Abstract
De bijzondere bacterie in onderzoek hier (S. pasteurii) is uniek in zijn vermogen, onder de juiste omstandigheden, om de hydrolyse van ureum (ureolysis) in de natuur voorkomende omgevingen door middel van uitscheiding van een enzym urease induceren. Dit proces van ureolysis, via een keten van chemische reacties, leidt tot de vorming van calciumcarbonaat precipitaten. Dit staat bekend als Microbiologisch Induced Kalkspaat Neerslag (MICP). De juiste cultuur protocollen voor MICP worden hier beschreven. Tenslotte visualisatie experimenten onder verschillende vormen van microscopie werd uitgevoerd om verschillende aspecten van de precipitatie proces te begrijpen. Technieken zoals optische microscopie, scanning elektronenmicroscopie (SEM) en X-ray foto-elektron spectroscopie (XPS) toegepast voor chemische kenmerken het eindproduct. Verder is het vermogen van deze precipitaten poriën verstoppen in een natuurlijke poreuze medium werd aangetoond met een experiment waarbij kwalitatieve sponsstaven werden gebruikt om een porie-netwerk nabootsen met verschillende lengteschalen. Een spons bar ondergedompeld in het kweekmedium dat de bacteriecellen verhardt door de verstopping van de poriën gevolg van de continue werkwijze van chemisch neerslaan. Deze geharde spons bar vertoont superieure sterkte in vergelijking met een controle spons bar die wordt samengedrukt en geperst onder invloed van een toegepaste externe belasting, terwijl de uitgeharde bar kan hetzelfde gewicht ondersteunen met weinig vervorming.
Introduction
Sporosarcina pasteurii is een gram-positieve bacterie kunnen overleven in sterk alkalisch milieu (pH ~ 10) 1 en is een van de bacteriële soorten die een verwekker van een fenomeen genaamd Microbiologisch geïnduceerde calciet Neerslag (MICP) 2-4 kan worden. MICP is een werkwijze waarbij precipitatie van calciumcarbonaat wordt geïnduceerd door bepaalde microben onder geschikte omstandigheden. S. pasteurii belang is de laatste jaren aangenomen vanwege de identificatie als een mogelijk middel voor het teweegbrengen van significante hoeveelheden MICP onder bepaalde omstandigheden. Deze mogelijkheid komt voort uit het feit dat S. pasteurii biedt de unieke mogelijkheid om grote hoeveelheden van het enzym urease scheiden. Dit enzym katalyseert, waarmee een versnelde afbraak van ureum (een natuurlijk voorkomend biochemische verbinding met wijdverspreide en overvloedige toevoer) in aanwezigheid van watermoleculen. Via een cascade van reacties, dit proces uiteindelijkly leidt tot de vorming van negatief geladen carbonaationen. Deze ionen op hun beurt reageren met positieve metaalionen zoals calcium om uiteindelijk neerslag vormen van calciumcarbonaat (calciet); vandaar het label MICP 5-9.
Het proces van MICP is bekend en onderzocht decennialang 10,11. In de afgelopen jaren heeft MICP onderzocht voor een breed scala van techniek en milieu-toepassingen, inclusief bottom-up groene bouw 12, verhoging van grootschalige structuren 13,14 en koolstofvastlegging en -opslag 15,16.
Bijvoorbeeld Cunnigham 17 et. al ontwierp een hoge druk gematigde temperatuur stroming reactor die een Berea zandsteen kern. De reactor was geënt met de bacteriën S. fridgidimarina en onder omstandigheden van hoge druk superkritisch kooldioxide injectie, een enorme accumulatie van biomassa in de poriën vollumes waargenomen, wat leidde tot meer dan 95% vermindering van de permeabiliteit. Jonkers en Schlangen 18 bestudeerde het effect van bepaalde bijzondere stammen van bacteriën op de self-healing proces in beton. getransporteerd naar de poriënnetwerk invoeren via de oppervlakteporiën buitenwater wordt verwacht dat de slapende bacteriën die beurtelings structurele sterkte te activeren via MICP. Tobler 19 et al. de ureolytische activiteit van S. hebben vergeleken pasteurii met een inheemse grondwater ureolytische microkosmos onder omstandigheden grootschalige MCIP en vond dat S. pasteurii heeft een consistente mogelijkheid om calciet neerslag te verbeteren, zelfs wanneer de inheemse gemeenschappen ontbrak voorafgaand urease activiteit. Mortensen 20 et.al hebben de effecten van externe factoren zoals grondsoort, de concentratie van ammoniumchloride, zoutgehalte, zuurstofconcentratie en lysis van cellen op MICP bestudeerd. Hun demonstratie dat de biologische behandeling proces is zeer robuust met respect tot een grote variatie in parameter space onderbouwt de geschiktheid van dit proces voor diverse grootschalige sanering toepassingen die een goede verrijkingsproces om de bacteriën te versterken wordt ondernomen. Phillips 21 et. al experimenten ontworpen om de veranderingen in permeabiliteit en sterkte van een kolom en een zand zandsteen kern na injectie met S. bestuderen pasteurii culturen. Zij vonden dat terwijl de permeabiliteit verlaagd 2-4 keer terwijl de breuksterkte drie maal verhoogd.
S. pasteurii en haar rol in MICP zijn onderwerpen van actief onderzoek en een aantal kwesties met betrekking tot het mechanisme van chemische neerslag nog steeds niet volledig begrepen. In het licht van deze, is het zeer belangrijk om een set van samenhangende gestandaardiseerde protocollen om nauwkeurig cultuur een voldoende verrijkte voorraad van S. hebben pasteurii MICP te bereiken. Hier schetsen we een strenge protocol dat zal zorgen voor de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. deze manuscript beschrijft de gedetailleerde protocollen voor het kweken van S. pasteurii en geschikte het verrijken van het kweekmedium om neerslag te induceren. Het proces wordt onderzocht via verschillende microscopische technieken zoals optische en Scanning Electron Microscopy (SEM) en X-ray foto-elektron spectroscopie (XPS). De focus van het manuscript is het proces van MICP. Procedures zoals SEM en SIMS, die gevestigde standaardprotocollen, worden niet apart beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Voer de experimentele protocollen in de hieronder beschreven volgorde. De bacteriecultuur protocol wordt besproken in paragraaf 1 (zie ook figuur 1). Hoofdstuk 2 beschrijft het protocol voor het verrijken van het kweekmedium met behulp van externe toevoegingen. Hoofdstuk 3 beschrijft de protocollen voor multi-mode microscopie. Gewichten van de afzonderlijke componenten kunnen worden gemeten met een analytische balans. Volume van elke oplossing kan worden gemeten met een volumetrische fles.
LET OP: De juiste bioveiligheid protocollen moeten worden gevolgd voor de afdelingen 1 - 2. Raadpleeg voor meer informatie de institutionele veiligheid kantoor.
1. bacteriekweek
- Cultuur Bacteriën - Agar Plate Medium Voorbereiding
- Monteren apparatuur en ingrediënten zoals Petrischalen, kolf, Tris-base, HCl, agar, Millipore water, pH-meter etc.Sterilize alle containers autoclaaf bij 121 ° C voor gebruik.
- Bereid 1 liter 0,13 M waterige oplossing van Tris-buffer door het mengen van 15,75 g Tris-base met 1 L van Millipore water. Om de pH van de oorspronkelijke oplossing (pH 10,4) toe te verlagen 2800 pl HCl (50% concentratie). Controleer continu met behulp van een pH-meter tot pH = 9 ingesteld.
- Verdeel de 1 L bufferoplossing in twee delen als volgt:
- Neem 800 ml van deze oplossing. Verdeel het tevens in twee delen van elk 400 ml. Ontbinden 8 g (NH 4) 2 SO 4 een oplossing en 16 g gistextract aan het andere oplossing.
- Neem de resterende (200 ml) oplossing en verdeel het weer in twee delen van elk 100 ml. Meng 2 g (NH 4) 2 SO 4 een. Voeg 4 g gistextract en 4 g agar naar de andere.
- Autoclaaf de 4 oplossingen afzonderlijk na het verpakken van de respectievelijke kolven in Al folie en plakken autoclaaf tapes.
OPMERKING: Indien een benchtop autoclaaf eenheid wordt gebruikt, moet het volume ingesteld op 500 ml (temperatuur en druk automaattisch bepaald naar gelang van volume). - Na het nemen van hen uit de autoclaaf, stellen de twee 400 ml oplossingen opzij voor stap 1.3.1 (hieronder). Meng de twee 100 ml oplossingen van een 200 ml oplossing hebben. Giet het mengsel in 10-12 petrischalen.
- Cultuur Bacteriën - Agar Plate Monstervoorbereidingstesten
- Verwijder de bacteriële voorraad van de vriezer (-80 ° C) en laat het ontdooien. Na goed te ontdooien, plaatst de bacteriële voorraad en de agarplaat in een bioveiligheid kap.
- Selecteer de micropipet van de kleinste beschikbare afmeting (0,5-10 pi is een goede keuze) aan de tip met de Sporosarcina pasteurii voorraad teisteren. Streak een agar plaat met de micropipet tip. Plaats de weggeschoten agarplaat in een non-schudden incubator bij 31 ° C gedurende 48 uur.
- Na 48 uur, verwijder de plaat uit de incubator en visueel te onderzoeken voor het bestaan van enkele kolonies. Als er geen enkele kolonies, plaats deze dan in tHij incubator voor een ander 24 uur.
- Herhaal dit totdat enkele kolonies gedetecteerd. Niet meer dan 7 dagen trial.
Opmerking: als enkele kolonies niet verschijnen, zelfs na een week, dan is de conclusie dat de maatregelen niet goed zijn gevolgd en het hele proces moet worden herhaald vanaf stap 1.
- Cultuur Bacteriën - Final Monstervoorbereidingstesten
- Meng 400 ml beide oplossingen (Tris buffer + (NH 4) 2 SO 4 en Tris buffer + gistextract (1.5.1) samen voor het verkrijgen van een 800 ml oplossing. Breng 125 ml van deze oplossing in een kolf.
- Voer een visueel onderzoek van het oppervlak van de agarplaat om gebieden te identificeren met een hoge concentratie van enkele kolonies. Zachtjes nudge en breek een van de kolonies met een micropipet tip.
- Dompel dezelfde micropipet tip in de ml fles 125 en roer het grondig aan dat er voldoende aantal cellen voor robuuste vermenigvuldiging te waarborgen krijgen overgedragen. Plaats de kolf in een schudincubator bij 150 rpm, 30 ° C gedurende 2-3 dagen. Na 2-3 dagen, verwijder de kolf uit de incubator.
- Cultuur Bacteriën - Final celgetal
- Voer seriële verdunning van de niet-verdunde kweekoplossing behulp PBS tot een verdunning van ten minste tien miljoen (10 -7) bereiken waarborgen telbare enkele kolonies verschijnen. Trekken zeven parallelle equidistante lijnen op één van de agar-platen.
- Doe dit door trekken vette lijnen aan de onderkant van de petrischaal prominente voldoende toegankelijk van boven zijn. Drop 3 kleine druppels niet-verdunde oplossing in één segment. Voeg 1 ml onverdunde oplossing van 9 ml van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een 1:10 verdunning te verkrijgen.
- Neem een kleine hoeveelheid (~ 0,1 ml) van deze onlangs verdunde oplossing met een pipet en neerzetten 3 meer kleine druppels op het volgende segment. Zet de pas verdunde oplossing naar een nieuwe kolf en verder verdunde tienmaal (10x) vantoevoegen van PBS. Dit brengt vaststelling van de verdunning tot 10 -2 of 1: 100.
- Gebruik 1: 100 oplossing in het volgende segment. Herhaal dit proces hij met kleine volumes van de vers verdunde oplossingen door ze achtereenvolgens overbrengen van nieuwe flessen en continu verdunnen tienvoudige (10x) samen met PBS steeds meer verdunde monsters van 10 -3 en 1 te verkrijgen: 1000 helemaal tot 10 -7 of 01:10 miljoen in het laatste segment.
- Uitvoeren kolonievormende eenheid (CFU) kiemgetal het aantal cellen aanwezig in de agar kiemgetal na incuberen van de plaat gedurende 1-2 dagen bij 31 ° C. Dit geeft een kwantitatieve maat voor het aantal bacteriën in het onverdunde monster.
OPMERKING: De CFU waarde wordt gemeten op basis van het vermogen van het systeem om tot kolonies geven onder de specifieke omstandigheden van voedingsmedium, temperatuur en tijd ervan uitgaande dat elke kolonie afzonderlijk en opgericht door een levensvatbare microbiële cel. - zeehondde Petrischalen met zelfdichtende film en bewaar overige items in de koelkast voor toekomstig gebruik.
- Voer seriële verdunning van de niet-verdunde kweekoplossing behulp PBS tot een verdunning van ten minste tien miljoen (10 -7) bereiken waarborgen telbare enkele kolonies verschijnen. Trekken zeven parallelle equidistante lijnen op één van de agar-platen.
2. Protocol voor de verrijking van Nutrient te Neerslag Accelerate
- Overdracht 9 ml van de bereide vloeistof (cellen + medium) in verschillende gesteriliseerde centrifugebuizen van 10 ml elk volume.
- Bereid een 100 ml voorraadoplossing van de externe verrijking bestaat uit vier componenten in de volgende concentraties in vers medium: Ureum: 2 g / l, Ammoniumchloride: 1 g / l, Natriumbicarbonaat: 212 mg / L, calcium chloride: 280 mg / L. Meet zorgvuldig alle ingrediënten met een analytische balans en meng alles behalve ureum vers medium in een beker en plaats in de autoclaaf (121 ° C, 15 psi, 15 min).
- Na autoclaaf Meng de benodigde hoeveelheid ureum (2 mg) met 1 ml vers medium en passeren een injectiespuit voorzien van 0,22 urn spuitfilter de werkwijze van verrijking voltooien.
- Voeg 1ml van deze ophopingsmedium met additieven voor gesteriliseerde centrifugebuizen met 9 ml van de bereide vloeistof (cellen + medium) (zie stap 2,1).
Opmerking: Van al deze componenten, ureum afbreekbaar bij verhoogde temperaturen, kan niet worden gesteriliseerd in een autoclaaf. Na toepassing van de andere componenten zijn autoclaaf (121 ° C, 15 psi, 15 min), ureum laatste toegevoegd door een 0,22 urn spuitfilter.
- Vortex elke buis grondig met een mechanische vortexer. Plaats de verrijkte vloeistoffen (cellen + medium + additieven) in een niet-schudincubator bij 30 ° C. Monitor alle eenheden regelmatig voor aanvang van de neerslag. Met behulp van een lichtmicroscoop, beginnen microscopische waarneming na aanvang neerslag wordt met het blote oog. Dit is gewoonlijk tussen 30-36 uur na het begin van experimenten.
3. Protocol voor multi-mode Microscopie
- Transfer een klein volume (~ 1 ml) vloeistof een hoge magnification microscopie-chambered dekglaasje systeem om de eerste waarnemingen met heldere veld modus uit te voeren. Om te beginnen, beginnen alle waarnemingen met de kleinste vergroting (4x). hetgeen een groot dekkingsgebied en dus globale informatie over de verdeling van precipitaten.
- Selecteer specifieke gebieden met aanzienlijke hoeveelheden neerslag en opnieuw in (20X, 40X, 60X) van de vergroting geleidelijk toeneemt.
LET OP: Omdat het onmogelijk is om de cellen van de extracellulaire polymere substantie (EPS) onder bright-field goed op te lossen (als gevolg van zeer dicht brekingsindex), schakel fase-contrast-modus wanneer dat nodig is. In deze modus slechts de contouren van de celmembranen (zijnde een andere fase dan de bulk cel) zijn toegankelijk, waardoor visuele differentiatie. - Tot slot vlek sommige kamers met Live / Dead vlek die selectief kleurstoffen de live-componenten als groene terwijl het inkleuren van de doden componenten in het rood. Raadpleeg standaardprotocollen 28 </ Sup>.
- Schakel fluorescerende modus goed onderscheid tussen de rode en groene gebieden. Rood (rode filter kubus met excitatie golflengte van 540-580 nm, Dichroic spiegel van 595 nm en Barrier filter van 600-660 nm) en Groen (GFP Long-pas Green filter kubus met excitatie golflengte van 440-480 nm, Dichroic spiegel van de 505 nm en Barrier filter van 510 nm) filter kubussen worden gebruikt om fluorescerende microfoto vergemakkelijken.
- Zodra alle multi-mode data verzameld, selecteert de beste afbeeldingen handmatig overlay (individuele helderveld, fasecontrast en fluorescentiebeelden) om de best mogelijke contrast en helderheid te verkrijgen.
- SEM uitvoeren van de droge vaste monsters kristalstructuren begrijpen. Dit is een gevestigde en standaard procedure. 22 Voer XPS chemische handtekeningen van functionele groepen (carbonaten) te identificeren. Dit is een gevestigde en standaardprocedure ook. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
S. pasteurii zijnde een alkalifiel 24 kan relatief zware omstandigheden te overleven. Bovenvermelde cultuurprotocol gevolgd en S. pasteurii wordt gekweekt in een kamer, de bacteriën leidt tot de precipitatie van calciumcarbonaat in de tijd (Figuur 2A). Figuur 2 (b) toont een fase-contrast microscopische optische beeld van de bacteriële cel populatie in het kweekmedium. Individuele cellen kunnen duidelijk onderscheiden met staafachtige vormen kenmerkend de bacil klasse van bacteriën duidelijk zichtbaar. Kleine bruine pijlen zijn gebruikt om melding te maken van twee afzonderlijke cellen. De precipitatie van calciumcarbonaat optreedt gedurende enkele dagen. Figuur 2A toont hoe de precipitaten bezinken op de bodem van een centrifugebuis. Dit kan levendig worden gezien met het blote oog als een witachtig poeder zit onder het vloeibare medium meteen scherp contrast in kleur tegenover de geelachtige vloeistof. De geelachtige vloeistof bevat bacteriën opgeschort in hun kweekmedium. De witte neerslagen werden verzameld en gedroogd en later afgebeeld met behulp van SEM (figuur 2C).
In figuur 3A, de goed gedefinieerde splitsing lijnen, een kenmerk van kristallijnheid kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. Figuur 3B toont de grafiek XPS voor hetzelfde monster voor karakterisatie. Pieken die overeenkomen met carbonaatgroepen pin-point het bestaan van calciumcarbonaat. Aldus Figuur 3A en B samen overtuigend bewijs de vorming van calciet als chemisch neergeslagen.
Een kwalitatieve experiment werd uitgevoerd om het vermogen van MICP om de eigenschappen van poreuze media wijzigen beoordelen. Hiervoor voerden we een experiment met sponzen die naar verwachting een poreuze bootsenmedium met verschillende lengteschalen van de porie structuur, zoals gevonden in een typisch natuurlijke structuur. Een spons bar (Mr. Clean, P & G) werd ondergedompeld in een oplossing van S. pasteurii gedurende 7 dagen en vervolgens gedroogd. De spons na langdurige blootstelling aan de MICP proces gehard en weergegeven verbeterde drukvastheid. Dit is in Figuur 4 de spons vóór onderdompeling (besturingskast), significante compressie bij onderwerping aan een 1 kg gewicht (Figuur 4A - B).. Anderzijds, na te zijn onderworpen aan onderdompeling in de S. pasteurii oplossing leed het porie verstopping vanwege de resulterende precipitatie calciet. Dit leidde tot een sterke toename in kracht als gevolg van een overbrugging van de poriën en vervolgens kon de balk om de 1 kg aan bagage zonder dat significante compressie (Figuur 4C - D).
Een semi-kwantitatieve ideemet betrekking tot de verharding proces kan worden verkregen door middel van metingen van de uitwijking hoogte van de geladen bar. De originele spons monster een rechthoekige stang met een hoogte van 4,5 cm. De uitslag van de controle-exemplaar, zeer dicht bij het punt van de toepassing van de belasting, is ongeveer 1,6 cm. Bij het behandelde monster, de afbuiging terugbrengt tot 0,6 cm. Verdere rigoureuze kwantificering van het hardingsproces is ook mogelijk. Zo heeft een mechanistische verklaring van dit proces in termen van toename van afschuifsterkte, piek deviatorische stress en dilatancy hoeken door Tagliaferri 25 et voorgesteld. al door middel van X-ray imaging en digitale beeldcorrelatie.
Figuur 1. De Schets van de hele cultuur protocol voorgesteld als een algoritmische Schematische. Om te beginnen, Tris-buffer en agar-oplossing is poured in een petrischaal. Zodra agar plaat klaar is, wordt weggeschoten met een tip besmet met de bacterie. De gestreepte plaat wordt geïncubeerd om enkele kolonies te groeien. Een van de afzonderlijke kolonies overgebracht naar een media kolf en opnieuw geïncubeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. De cellen en de precipitaten (A) De cellen in het kweekmedium opgesloten in een centrifugebuis leiden tot waarneembare chemische neerslag wissen (na 5-7 dagen). Die welke bezinkt op de bodem en is zichtbaar voor het blote oog. (B) bacteriepopulatie geïmmobiliseerd op een oppervlak gezien onder fasecontrast. Individuele staafvormige cellen (bacillen, gelabeld Sp) kan duidelijk worden gezien (enkele daarvan benadrukt door pijlen). (C) SEM beeld van de witte neerslag toont beide cellen (Sp) en kristallen (Cc). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. The Crystals en hun karakterisering. (A) Scanning elektronenmicroscoop beeld van de gedroogde neerslag. Individuele kristallen en bijbehorende splitsing lijnen duidelijk zichtbaar. (B) X-ray foto-elektron spectroscopie (XPS) grafiek van de chemische neerslag; massaspectrometrie pieken die overeenkomen met carbonaat functionele groep versterkt de mogelijkheid van het bestaan van calciet. Klik hier om view een grotere versie van deze figuur.
Figuur 4. Een Semi-kwantitatieve Experimenteer met Sponge bars waar als Prototype Porous Media. (A) en (B) zijn verse, droge monsters niet gedoopt. (C) en (D) zijn natte monsters gedrenkt in een oplossing van medium en cellen; ze vertonen een aanzienlijke toename materiaalweerstand door poriën verstoppen gevolg van calciet neerslag zoals ze van lagere samendrukking gezien onder invloed van een constant gewicht. Onbehandelde monsters nature poreus en lijden drastische reductie in volume wanneer onderworpen aan een 1 kg gewicht. De poriën knijp de lucht en contract, wat leidt tot een algehele vermindering in omvang. Anderzijds heeft het behandelde monster kunstmatig kreeg een aanzienlijke hoeveelheid stijfheid krachtens porie verstopping. Het toont een duidelijke verbetering in de kracht als het comfortabel ondersteunt dezelfde belasting zonder enige compressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische Stappen: Dit manuscript beschrijft in detail de protocollen voor het kweken van een levensvatbare steekproef van S. pasteurii. Zodra de kweek werd klaargemaakt, moet geschikt worden verrijkt. Dit is een belangrijke stap essentieel voor het succes van het experiment omdat niet de juiste chemische omgeving bieden leidt hetzij een zeer lange tijdschalen van precipitatie of een volledig ontbreken daarvan. S. pasteurii nogal gevoelig voor verschillende externe instanties en worden gekweekt met een hoge mate van zorgvuldigheid biochemische robuustheid en herhaalbaarheid. De omvang en de dosering van verrijking is nu bekend dat de chemische aard van precipitatie dicteren en derhalve nauwkeurig worden gecontroleerd ook.
Wijzigingen / Problemen oplossen: Verschillende aspecten kunnen worden aangepast met weinig variatie in de eindresultaten. Het kiemgetal behoeft niet te worden uitgevoerd volgens de hierboven (seriële verdunning per e beschreven technieke Miles Misra Method). Hier is de seriële verdunning uitgevoerd op een agarplaat door het in zeven gebieden van akkoorden getrokken op het bodemoppervlak. Dit is niet verplicht. Het is ook een gangbare praktijk om een hele agar plaat te gebruiken voor een bepaalde verdunning van het voorbereiden van een spread plaat. Seriële verdunning wordt uitgevoerd op een reeks opeenvolgende platen uitgespreid en een met een telbaar aantal afzonderlijke kolonies (20-200) is gekozen voor de uiteindelijke berekening. Elk van de andere celtelling technieken kunnen hier ook worden toegepast. Microscopie kan heel goed worden uitgevoerd met eenvoudige dekglaasjes of dia's. Een kamer unit is helemaal niet verplicht.
Soms kunnen de bacteriën niet aan neerslagen. Het is nuttig om een kleine hoeveelheid van de bevroren kweek over in een vloeibaar medium als eerste. Strepen kan worden uitgevoerd nadat groei is opgetreden in de vloeistof als eerste.
Beperkingen Dit is een trage techniek met een number trappen, een die leidt naar de andere. Er zijn aanzienlijke kans op besmetting, kruisbesmetting en andere culturele gebreken bij alle stappen. Intense zorg moet te allen tijde worden gehandhaafd. Rond 180 mg neerslag wordt gevormd per ml kweekoplossing.
Betekenis: De huidige protocol beschrijft in detail alle stappen die nodig zijn om ervoor te zorgen dat een cultuur van de bacterie S. pasteurii getrouw precipiteert calciet onder invloed van uitwendig toegevoegde verrijkingen. Hoewel de kweek van de bacterie zelf is een gevestigde protocol, het gehele proces van verrijking en kwantificering niet. Dit probleem is hier aan bod.
Toekomstige toepassingen: Het is mogelijk om op geschikte wijze moduleren deze bacterie neerslaat op verschillende manieren die op hun beurt kunnen worden ontworpen om verschillende toepassingen afhankelijk van de aard van precipitaten. Eerder werd vermeld datEr bestaan meerdere onbekenden met betrekking tot MICP waarbij S. pasteurii. Sommige van deze onbekenden omvatten rol van aggregatieve dynamiek van S. pasteurii in de MICP proces, de rol van de microschaal milieu 26,27 zoals effect van poreuze media en vloeistofstroom. Een gestandaardiseerd protocol kan worden ontwikkeld die snel neerslaan met een duidelijke kans voor het uitvoeren van de juiste multi-mode zorgt voor microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petridish | Fisher Scientific | FB0875712 | Petridishes being used as Agar plate |
| Pyrex Flasks | Fisher Scientific | S63268 | Corning Erlenmeyer |
| Tris-Base | Promega | H5133 | being used to make Tris-Buffer |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture |
| Agar Powder | Sigma-Aldrich | A1296 | microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder |
| Ammonium Sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | for Molecular Biology |
| Yeast extract powder | Sigma-Aldrich | 51475 | |
| Measuring Cylinder | Cole-Parmer | CP08559GC | Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk |
| Analytical Balance | OHAUS | AX124E | being used to measure weight of reagents |
| Autoclave | Brinkmann | 58619000 | |
| Autoclave Tape | VWR | 52428864 | |
| Aluminum Foil | Sigma-Aldrich | Z185140 | being used to seal the flask before placing it in Autoclave |
| Bacterial Stock | Cedarlane | 11859 | -80 °C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No. |
| Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume | Biohit | 725010 | Marketed by VWR under catalog number 14005976 |
| Micropipette Tip | Fisher Scientific | 212772B | Used for scratching Agar plates |
| Incubator | Binder | 80079098 | Microbiology Incubator,BF Series |
| Shaking Incubator | VWR | 14004300 | VWR Signature Benchtop Shaking Incubators |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P7059 | |
| BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device | BD Biosciences | 357590 | Marketed by VWR under catalog number 53106220 |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Being used to seal Agar plates |
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | Enrichment for nutrient medium |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | Enrichment for nutrient medium |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | Enrichment for nutrient medium |
References
- Gibson, T. An investigation of the Bacillus pasteurii group. Journal of Bacteriology. 28, 491-502 (1934).
- Greenfield, L. J. Metabolism and concentration of calcium and magnesium and precipitation of calcium carbonate by a marine bacterium. Annals of the New York Academy of Sciences. 109, 23-45 (1963).
- Phillips, A. J. Engineered applications of ureolytic biomineralization: a review. Biofouling. 29, 715-733 (2013).
- Dhami, N. K., et al. Biomineralization of calcium carbonates and their engineered applications: a review. Frontiers in microbiology. 4, 314 (2013).
- Cuthbert, M. O., et al. Controls on the rate of ureolysis and the morphology of carbonate precipitated by S. Pasteurii biofilms and limits due to bacterial encapsulation. Ecological Engineering. 41, 32-40 (2012).
- Okwadha, G. D., et al. Optimum conditions for microbial carbonate precipitation. Chemosphere. 81, 1143-1148 (2010).
- Stocks-Fischer, S., et al. Microbiological precipitation of CaCO3. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1563-1571 (1999).
- Lauchnor, E. G., et al. Bacterially induced calcium carbonate precipitation and strontium coprecipitation in a porous media flow system. Environmental science & technology. 47, 1557-1564 (2013).
- Al Qabany, A., et al. Factors Affecting Efficiency of Microbially Induced Calcite Precipitation. Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering. 138, 992-1001 (2012).
- Morita, R. Y. Calcite precipitation by marine bacteria. Geomicrobiology Journal. 2, 63-82 (2009).
- Chafetz, H. S. Marine peloids: A product of bacterially induced carbonate precipitation. Journal of Sedimentary Petrology. 56, 812-817 (1986).
- Biomason.com. , Available from: http://www.biomason.com (2015).
- Whiffin, V. S. Microbial CaCO3 precipitation for the production of biocement. , Murdoch University. PhD thesis (2004).
- Paassen, L. A., et al. Scale up of BioGrout: a biological ground reinforcement method. Proceedings of the 17th International Conference on Soil Mechanics and Geotechnical Engineering. , 2328-2333 (2009).
- Cunningham, A. B., et al. Microbially enhanced geologic containment of sequestered supercritical CO2. Energy Procedia. 1, 3245-3252 (2009).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Cunningham, A. B., et al. Reducing the risk of well bore leakage of CO2 using engineered biomineralization barriers. Energy Procedia. 4, 5178-5185 (2011).
- Jonkers, H. M., et al. Application of bacteria as self-healing agent for the development of sustainable concrete. Ecological Engineering. 36, 230-235 (2010).
- Tobler, D. J., et al. Transport of Sporosarcina pasteurii in sandstone and its significance for subsurface engineering technologies. Applied Geochemistry. 42, 38-44 (2014).
- Mortensen, B. M., et al. Effects of environmental factors on microbial induced calcium carbonate precipitation. Journal of applied microbiology. 111, 338-349 (2011).
- Phillips, A. J., et al. Potential CO2 leakage reduction through biofilm-induced calcium carbonate precipitation. Environmental science & technology. 47, 142-149 (2013).
- Robbins, R. Scanning Electron Microscope Operation. , Available from: http://www.utdallas.edu/~rar011300/SEM/Scanning%20Electron%20Microscope%20Operation.pdf (2010).
- vander Heide, P. X-ray Photoelectron Spectroscopy: An introduction to Principles and Practices. , John Wiley & Sons. (2011).
- Wiley, W. R., et al. Requirement of an alkaline pH and ammonia for substrate oxidation by Bacillus pasteurii. Journal of Bacteriology. 84, (1962).
- Tagliaferri, F., et al. Observing strain localisation processes in bio-cemented sand using x-ray imaging. Granular Matter. 13, 247-250 (2011).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluidics and Nanofluidics. 14, 895-902 (2012).
- Valiei, A., et al. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a chip. 12, 5133-5137 (2012).
- LIVE/DEAD Bacterial Viability kit, Two-color bacterial viability assay. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf, https://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/protocols/live-dead-baclight-bacterial-viability-protocol.html (2004).
