、1ループのためのコンピュータワークに従ってください。
8.画像処理と解析
- 個々の細胞を追跡することによって、NISの要素のソフトウェアに直接データを分析します。ヒント：、時間を稼ぐ、NISの要素ソフトウェアを使用して、.AVI形式でそれぞれの位置を保存し、ImageJので映画を分析します。
- ImageJソフトウェアでは、少なくとも2分割（ すなわち、一つのセルにを受ける個々の細胞を追跡します4セルコロニー）。セルの周りの小さな領域をトリミングし、「画像/複製」を選択します。
- モンタージュを作るために、メニューバーの[イメージ/スタック/メイクモンタージュ」を選択します。 、フレームが含まれるように画像のサイズを指定し、最適な解決のための.tifファイルとしてモンタージュを保存します。
- 最初のSG 2 / M期の長さ（ 図2C、D）を計算するには、（G 1）単一赤色蛍光セルを選択し、tは（赤蛍光がオフ一度S期が開始されます）= 0と設定してください。セルは、SG 2 / M長さを推定するために分割するまでのフレーム数をカウントします。
注：算出された時間は、各フレーム間の時間間隔に依存します。 - 次のG1期（ 図2C、D）を計算するには、単に分割されたセルを追跡し続けます。分割されたセルは、G1期に入ると、CDT1赤の蛍光タンパク質の蓄積が存在することになります。赤蛍光がAGAをオフにするまでのフレーム数を計算します各セルのインチ
ヒント：G 1の開始時に赤色蛍光が弱い可能性がありますので、セルは近似値を回避するために分割したフレームに、G 1期の開始を選択します。
Representative Results
確実に成体マウスのSVZ幹細胞系統の異なる細胞集団間を識別するための能力は、それらの機能的特性を研究するために原始あります。静止のNSC（LEX 明るい ）、活性化されたNSC（LEX + EGFR +）、のTAC（EGFR +）の：その目的のために、私たちは大人のSVZから特定 の細胞集団の精製を可能にするLEX / EGFR / CD24トリプルラベリング戦略を開発しました、未熟および移行神経芽細胞（それぞれ、CD24 +、EGFR +およびCD24 +、）9（ 図1）。 FUCCIトランスジェニックマウスに適用される、技術を細胞選別は、単一細胞レベル25で異なる神経性集団の細胞周期相のライブイメージングを可能にします。 FUCCI -レッドマウスをタイムラプスビデオ顕微鏡（ 図2A）を使用して、赤色蛍光とG 1期に従うために使用されました。 FUCCIレッド陰性細胞は、S-内のセルを表しG 2 / M細胞周期の位相、FUCCIレッドPOS細胞は、G 1細胞とFUCCIレッド明るい細胞である細胞は、終了または細胞周期（ 図2B）23,26のうちされています。 LEX + EGFR +および若年成人（ 図2C）と中年マウス（ 図2D）から、EGFR +細胞をポリ-D-リジンコーティングした培養プレート上の接着細胞としてプレーティングしました。赤色蛍光は、細胞が分裂するまでオフにしたら、最初のSG 2 / M期は、単一細胞で同定されました。以前SGに観察されたように2 / M期の長さは、いずれかの若いまたは中年のマウスではLEX + EGFR +およびEGFR +細胞の間には差は認められませんでした。赤色蛍光がオフになるまでその後、我々は最初の分裂から次のG 1期の長さを計算しました。興味深いことに、G 1期の延長は、LEX + EGFR +細胞ではなく、加齢の間に発見されましたEGFR +細胞25（ 図2C、D）です。結果として、ニューロスフェアは、5日後に得られためっきは、 図2Eに示すように、老齢マウスから得られたLEX + EGFR +細胞が小さいです。
FUCCIグリーンマウスは緑色蛍光（ 図3A、B）とSG 2 / M期を可視化するためにも使用することができるが、LEX-FITC抗体はFUCCI-と同じ発光波長を共有ように、細胞は、分離カラムを使用して事前にソートされなければなりません緑色蛍光（ 図3C）。若い成人LEX + EGFR +およびEGFR +細胞の最初のSG 2 / M期のためFUCCI -緑色蛍光の例を図3Dに示されています。
図1：FACSによる細胞選択の戦略（A）細胞を、最初に、Tに応じて選択しました。前方散乱（FSC）パラメータ対側方散乱（SSC）を使用して相続人の形態。形態のゲート選択の詳細については、Daynac らを参照してください。9（A '）死細胞は、HOマーカーを用いて標識し、選択から除外した。（A' '）ダブレットは、パルス幅パラメータを使用して除外しました。ソートゲートを設定するために、蛍光マイナス1（FMO）はCD24-PC7のコントロール（LEX-FITC / FUCCIレッド/ EGF-Ax647ラベリング; B）とLEX-FITC（FUCCIレッド/ EGF-Ax647 / CD24 -PC7ラベリング; B '）を用いた（C、C'そして、ソートゲートはLEX-FITC / FUCCI -レッドFMOのコントロールと一緒に/ EGF-Ax647 / CD24-PC7ラベル管で測定しました）。全細胞の平均パーセンテージはゲート内で表現されます。 CD24 +細胞 （神経芽細胞）を選択した場合、ゲートからCD24 明るい発現細胞を排除するように注意してください。上衣CEに実際に、CD24 明るい対応LLS 2.9。C 'は 、CD24陰性細胞（Cの黒い四角）を示しています。 LEX + EGFR及びEGFR + +（C '）は選別ゲートは、この研究に使用しました。
図2：FUCCI -レッドマウスを用いた細胞周期のライブ分析（A）細胞は SG 2 / M期23（B）のFACS表現の中にG1期の間に赤蛍光と無色であるFUCCI -レッド細胞周期の模式図。 FUCCIレッドSVZ細胞の蛍光。LEX + EGFR +と若い（C）から選別EGFR +細胞と（C、D）ビデオ顕微鏡および中年（D）FUCCIレッドマウスがでG 1期の追跡を可能にしますSG 2 / M期のに対し、赤色蛍光は、WHEを推定することができますn個の赤色蛍光がオフになります。連続した画像を Dに提示時間スケールで表示されます。コロニーの（E）代表的な画像（ニューロスフェア）めっき後5日間取得しました。スケールバー：10μmの（C、D）、30μM（E）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：FUCCI-グリーンマウスを用いた細胞周期のライブ分析のための戦略（A）細胞は、SGの間にG 1期23時の2 / M期と無色の緑であるFUCCI -グリーン細胞周期の模式図（B）のFACS表現FUCCIグリーンしばらくFUCCI -グリー陰性細胞は 、細胞周期のG 1期にある細胞を表す：FUCCI -グリーン蛍光のn個のPOS細胞はLEX + EGFR +およびEGFR +細胞の緑色蛍光SG 2 / M期に従うためには、SVZ細胞が分離カラムを事前にソートされなければならなかったSG 2 / M 23のセル。（C）です。細胞を抗マウス抗体とLEX LEX +画分を抗マウスマイクロビーズを使用して、カラムに保持された標識した（プロトコル4を参照）。その後、LEX +と LEXは-画分を溶出し、EGF-Ax647およびFACS選別のためのCD24-PC7抗体で標識した（D）をビデオLEX + EGFR +の顕微鏡およびEGFR若いFUCCIグリーンマウスから選別+細胞はの追跡を可能にします。緑色蛍光とSG 2 / M期。連続した画像を Dに提示時間スケールで表示されます。スケールバー：10μmの（D）。
Discussion
本明細書中に記載の技術を細胞選別が静止するNSC活性化のNSCとその子孫との間に信頼性の高い差別は成体の脳9におけるそれらの特性とダイナミクスの研究を可能にすることができます。生きた細胞23に細胞周期の進行の可視化を可能にするFUCCI技術と相まって、我々は若年成人と高齢者のマウスの脳細胞から細胞周期のG 1、SG 2 / M期に従うように迅速かつ効率的な技術を開発しました。
このプロトコルで使用される細胞選別技術はSVZ 9から5つの主要な神経性集団の精製を可能にするマーカーの最初の検証を組み合わせました。また、静止および活性化NSCの区別を可能にする最初の検証手法でした。なお、この技術は、SUのトランスジェニックマウスモデルに適合したときに必要であるトランスジェニックマウス自体の使用を必要としないことは注目に値しますFUCCIとしてCH。それ以来、コデガら 10は、その活性化した相手からの静止のNSCを区別するために、GFAP-GFP / CD133 / EGFRトリプルラベルの組み合わせを使用しているが、それはGFAP-GFPトランスジェニックマウスの使用を必要とするように、FUCCI技術に適合させることはできません。ミシガンら 11は、本研究9で使用される技術と共通の結果を共有するGLAST / EGFR / CD24トリプルラベリング戦略を開発しました。実際に、lexとGLASTのNSCマーカーの間に高い相関関係がすでにDaynac らで観察された。9を研究 。しかし、ミシガン州らの技術で使用されるGLAST抗体は、フィコエリトリンに結合され、従ってFUCCIレッドマウスの使用に適合させることができません。
SVZ細胞を選別する前に注意が必要ないくつかの重要な技術的なポイントがあります。まず、解離工程は、脳組織の構造を維持しながら、単一の細胞に分離しなければならないように非常に重要です抗体標識戦略のために使用されるタンパク質のtegrity。 0.05％トリプシン-EDTAをSVZ組織27を解離するのに非常に有効であることが示されているが、LEX抗原は、LEX-FITC免疫蛍光（データは示さず）失われたほぼすべての非常に敏感であることが見出されました。それが脳組織に他のプロテアーゼよりも効率的かつ少ない破壊的であったようにこのように、パパインを使用しました。また、LEXもEGFRもCD24のいずれも、パパイン処理によって影響を受けました。これは、パパイン処理は、15分を超えた場合に抗体標識が変更されたことに留意すべきです。我々は、機械的解離（ピペット上下20回）に関連した10分のパパイン処理で最適な結果を得ました。
ポリ-D-リジンコーティングは、接着細胞の文化と文化の中で、数日後にコロニーを形成することができます。これは、現在広くin vitroアッセイでその限界28,29に付属していることが認められています。私達はのための唯一の最初の細胞周期を決定お勧めします少なくとも一つの後続の分裂を受けている細胞は、in vivoでの細胞表現型に可能な限り近い滞在します。
FUCCI システム 23 を設計するために使用される Gemininの（緑色蛍光）とCDT1（赤色蛍光）タンパク質は、以前にマウス30および成体脳組 織9,25内に豊富に初期神経発生の間に神経前駆細胞によって発現されることが示されたことを言及して注目すべきことです。 mKO2-hCdt1（120分の30）構築物は、主に赤色蛍光とG1期に従うように本研究で使用したが、両方の構築物の使用[mKO2-hCdt1（120分の30）とMAG-hGem（110分の1） ]細胞周期の主要な段階の可視化（G 1、SG 2 / M）と同様に、G 1 / S移行23を可能にするために想定することができます。デュアルカラーイメージングの主な欠点は、依然として細胞標識のために使用され得る蛍光の限られた適合性の組です。一つの解決策はseparatiを使用することです列に。例えば、我々が正常細胞選別の前に分離カラムを用いて細胞からCD24陽性の割合を枯渇しており、ライブイメージングを我々はFUCCIレッド蛍光25と同じ発光波長を共有CD24-PE抗体を使用されるように。
いくつかの研究は、成体マウスのSVZ集団の細胞周期の長さを調べました。私たちの技術を用いて得られた全細胞周期の長さは、コスタら 21 により 、in vitro で推定 1に近いですが、私たちは、異なる細胞周期の段階を区別するために初めてできました。 in vivo試験では、ポンティら 22は、異なるSVZ細胞集団の増殖動態を決定するために、チミジン類似体の取り込みを使用します。しかし、それらは、細胞周期の継続的な監視を行うことも、単一細胞レベルで細胞を追跡する可能性もありません。それは強力な異質性がウィットに存在することが示されたので、これは問題である可能性があります与えられたSVZ細胞集団22,25をホアヒン。ここでは、単一細胞レベルでの異なる成人の神経性集団の細胞周期相のライブイメージングを可能にする設定が容易体外技術、 代替を説明します。
神経幹細胞および前駆細胞の細胞周期の調節を理解することは、高齢化や脳の病理との関連で新たな治療法の開発のための課題として残って。我々のプロトコルは、このように広範囲の用途を有することができます。老化の文脈では、この技術は、NSCの分化に対する老化の影響を理解するために有用であることが証明できました。実際、それらの赤色蛍光強度が26独特高いほど分化に入る神経幹/前駆細胞を同定することが可能です。最後に、それはまた、系統のプロの責任細胞内因性および外因性のプロセスを研究するために単一細胞レベルでの連続ライブイメージングを活用することが重要であることができ大人のNSCの転位。
Acknowledgments
我々は、Cジュベール、Vノイビル、V Barroca氏、J Tillietおよび動物施設のすべてのスタッフにお世話になっています。細胞選別のためのJ BaijerとN Dechampsへ。彼女の行政支援のための技術支援のためのO.エティエンヌ、およびA. Gouret。フローサイトメトリーおよび細胞選別は、DIM-幹極、INSERM、財団ARC、およびCEAから機器の助成金によって設立、IRCMフローサイトメトリー共有リソースで行いました。この作品は、フランス電力（EDF）の助成金によってサポートされていました。 MDは、地域イル・ド・フランス（DIM生物学的療法）からラ・リーグContreルがんとLMからの交わりを持っています。マルク=アンドレ・MouthonとフランソワD. Boussinシェア共同シニア原作者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
| µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
| NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
| Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
| EGF | Millipore | GF144 | |
| FGF-2 | Millipore | GF003 | |
| Papain | Worthington | LS003119 | |
| EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
| L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
| DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
| Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
| DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
| 20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
| Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
| BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
| CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
| CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] - conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
| Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
| Alexa647 - conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
| CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
| Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
| INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
| Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
| NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
| Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
| ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
| ImageJ | RBS | ||
| FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
| FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |
References
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).
- Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97, 703-716 (1999).
- Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).
- Rietze, R. L., et al. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412, 736-739 (2001).
- Fischer, J., et al. Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone. Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).
- Daynac, M., et al. Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage. Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).
- Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82, 545-559 (2014).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
- Capela, A., Temple, S. LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal. Neuron. 35, 865-875 (2002).
- Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult. Neuroscience. 73, 581-594 (1996).
- Pineda, J. R., et al. Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain. EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).
- Lugert, S., et al. Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging. Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).
- Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice. Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).
- Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood. Neuroscience. 173, 135-149 (2011).
- Enwere, E., et al. Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).
- Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).
- Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138, 1057-1068 (2011).
- Ponti, G., et al. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).
- Sakaue Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
- Daynac, M., et al. TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain. Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).
- Roccio, M., et al. Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns. Development. 140, 459-470 (2013).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of visualized experiments JoVE. , e51225 (2014).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Spella, M., et al. Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle. Neuroscience. 147, 373-387 (2007).
