Abstract
La bactérie particulière sous enquête ici (S. pasteurii) est unique dans sa capacité, dans les bonnes conditions, pour induire l'hydrolyse de l' urée (uréolyse) dans des environnements naturels grâce à la sécrétion d'une enzyme uréase. Ce processus de uréolyse, à travers une série de réactions chimiques conduit à la formation de précipités de carbonate de calcium. Ceci est connu comme microbiologiquement Induced Précipitation de calcite (MICP). Les protocoles de culture appropriées pour MICP sont détaillées ici. Enfin, des expériences de visualisation sous différents modes de microscopie ont été réalisés pour comprendre les divers aspects du processus de précipitation. Des techniques comme la microscopie optique, microscopie électronique à balayage (MEB) et X-Ray Photo-électronique Spectroscopy (XPS) ont été utilisées pour caractériser chimiquement le produit final. En outre, la capacité de ces précipités à obstruer les pores à l'intérieur d'un milieu poreux naturel a été démontrée par une expérience qualitative où l'épongebarres ont été utilisés pour simuler un pore-réseau avec une gamme d'échelles de longueur. Une barre d'éponge trempée dans le milieu de culture contenant les cellules bactériennes durcit en raison de l'obstruction des pores résultant du procédé continu de précipitation chimique. Cette barre d'éponge durcie présente une résistance supérieure par rapport à une barre d'éponge de commande qui devient comprimé et pressé sous l'action d'une charge externe appliquée, tandis que la barre durcie est capable de supporter le même poids avec peu de déformation.
Introduction
Sporosarcina pasteurii est une bactérie capable de survivre dans des environnements fortement alcalins (pH ~ 10) 1 gram-positif et est l' une des espèces bactériennes qui peuvent devenir un agent causal d'un phénomène appelé microbiologiquement Induced Précipitation de calcite (MICP) 2-4. MICP est un procédé dans lequel la précipitation du carbonate de calcium est induite par certains microbes dans des conditions environnementales appropriées. S. pasteurii a pris une importance au cours des dernières années en raison de son identification comme un agent possible pour induire des volumes importants de MICP sous certaines conditions. Cette possibilité résulte du fait que S. pasteurii a la capacité unique de sécréter de grandes quantités de l'enzyme uréase. Cette enzyme agit comme un catalyseur, favorisant une lyse accélérée de l'urée (composé biochimique d'origine naturelle avec une alimentation répandue et abondante) en présence de molécules d'eau. À travers une cascade de réactions, ce procédé ultimely conduit à la génération d'ions carbonate chargés négativement. Ces ions, à leur tour, réagissent avec les ions métalliques positifs tels que le calcium pour former finalement des précipités de carbonate de calcium (calcite); d' où l'étiquette MICP 5-9.
Le processus de MICP a été connu et étudié depuis plusieurs décennies 10,11. Au cours des dernières années, MICP a été étudié pour une large gamme d'applications environnementales , y compris bottom-up construction verte 12, d'amélioration des structures à grande échelle 13,14 et la séquestration du carbone et le stockage 15,16 ingénierie et.
Par exemple, Cunnigham 17 et. al conçu un réacteur à écoulement à température modérée à haute pression contenant un noyau de grès Berea. Le réacteur a été inoculé avec la bactérie S. fridgidimarina et dans des conditions d'injection de dioxyde de carbone supercritique à haute pression, une accumulation massive de la biomasse à l' intérieur du volume de poresumes a été observée, ce qui conduit à une réduction de plus de 95% de la perméabilité. Jonkers et Schlangen 18 ont étudié l'effet de certaines souches particulières de bactéries sur le processus d'auto-guérison dans le béton. eau externe transporté dans le réseau de pores pénétrant par les pores de surface est prévu pour activer les bactéries dormantes qui à son tour aider la résistance structurelle via MICP. Tobler 19 et al. ont comparé l'activité uréolytique de S. pasteurii avec une eau souterraine uréolytique microcosme indigène dans des conditions favorisant MCIP à grande échelle et a constaté que S. pasteurii a une capacité cohérente pour améliorer la précipitation de calcite même lorsque les communautés autochtones manquaient activité uréase préalable. Mortensen 20 et.al ont étudié les effets de facteurs externes tels que le type de sol, la concentration de chlorure d'ammonium, la salinité, la concentration en oxygène et la lyse des cellules sur MICP. Leur démonstration que le processus de traitement biologique est très robuste avec respect à une grande variation dans l'espace des paramètres corrobore l'aptitude de ce processus pour diverses applications d'assainissement à grande échelle fournis un processus d'enrichissement propre à renforcer les bactéries est entrepris. Phillips 21 et. al conçu des expériences pour étudier les changements dans la perméabilité et la résistance d'une colonne de sable et d' un noyau de grès après l'injection de S. cultures pasteurii. Ils ont constaté que, bien que la perméabilité a diminué de 2 - 4 fois tandis que la résistance à la rupture a augmenté trois fois.
S. pasteurii et son rôle dans MICP sont des sujets de recherche active et plusieurs questions relatives au mécanisme de précipitation chimique ne sont pas encore pleinement compris. À la lumière de cela, il est très important d'avoir un ensemble de protocoles normalisés cohérents de culture avec précision un stock convenablement enrichi de S. pasteurii pour réaliser MICP. Ici, nous présentons un protocole rigoureux qui assurera la répétabilité et la reproductibilité. Cette manuscript décrit les protocoles détaillés pour la culture de S. pasteurii et d' enrichir de manière appropriée le milieu de culture pour induire la précipitation. Le processus est étudié grâce à diverses techniques microscopiques comme optique et microscopie électronique à balayage (MEB) et X-Ray Photo-électronique Spectroscopy (XPS). L'accent du manuscrit est sur le processus de MICP. Procédures comme SEM et SIMS, étant des protocoles standards bien établis, ne sont pas décrits séparément.
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Protocol
REMARQUE: Effectuez les protocoles expérimentaux dans l'ordre décrit ci-dessous. Le protocole de culture bactérienne est examinée à la section 1 (voir également la figure 1). La section 2 décrit le protocole d'enrichissement du milieu de culture en utilisant des additifs externes. La section 3 décrit les protocoles pour la microscopie multi-mode. Poids de tous les composants individuels peuvent être mesurées en utilisant une balance analytique. Le volume de chaque solution peut être mesurée au moyen d'un cylindre volumétrique.
NOTE: Les protocoles de biosécurité appropriées doivent être suivies pour les sections 1 - 2. Consulter le bureau de la sécurité des établissements pour les détails.
1. Culture bactérienne
- Les bactéries de la culture - Agar Plate Medium Préparation
- Assembler l'équipement et des ingrédients tels que des boîtes de Pétri, flacon, Tris-base, HCl, de l'agar, l'eau Millipore, pH-mètre etc.Sterilize tous les conteneurs par autoclavage à 121 ° C avant utilisation.
- Préparer 1 L de 0,13 solution aqueuse M de Tris-tampon en mélangeant 15,75 g de Tris-base avec 1 L d'eau Millipore. Pour abaisser le niveau de la solution initiale (pH 10,4) pH ajouter 2,800 ul de HCl (50%). Vérifiez en permanence à l'aide d'un pH-mètre pour régler pH = 9.
- Diviser la solution tampon 1 L en deux parties, comme suit:
- Prendre 800 ml de cette solution. Divisez également en deux parties de 400 ml chacun. Dissoudre 8 g de (NH 4) 2 SO 4 à une solution, 16 g d' extrait de levure à l'autre solution.
- Prenez le reste (200 ml de) solution et de le diviser à nouveau en deux parties de 100 ml chacun. Mélanger 2 g de (NH 4) 2 SO 4 à un. Ajouter 4 g d'extrait de levure et 4 g d'agar à l'autre.
- Autoclave les 4 solutions séparément après envelopper les flacons respectifs Al feuille et coller des bandes autoclave.
NOTE: Si une unité de paillasse en autoclave est utilisé, le volume doit être réglé à 500 ml (température et pression automattiquement spécifié en fonction du volume). - Après les avoir sortis de l'autoclave, définissez les deux 400 solutions ml de côté pour l'étape 1.3.1 (ci-dessous). Mélanger les deux solutions de 100 ml d'avoir une solution 200 ml. Verser le mélange dans 10 - 12 boîtes de Pétri.
- Les bactéries de la culture - Plate Agar Préparation de l' échantillon
- Retirer le stock bactérien du congélateur (-80 ° C) et laisser décongeler. Après décongélation correctement, placez le stock bactérienne et la plaque de gélose dans une hotte de biosécurité.
- Sélectionnez la micropipette de plus petite dimension disponible (0,5 à 10 pi est un bon choix) pour infester la pointe avec le stock pasteurii Sporosarcina. Streak une plaque de gélose à la pointe de la micropipette. Placer la plaque de gélose striée l'intérieur d'un incubateur non-agitation à 31 ° C pendant 48 heures.
- Après 48 heures, retirer la plaque de l'incubateur et un examen visuel de l'existence de colonies isolées. S'il n'y a pas de colonies uniques, puis le placer dans til incubateur pendant 24 h.
- Répétez le processus jusqu'à ce que des colonies isolées sont détectées. Ne pas dépasser 7 jours de procès.
NOTE: Si des colonies isolées ne semblent pas même après une semaine, puis il est conclu que les étapes ne sont pas suivies correctement et l'ensemble du processus doit être répété à l'étape 1.
- Les bactéries de la culture - Préparation de l' échantillon final
- Mélanger les deux solutions (400 ml de tampon Tris + (NH 4) 2 SO 4 et du tampon Tris + extrait de levure (1.5.1) ensemble pour obtenir une solution à 800 ml. Transférer 125 ml de cette solution dans un flacon.
- Procéder à un examen visuel de la surface de la plaque de gélose pour identifier des régions à forte concentration en colonies uniques. pousser doucement et de briser l'une des colonies avec une pointe de micropipette.
- Trempez la même pointe de micropipette dans le flacon de 125 mL et mélanger soigneusement pour veiller à ce que nombre suffisant de cellules pour la multiplication robuste se transférer. Placer la fiole dans un incubateur à agitation par secousses à 150 tpm, 30 ° C pendant 2 - 3 jours. Après 2 - 3 jours, enlever le ballon de l'incubateur.
- Les bactéries de la culture - Cell Count final
- Effectuer une dilution en série de la solution de culture non dilué à l' aide de PBS pour obtenir une dilution d'au moins dix millions (10 -7) afin d' assurer des colonies isolées dénombrables apparaissent. Dessinez sept lignes parallèles équidistantes sur l'une des plaques d'agar-.
- Pour ce faire, en traçant des lignes audacieuses sur la surface inférieure de la boîte de Pétri, assez important pour être visible du haut. Déposez 3 petites gouttes de solution non diluée dans un seul segment. Ajouter 1 ml de solution non diluée à 9 ml de tampon phosphate salin (PBS) pour obtenir une dilution de 1:10.
- Prenez une petite aliquote (~ 0,1 ml) de cette nouvelle solution diluée avec une pipette et déposer 3 plus petites gouttes sur le segment suivant. Transférer la solution fraîchement diluée dans un nouveau flacon puis dilué dix fois (10x) paren ajoutant du PBS. Cela réduit la dilution à 10 ~ 2 ou 1: 100.
- Utilisez cette solution 1: 100 dans le segment suivant. Répéter ce qu'il traite avec de petits volumes des solutions fraîchement diluées en les transférant successivement les nouveaux flacons en continu et en diluant dix fois (10x) en tandem avec du PBS pour obtenir des échantillons de plus en plus dilués de 10 -3 ou 1: 1000 sur toute la jusqu'à 10 -7 ou 01h10 millions dans le dernier segment.
- Effectuer Colony-Forming Unit count (CFU) de la plaque pour compter le nombre de cellules présentes dans la plaque de gélose après incubation de la plaque pendant 1 - 2 jours à 31 ° C. Ceci donne une mesure quantitative du nombre de bactéries dans l'échantillon non dilué.
NOTE: La valeur CFU est mesurée en fonction de la capacité du système pour donner naissance à des colonies dans les conditions spécifiques de milieu nutritif, la température et le temps en supposant que chaque colonie est séparée et fondée par une seule cellule microbienne viable. - Jointles boîtes de Pétri avec auto-obturant le film et stocker les autres items dans un réfrigérateur pour une utilisation future.
- Effectuer une dilution en série de la solution de culture non dilué à l' aide de PBS pour obtenir une dilution d'au moins dix millions (10 -7) afin d' assurer des colonies isolées dénombrables apparaissent. Dessinez sept lignes parallèles équidistantes sur l'une des plaques d'agar-.
2. Protocole pour l'enrichissement des éléments nutritifs pour accélérer des précipitations
- Transfert 9 ml de liquide de culture préparé (cellules + milieu) dans plusieurs tubes de centrifugeuse stériles, chacun de 10 ml de volume.
- Préparer une solution mère de 100 ml de l'enrichissement externe constitué de quatre composants dans les concentrations suivantes dans un milieu frais: Urée: 2 g / L, du chlorure d'ammonium: 1 g / L, du bicarbonate de sodium: 212 mg / L, du chlorure de calcium: 280 mg / L. Mesurer soigneusement tous les ingrédients en utilisant une balance analytique et mélanger tous, mais l'urée avec du milieu frais dans un bécher et placer dans l'autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min).
- Après autoclave, mélanger la quantité requise d'urée (2 mg) avec 1 ml de milieu frais et passer à travers une seringue munie d'un filtre à seringue de 0,22 um pour terminer le processus d'enrichissement.
- Ajouter 1ml de ce milieu d'enrichissement avec des additifs pour les tubes de centrifugeuse stérilisées contenant 9 ml de liquide de culture préparé (cellules + milieu) (voir étape 2.1).
REMARQUE: Parmi tous ces composants, l'urée étant dégradable à température élevée, ne peut pas être stérilisé dans un autoclave. Par conséquent, après que les autres composants ont été passés à l'autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min), l'urée est ajoutée en dernier à travers un filtre à seringue de 0,22 um.
- Vortex chaque tube à fond en utilisant un vortex mécanique. Placez les liquides enrichis (cellules + moyennes Additifs +) dans un incubateur non-agitation à 30 ° C. Surveiller toutes les unités régulièrement pour l'initiation de précipitations. L'utilisation d'un microscope optique, commencez observations microscopiques fois l'apparition de précipitations est détectée à l'oeil nu. Ceci est habituellement entre 30 - 36 h après le début des expériences.
3. Protocole pour multimode Microscopie
- Transférer un petit volume (~ 1 ml) de liquide à un haut-magnification microscopie-chambré système coverglass pour effectuer les premières observations avec le mode de champ lumineux. Pour commencer, commencer à toutes les observations avec le plus faible grossissement (4X). qui fournit une large zone de couverture et de l'information donc mondiale sur la distribution des précipités.
- Sélectionnez des domaines particuliers avec des volumes importants de précipitations et de zoomer (20X, 40X, 60X) en augmentant progressivement le grossissement.
NOTE: Comme il est impossible de résoudre correctement les cellules de la substance extracellulaires polymériques (EPS) sous champ lumineux (en raison d'indices de réfraction très proche), passer en mode contraste de phase chaque fois que nécessaire. Dans ce mode, uniquement les contours des membranes cellulaires (soit une phase différente de celle de la cellule en vrac) sont visibles, ce qui permet une différenciation visuelle. - Enfin, tacher certaines chambres avec Live tache / Dead qui teint sélectivement les composants vivants en vert tandis que la coloration des composants morts en rouge. Reportez - vous à des protocoles standard 28 </ Sup>.
- Commutateur en mode fluorescent pour bien distinguer les zones rouges et vertes. Rouge (cube de filtre rouge avec Excitation longueur d'onde de 540-580 nm, un miroir dichroïque de 595 nm et Barrière filtre de 600-660 nm) et verte (GFP longue filtre passe-vert cube avec Excitation longueur d'onde de 440-480 nm, miroir dichroïque de 505 nm et filtre barrière de 510 cubes nm) de filtre sont utilisés pour faciliter des micrographies fluorescentes.
- Une fois que toutes les données multi-mode ont été recueillies, sélectionner les meilleures images et superposition manuellement (fond clair individuel, à contraste de phase et des images fluorescentes) pour obtenir le meilleur contraste et une clarté possible.
- Effectuer SEM sur les échantillons solides secs pour comprendre les structures cristallines. Ceci est une procédure bien établie et standard. 22 Effectuer XPS pour identifier les signatures chimiques des groupes fonctionnels (carbonates). Ceci est une procédure bien établie et standard ainsi. 23
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Representative Results
S. pasteurii étant un alcalophile 24 peuvent survivre à des conditions relativement sévères. Lorsque le protocole de culture mentionné ci - dessus est suivie, et S. pasteurii est cultivé à l' intérieur d' une chambre, les bactéries conduit à la précipitation du carbonate de calcium au cours du temps (figure 2A). La figure 2 (b) montre une image au microscope optique à contraste de phase de la population bactérienne dans le milieu de culture. Les cellules individuelles peuvent être clairement distingués, avec des formes semblables à des tiges caractéristiques de la classe bacillus de bactéries assez évidentes. Les petites flèches brunes ont été utilisées pour mettre en évidence spécifiquement deux cellules individuelles. La précipitation du carbonate de calcium , se produit sur une période de plusieurs jours. La figure 2A montre comment les précipités se déposent vers le bas au fond d'un tube de centrifugation. Cela peut être vivement vu à l'œil nu comme une poudre blanchâtre assis en dessous du milieu liquide avecun fort contraste de couleur, par opposition au liquide jaunâtre. Le liquide jaunâtre contient des bactéries en suspension dans leur milieu de culture. Les précipités blancs ont été collectés et séchés et ensuite imagé par MEB (figure 2C).
Sur la figure 3A, les lignes de clivage bien définies, une caractéristique de cristallinité, peut être facilement identifié. La figure 3B montre le graphique des XPS pour le même échantillon pour la caractérisation. Pics correspondant aux groupes carbonate pin-point l'existence de carbonate de calcium. Ainsi, la figure 3A et B ensemble de façon concluante prouver la génération de calcite que le produit chimique précipité.
Une expérience qualitative a été réalisée afin d'évaluer la capacité des MICP pour modifier les propriétés des milieux poreux. A cette fin, nous avons effectué une expérience impliquant des éponges qui sont attendus pour mimer une matière poreusemoyenne avec une gamme d'échelles de longueur des structures de pores, comme se trouve dans une structure naturelle typique. Une barre d'éponge (Mr. Clean, P & G) a été immergé dans une solution de S. pasteurii pendant une période de 7 jours, puis séchées. L'éponge après une longue exposition au processus de MICP durci et affiché une meilleure résistance à la compression. Ceci est représenté sur la figure 4 , l'éponge avant l' immersion (cas témoin), a montré une compression significative lorsqu'ils sont soumis à un poids de 1 kg (Figure 4A - B).. D'autre part, après avoir été soumise à une immersion dans l'S. Solution pasteurii, il a subi le colmatage des pores en raison de la précipitation de calcite résultant. Cela a conduit à une augmentation massive de la force résultant d'un pontage des espaces interstitiels et par la suite a permis à la barre pour supporter la charge de 1 kg sans permettre une compression significative (figure 4C - D).
Une idée semi-quantitativeen ce qui concerne le processus de durcissement peut être obtenu par des mesures de hauteur de déviation de la barre chargée. L'échantillon de l'éponge d'origine est un bar rectangulaire avec une hauteur de 4,5 cm. La déviation de l'échantillon de contrôle, très près du point d'application de la charge, est d'environ 1,6 cm. Dans le cas de l'échantillon traité, la déflexion se réduit à 0,6 cm. En outre la quantification rigoureuse du processus de durcissement est également possible. Par exemple, une explication mécanistique de ce processus en termes d'augmentation de la résistance au cisaillement, contrainte déviatorique de pointe et des angles de dilatance a été proposé par Tagliaferri 25 et. al grâce à l'imagerie par rayons X et de corrélation d'images numériques.
Figure 1. Le schéma du protocole de culture entier Représenté comme un Schéma Algorithmique. Pour commencer, Tris-tampon et solution de gélose est poured dans une boîte de Pétri. Une fois que la plaque de gélose est prêt, il est strié avec une pointe infestée par les bactéries. La plaque striée est incubé à cultiver des colonies isolées. L' une des colonies isolées est transférée dans un ballon de médias et incubés à nouveau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 2. Les cellules et les précipités (A) Les cellules dans le milieu de culture confiné à l' intérieur d' une tête de tube à centrifuger pour éliminer observable précipitation chimique (après 5 - 7 jours). Qui se dépose vers le bas au fond et est visible à l'oeil nu. (B) La population de bactéries immobilisées sur une surface vu sous contraste de phase. cellules en forme de tige individuels (bacilles, Sp marqué) peuvent être vus clairement (deux d'entre eux mis en évidence par des flèches). L' image (C) SEM du précipité blanc montrant les deux cellules (Sp) et des cristaux (Cc). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Les cristaux et leur caractérisation. Image de microscope (A) électronique à balayage du précipité séché. Les cristaux individuels et les lignes de clivage associées sont clairement visibles. (B) à rayons X photoélectronique Spectroscopy (XPS) graphique du précipité chimique; pics de spectrométrie de masse correspondant à carbonate groupe fonctionnel renforce la possibilité de l'existence de calcite. S'il vous plaît cliquez ici pour view une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Une expérience semi-quantitative avec Bars Sponge Servant comme Prototype Porous Media. (A) et (B) sont des échantillons frais secs non trempés. (C) et (D) sont des échantillons humides trempés dans une solution de milieu et de cellules; ils présentent une augmentation significative de la résistance des matériaux en raison de l'obstruction des pores résultant de la précipitation de calcite comme on le voit ici réduite à la compression sous l'action d'un poids constant. échantillons non traités sont naturellement poreux et souffrent réduction massive du volume lorsqu'il est soumis à un poids de 1 kg. Les pores presser sur l'air et le contrat, ce qui conduit à une réduction globale de la taille. D'autre part, l'échantillon traité a artificiellement acquis une quantité importante de la rigidité, en vertu de l'obstruction des pores. Il démontre une amélioration marquée de la résistance quand il soutient confortablement la même charge sans aucune compression. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Étapes critiques: Ce manuscrit décrit en détail les protocoles pour la culture d' un échantillon viable de S. pasteurii. Une fois que la culture a été prépara, il doit être convenablement enrichi. Ceci est une étape clé essentielle à la réussite de l'expérience , car un défaut de l'environnement chimique approprié conduit soit à des échelles de temps très longues de précipitations ou d' une absence totale de celui - ci. S. pasteurii est très sensible à plusieurs organismes externes et doit être mis en culture avec un haut degré de soin et de précision pour assurer la robustesse biochimique et la répétabilité. La mesure et le dosage de l'enrichissement est maintenant connue pour dicter la nature chimique de précipitation et, partant, doivent être contrôlées avec précision aussi bien.
Modifications / Dépannage: Plusieurs aspects peuvent être modifiés avec peu de variance des résultats finaux. Le nombre de plaque ne doit pas être effectuée par la technique décrite ci-dessus (Dilution série par ee Miles Misra Method). Ici, la dilution en série a été réalisée sur une plaque de gélose unique en le divisant en sept régions de cordes tracées sur sa surface inférieure. Ce ne soit pas obligatoire. Il est également une pratique courante d'utiliser toute une plaque de gélose pour une dilution notamment par la préparation d'une plaque de diffusion. La dilution en série est effectuée sur une série de plaques d'étalement successifs et celui avec un nombre dénombrable de colonies isolées (20 - 200) est choisi pour le calcul final. L'un quelconque des divers autres techniques de comptage des cellules peuvent être appliqués ici aussi. Microscopie peut ainsi être réalisée avec des lamelles simples ou diapositives. Une unité de chambre ne sont pas du tout obligatoire.
Parfois, les bactéries peuvent ne pas former des précipités. Il est utile de transférer une petite quantité de la culture congelée dans un premier milieu liquide. Strie peut être effectué après la croissance a eu lieu dans le premier liquide.
Limitations: Ceci est une technique lente avec un numbre d'étapes, l'une menant à un autre. Il y a de fortes chances de contamination, la contamination croisée et d'autres défauts culturels à toutes les étapes. Intense soins doit être maintenu en tout temps. Environ 180 mg de précipité est formé par ml de solution de culture.
Signification: Le présent protocole décrit en détail toutes les mesures nécessaires pour veiller à ce que la culture de la bactérie S. pasteurii précipite fidèlement calcite sous l'influence de enrichissements ajoutés extérieurement. Bien que la culture de cette bactérie elle-même est un protocole bien établi, l'ensemble du processus d'enrichissement et de quantification est pas. Cette question a été abordée ici.
Les applications futures: Il pourrait être possible de moduler de façon appropriée cette bactérie pour précipiter de différentes manières , qui à leur tour peuvent être conçus pour des applications diverses en fonction de la nature des précipités. Il a été mentionné précédemment queexiste plusieurs inconnues en ce qui concerne MICP impliquant S. pasteurii. Certaines de ces inconnues comprennent le rôle de la dynamique agrégatifs de S. pasteurii dans le processus de MICP, le rôle de l'environnement tels que les micro - 26,27 effet des milieux poreux et l' écoulement du fluide. Un protocole standardisé peut être développé qui assure la précipitation rapide avec une bonne occasion pour effectuer la microscopie appropriée multi-mode.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petridish | Fisher Scientific | FB0875712 | Petridishes being used as Agar plate |
| Pyrex Flasks | Fisher Scientific | S63268 | Corning Erlenmeyer |
| Tris-Base | Promega | H5133 | being used to make Tris-Buffer |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture |
| Agar Powder | Sigma-Aldrich | A1296 | microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder |
| Ammonium Sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | for Molecular Biology |
| Yeast extract powder | Sigma-Aldrich | 51475 | |
| Measuring Cylinder | Cole-Parmer | CP08559GC | Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk |
| Analytical Balance | OHAUS | AX124E | being used to measure weight of reagents |
| Autoclave | Brinkmann | 58619000 | |
| Autoclave Tape | VWR | 52428864 | |
| Aluminum Foil | Sigma-Aldrich | Z185140 | being used to seal the flask before placing it in Autoclave |
| Bacterial Stock | Cedarlane | 11859 | -80 °C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No. |
| Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume | Biohit | 725010 | Marketed by VWR under catalog number 14005976 |
| Micropipette Tip | Fisher Scientific | 212772B | Used for scratching Agar plates |
| Incubator | Binder | 80079098 | Microbiology Incubator,BF Series |
| Shaking Incubator | VWR | 14004300 | VWR Signature Benchtop Shaking Incubators |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P7059 | |
| BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device | BD Biosciences | 357590 | Marketed by VWR under catalog number 53106220 |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Being used to seal Agar plates |
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | Enrichment for nutrient medium |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | Enrichment for nutrient medium |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | Enrichment for nutrient medium |
References
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