Abstract
Den spesielle bakterien under etterforskning her (S. pasteurii) er unik i sin evne, under de rette forholdene, for å indusere hydrolyse av urea (ureolysis) i naturlig forekommende miljøer gjennom utskillelse av et enzym urease. Denne prosessen med ureolysis, gjennom en kjede av kjemiske reaksjoner, fører til dannelse av kalsiumkarbonat utfellinger. Dette er kjent som Mikrobiologisk Induced Kalsitt nedbør (MICP). De riktige kultur protokoller for MICP er beskrevet her. Til slutt ble visualiserings forsøk under forskjellige moduser av mikroskopi utført for å forstå forskjellige aspekter av utfellingsprosessen. Teknikker som optisk mikroskopi, ble Scanning elektronmikroskopi (SEM) og X-Ray foto-elektronspektroskopi (XPS) som anvendes for kjemisk å karakterisere sluttproduktet. Videre ble evnen til disse utfellinger for å tette porene i et naturlig porøst medium demonstrert gjennom en kvalitativ eksperiment hvor svampPlatene ble brukt til å etterligne en pore-nettverk med en rekke lengdeskala. En svamp bar dyppet i dyrkningsmedium inneholdende bakteriecellene stivner på grunn av tilstopping av porene som følge av den kontinuerlige prosessen med kjemisk utfelling. Dette herdet svamp bar viser overlegen styrke sammenlignet med en kontrollgruppe svamp bar som blir komprimert og presset under påvirkning av en påført ytre belastning, mens herdet baren er i stand til å støtte den samme vekten med lite deformasjon.
Introduction
Sporosarcina pasteurii er en gram-positive bakterien i stand til å overleve i svært alkaliske miljøer (pH ~ 10) 1 og er en av de bakteriearter som kan bli en utløsende agent for et fenomen som kalles Mikrobiologisk Induced Kalsitt nedbør (MICP) 2-4. MICP er en prosess hvori utfelling av kalsiumkarbonat induseres av visse mikroorganismer under egnede forhold i omgivelsene. S. pasteurii har antatt betydning i de siste årene på grunn av sin identifikasjon som et mulig middel for å fremkalle betydelige mengder MICP under visse betingelser. Denne mulighet stammer fra det faktum at S. pasteurii har den unike evnen til å skille ut store mengder av enzymet urease. Dette enzym virker som en katalysator, fremme en akselerert lysering av urea (et naturlig forekommende biokjemisk forbindelse med utbredt og rikelig tilførsel) i nærvær av vannmolekyler. Gjennom en kaskade av reaksjoner, er denne prosessen endeligely fører til generering av negativt ladede karbonationer. Disse ioner, i sin tur reagerer med positive metallioner som kalsium til slutt danne utfellinger av kalsiumkarbonat (kalsitt); derfor etiketten MICP 5-9.
Prosessen med MICP har vært kjent og studert i flere tiår 10,11. I løpet av de siste årene, har MICP blitt undersøkt for et bredt spekter av engineering og miljøprodukter inkludert bottom-up grønn konstruksjon 12, forbedring av store strukturer 13,14 og karbonbinding og lagring 15,16.
For eksempel Cunnigham 17 et. al utformet et høyt trykk moderat temperatur strømningsreaktor inneholdende en Berea sandsteinskjerne. Reaktoren ble inokulert med bakterier S. fridgidimarina og under forhold med høyt trykk kritisk karbondioksyd injeksjon, en massiv akkumulering av biomasse på innsiden av pore volvolumer ble observert, noe som førte til mer enn 95% reduksjon i permeabilitet. Jonkers og Schlangen 18 studert effekten av visse spesielle stammer av bakterier på selvhelbredende prosess i betong. Eksternt vann transportert inn i pore-nettverk som trenger inn gjennom de overflateporer er forventet å aktivere den sovende bakterier som i sin tur bidrar til strukturell styrke via MICP. Tobler 19 et al. har sammenlignet ureolytic aktiviteten av S. pasteurii med en innfødt grunnvann ureolytic mikrokosmos under betingelser som favoriserer store MCIP og fant at S. pasteurii har en konsekvent evne til å forbedre kalsitt nedbør selv når urfolkssamfunn manglet før urease aktivitet. Mortensen 20 et.al har studert effekten av ytre faktorer som jordtype, konsentrasjon av ammoniumklorid, saltholdighet, oksygenkonsentrasjon og lysis av celler på MICP. Deres demonstrasjon på at den biologiske renseprosessen er meget robust med respect til en stor variasjon i parameter plass underbygger trenings av denne prosessen for en rekke store utbedring programmer som tilbys en skikkelig berikelse prosess for å forsterke bakteriene er foretatt. Phillips 21 et. al utformet eksperimenter for å studere forandringer i permeabilitet og styrke av en sand-kolonne og en sandsteinkjerne etter å ha blitt injisert med S. pasteurii kulturer. De fant at mens permeabiliteten redusert 2 - 4 ganger så lenge bruddstyrken økes tre ganger.
S. pasteurii og dens rolle i MICP er tema for aktiv forskning og flere spørsmål knyttet til mekanismen for kjemisk felling er fortsatt ikke fullt ut forstått. I lys av dette, er det svært viktig å ha et sett av konsistente standardiserte protokoller for nøyaktig kultur en passende beriket lager av S. pasteurii å oppnå MICP. Her skisserer vi en streng protokoll som vil sikre repeterbarhet og reproduserbarhet. dette manuscript beskriver detaljerte protokoller for dyrking S. pasteurii og hensiktsmessig å anrike kulturmediet for å indusere utfelling. Prosessen blir undersøkt ved forskjellige mikroskopiske teknikker så som optiske og Scanning elektronmikroskopi (SEM) og X-Ray foto-elektronspektroskopi (XPS). Fokuset i manuskript er på prosessen med MICP. Prosedyrer som SEM og SIMS, blir veletablerte standardprotokoller, ikke er særskilt beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Utfør de eksperimentelle protokollene i den rekkefølgen som er beskrevet nedenfor. Bakteriekultur protokollen er omtalt i kapittel 1 (se også figur 1). Avsnitt 2 beskriver protokollen for berikende kulturmediet ved hjelp av eksterne tilsetningsstoffer. § 3 beskriver protokollene for multi-mode mikroskopi. Vekter av alle de individuelle komponentene kan måles ved anvendelse av en analysevekt. Volum av hver løsning kan måles ved hjelp av en volumetrisk sylinder.
MERK: Riktig biosikkerhet protokoller må følges for §§ 1 - 2. Consult den institusjonelle sikkerhet kontor for mer informasjon.
1. bakteriekultur
- Kultur Bakterier - agarskål Medium Forberedelse
- Montere utstyr og ingredienser som petriskåler, kolbe, Tris-base, HCl, agar, Millipore vann, pH-meter etc.Sterilize alle beholdere etter autoklavering ved 121 ° C før bruk.
- Forbered en L på 0,13 M vandig oppløsning av Tris-buffer ved å blande 15,75 g Tris-base med 1 liter vann Millipore. For å senke pH-verdien av den opprinnelige oppløsning (pH 10,4) tilsett 2,800 mL av HCI (50% konsentrasjon). Sjekk kontinuerlig ved hjelp av et pH-meter for å sette pH = 9.
- Dele en L-bufferoppløsning i to deler som følger:
- Ta 800 ml av denne oppløsning. Dele det likt i to deler av 400 ml hver. Oppløs 8 g (NH 4) 2SO 4 til en løsning, og 16 g gjærekstrakt til den andre oppløsningen.
- Ta de gjenværende (200 ml) oppløsning og dele det igjen opp i to deler av 100 ml hver gang. Bland 2 g (NH 4) 2 SO 4 til en. Tilsett 4 g gjærekstrakt og 4 g agar til den andre.
- Autoklav de 4 løsninger separat etter innpakning de respektive kolber i Al-folie og stikker autoklav kassetter.
MERK: Hvis en benkeplate Bøk autoklav enheten brukes, volumet bør settes til 500 ml (temperatur og trykk automatmatisk er angitt som en funksjon av volum). - Etter å ha tatt dem ut fra autoklaven, satt de to 400 ml løsninger til side for trinn 1.3.1 (nedenfor). Bland de to 100 ml oppløsninger for å ha en 200 ml løsning. Hell blandingen i 10 - 12 petriskåler.
- Kultur Bakterier - Agar Plate Prøvepreparering
- Fjern bakteriell lager fra fryseren (-80 ° C) og la den tine. Etter opptining riktig, plasserer bakteriell lager og agar plate inne en biosikkerhet hette.
- Velg mikropipette av minste tilgjengelige dimensjon (0,5 til 10 mikroliter er et godt valg) for å hjemsøke spissen med Sporosarcina pasteurii lager. Streak en agar plate med mikropipette spissen. Plasser stripete agar plate inne i en ikke-risteinkubator ved 31 ° C i 48 timer.
- Etter 48 timer, fjerne platen fra inkubatoren og visuelt undersøke for eksistensen av enkeltkolonier. Hvis det ikke er noen enkeltkolonier, og sett den i than inkubator i ytterligere 24 timer.
- Gjenta prosessen til enkeltkolonier blir oppdaget. Ikke overskrid 7 dager etter rettssaken.
MERK: Hvis enkeltkolonier ikke vises selv etter en uke, så er det konkludert med at trinnene ikke har blitt fulgt skikkelig og hele prosessen må gjentas fra trinn 1.
- Kultur Bakterier - Sluttprøvepreparering
- Bland de to 400 ml oppløsninger (Tris-buffer + (NH4) 2 SO 4 og Tris-buffer + gjærekstrakt (1.5.1) sammen for å oppnå en 800 ml oppløsning. Overfør 125 ml av denne løsningen i en kolbe.
- Utføre en visuell undersøkelse av overflaten av agar-plate for å identifisere områder med høy konsentrasjon av enkeltkolonier. Skubber og bryte en av koloniene med en mikropipette tips.
- Dypp samme mikropipette spissen inn i det 125 ml kolbe og rør den grundig for å sikre at tilstrekkelig antall celler for robust multiplikasjon blir overført. Plassere kolben i en risteinkubator ved 150 rpm, 30 ° C i 2 - 3 dager. Etter 2 - 3 dager, fjern kolben fra inkubatoren.
- Kultur Bakterier - Sluttcelletall
- Utføre seriell fortynning av den ikke-fortynnede kulturen løsning med PBS for å oppnå en fortynning på minst ti millioner (10 -7) for å sikre tellbar enkle kolonier til syne. Tegn syv parallelle like langt linjer på en av agar-platene.
- Dette gjøres ved å trekke tykke streker på bunnoverflaten av petriskålen, fremtredende nok til å være synlig fra toppen. Slipp 3 små dråper av ikke-fortynnet løsning i ett segment. Tilsett 1 ml av ikke-fortynnede løsningen til 9 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS) for å oppnå en fortynning på 1:10.
- Ta en liten alikvot (~ 0,1 ml) av denne nylig fortynnet oppløsning med en pipette og slippe 3 flere små dråper på den neste segment. Overfør nylig fortynnede løsning til en ny kolbe og fortynnes ytterligere ti ganger (10x) avtilsette PBS. Dette bringer ned fortynning til 10 -2 eller 1: 100.
- Bruk av denne 1: 100-oppløsning i det neste segment. Gjenta dette han behandler med små mengder ferskt fortynnede løsninger ved suksessivt å overføre dem til nye kolber og kontinuerlig fortynning ti ganger (10x) i tandem med PBS for å få mer og mer fortynnede prøver fra 10 -3 eller 1: 1000 hele veien ned til 10 eller -7 01:10 millioner i det siste segmentet.
- Utføre kolonidannende enhet (CFU) kimtall for å telle antall celler som er tilstede i agar plate etter inkubasjon av platen i 1 - 2 dager ved 31 ° C. Dette gir et kvantitativt mål på bakterietallet i den ufortynnede prøve.
MERK: CFU verdi måles basert på systemets evne til å gi opphav til kolonier under de spesifikke betingelser i næringsmedium, temperatur og tid forutsatt at hver koloni er atskilt og grunnlagt av en enkelt levedyktige mikrobielle celle. - Tetningpetriskåler med selvtettende film og lagre resterende elementer i kjøleskap for fremtidig bruk.
- Utføre seriell fortynning av den ikke-fortynnede kulturen løsning med PBS for å oppnå en fortynning på minst ti millioner (10 -7) for å sikre tellbar enkle kolonier til syne. Tegn syv parallelle like langt linjer på en av agar-platene.
2. Protokoll for berikelse av Nutrient å akselerere Nedbør
- Overføring 9 ml av den klare kulturvæske (celler + medium) inn i flere sterile sentrifugerør, hver på 10 ml volum.
- Fremstille en 100 ml stamløsning av den ytre anrikning bestående av fire bestanddeler i de følgende konsentrasjoner i friskt medium: Urea: 2 g / l, ammoniumklorid: 1 g / L natriumbikarbonat: 212 mg / l Kalsiumklorid: 280 mg / L. Nøye måle alle ingrediensene ved hjelp av en analysevekt, og blande det hele tatt, men urea med friskt medium i et begerglass og plasser i en autoklav (121 ° C, 15 psi, 15 min).
- Etter autoklav, blande den nødvendige mengde urinstoff (2 mg) med 1 ml friskt medium og passere gjennom en sprøyte med 0,22 um sprøytefilter for å fullføre prosessen med berikelse.
- Legg enml av denne anrikningsmedium med additiver, til det sterile sentrifugerør som inneholdt 9 ml av den klare kulturvæske (celler + medium) (se trinn 2.1).
MERK: Av alle disse komponentene, urea er nedbrytbare ved forhøyede temperaturer, ikke kan steriliseres i en autoklav. Derfor, etter at de andre komponenter er blitt autoklavert (121 ° C, 15 psi, 15 min), urea tilsettes sist gjennom et 0,22 um sprøytefilter.
- Vortex hvert rør grundig med en mekanisk vortexer. Plasser beriket væsker (celler + middels + tilsetningsstoffer) i en ikke-risteinkubator ved 30 ° C. Overvåke alle enhetene regelmessig for initiering av nedbør. Ved hjelp av et lysmikroskop, begynne mikroskopiske observasjoner når innsettende utfelling detekteres med det blotte øye. Dette er vanligvis mellom 30 - 36 timer etter start av eksperimenter.
3. Protokoll for Multi-modus Mikros
- Overføre et lite volum (~ 1 ml) av fluid til en høy-magnification mikroskopi-kammer coverglass systemet til å utføre innledende observasjoner med lyse felt modus. Til å begynne med, begynner alle observasjoner med lavest forstørrelse (4X). som gir et bredt dekningsområde og dermed global informasjon om fordeling av bunnfall.
- Velg bestemte områder med betydelige mengder nedbør og zoome inn (20X, 40X, 60X) ved å gradvis øke forstørrelsen.
MERK: Siden det er umulig å riktig løse cellene fra det ekstracellulære Polymer Stoff (EPS) under lyse-feltet (på grunn av svært nære brytningsindekser), slå på fasekontrastmodus når det er nødvendig. I denne modus, kun konturene av cellemembranene (som en annen fase enn bulk celle) er synlig, og dermed muliggjør visuell differensiering. - Til slutt, beis noen kamre med Levende / Døde flekk som selektivt fargestoffer live komponenter som grønn mens fargelegger de døde komponentene i rødt. Se i standardprotokoller 28 </ Sup>.
- Slå på fluorescerende modus du skal skille mellom de røde og grønne områder. Rød (Red filter kube med Eksitasjon bølgelengde på 540-580 nm, dichroic speil av 595 nm og Barrier filter av 600-660 nm) og grønt (GFP Long-pass Grønn filter kube med Eksitasjon bølgelengde på 440-480 nm, dichroic speil 505 nm og Barrier filter på 510 nm) filter kuber brukes for å lette fluorescerende mikrografer.
- Når alle multi-mode data har blitt samlet inn, velge ut de beste bildene og manuelt overlegg (individuell lysfelt, fasekontrast og fluorescerende bilder) for å oppnå best mulig kontrast og klarhet.
- Utføre SEM på de tørkede faste stoffer for å forstå krystallstrukturer. Dette er et veletablert og standard prosedyre. 22 Utføre XPS for å identifisere kjemiske signaturer av funksjonelle grupper (karbonater). Dette er et veletablert og standard prosedyre i tillegg. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
S. pasteurii være en alkalifil 24 kan overleve relativt tøffe forhold. Når den ovennevnte kultur-protokollen blir fulgt, og S. pasteurii dyrkes inne i et kammer, bakterier fører til utfelling av kalsiumkarbonat over tid (figur 2A). Figur 2 (b) viser et fasekontrast optisk mikroskopisk bilde av bakteriecellepopulasjon i kulturmediet. Enkeltceller kan være tydelig atskilt, med stavlignende figurer karakteristiske av Bacillus klassen av bakterier ganske tydelig. Små brune piler har blitt brukt for å spesifikt fremheve to individuelle celler. Utfellingen av kalsiumkarbonat skjer over en periode på flere dager. Figur 2A viser hvordan bunnfallet slå seg ned på bunnen av et sentrifugerør. Dette kan levende ses med det blotte øye som et hvitaktig pulver som sitter under væskemedieten skarp kontrast i farger, i motsetning til den gulaktig væske. Den gulaktig væske inneholder bakterier suspendert i deres kulturmedium. De hvite bunnfall ble oppsamlet og tørket og senere avbildes ved hjelp av SEM (figur 2C).
I figur 3A, de veldefinerte cleavage linjer, et kjennetegn på krystalline lett kan identifiseres. Figur 3B viser XPS grafen for samme prøve for karakterisering. Topper tilsvarende karbonat-grupper pin-point eksistensen av kalsiumkarbonat. Således, figur 3A og B sammen endelig påvise genereringen av kalsitt som det utfelte stoffet.
En kvalitativ eksperiment ble utført for å vurdere evnen til MICP til å endre egenskapene for porøse media. For å oppnå dette, utførte vi et eksperiment med svamper som forventes å etterligne en porøsmedium med en rekke lengdeskala for de porestrukturer, som er funnet i et typisk naturlig struktur. En svamp bar (Mr. Clean, P & G) ble nedsenket i en løsning av S. pasteurii i en periode på 7 dager og deretter tørket. Svampen etter lang eksponering for MICP prosessen herdet og vises forbedret trykkfasthet. Dette er vist i figur 4 svamp, før nedsenking (kontroll tilfelle), viste en betydelig kompresjon når den utsettes for en 1 kg vekt (figur 4A - B).. På den annen side, etter å ha blitt utsatt for neddykking i S. pasteurii løsning, led pore clogging på grunn av den resulterende kalsitt nedbør. Dette førte til en massiv økning i styrke som følge av en bro av porerommene og deretter aktivert baren for å støtte en kg belastning uten at betydelig komprimering (Figur 4C - D).
En semikvantitativ ideom herding prosessen kan oppnås gjennom målinger av avbøyning høyde lastet bar. Den opprinnelige svamp Prøven er en rektangulær stang med en høyde på 4,5 cm. Avbøyningen av kontrollprøven, meget nær punktet for påføring av lasten, er omtrent 1,6 cm. I tilfelle av de behandlede prøven, reduserer nedbøyningen til 0,6 cm. Ytterligere streng kvantifisering av herdeprosessen er også mulig. For eksempel har en mekanistisk forklaring på denne prosessen i form av økning i skjærstyrke, peak deviatoric stress og dilatans vinkler blitt foreslått av Tagliaferri 25 et. al gjennom røntgen og digital bilde korrelasjon.
Figur 1. Oversikt over hele kulturen Protocol Representert som en algoritmisk Skjematisk. Til å begynne med, Tris-buffer og agar løsning er poured i en petriskål. Når agar plate er klar, er det smykket med et tips infisert med bakterier. Det stripede Platen inkuberes å vokse enkeltkolonier. En av de enkeltkolonier overføres til en medie kolbe og inkuberes igjen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Celler og utfellingene (A) Cellene i dyrkningsmediet innesperret inne i et sentrifugerør bly for å fjerne observerbare kjemisk utfelling (etter 5 - 7 dager). Som slår seg ned på bunnen og er synlig for det blotte øye. (B) Befolkning av bakterier immobilisert på en overflate sett under fase-kontrast. Enkeltstavformede celler (bacilli, merket Sp) kan ses klart (et par av dem markert med piler). (C) SEM bilde av det hvite bunnfallet viser både celler (Sp) og krystaller (CC). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Krystallene og deres karakterisering. (A) Scanning elektronmikroskopbilde av den tørkede bunnfall. Individuelle krystaller og tilknyttede cleavage linjer er godt synlig. (B) X-Ray foto-elektronspektroskopi (XPS) graf av det kjemiske bunnfall; massespektrometri topper tilsvarende karbonat funksjonell gruppe forsterke muligheten for eksistensen av kalsitt. Klikk her for å VIew en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Semi-kvantitativ Eksperimenter med Sponge barer som serverer som Prototype porøse medier. (A) og (B) er friske tørre prøver ikke dyppet. (C) og (D) er våte prøver dynket i en oppløsning av medium og celler; de oppviser en betydelig økning i material motstand på grunn av pore tilstopping som følge av kalsitt utfelling som sett her av redusert kompresjon under påvirkning av en konstant vekt. Ubehandlede prøver er naturlig porøse og lide massiv reduksjon i volum når det utsettes for en 1 kg vekt. Porene presse ut luften og kontrakt, hvilket fører til en samlet reduksjon i størrelse. På den annen side har den behandlede prøve kunstig fått en betydelig mengde av stivhet på grunn av pore tilstopping. Det viser en markant forbedring i styrke når det komfortabelt støtter samme belastning uten komprimering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn: Dette manuskriptet beskriver i detalj de protokoller for dyrking av en levedyktig utvalg av S. pasteurii. Etter at kulturen er blitt klargjort, må det være passende beriket. Dette er et viktig skritt avgjørende for å lykkes med forsøket fordi en unnlatelse av å gi riktig kjemisk miljø fører til enten svært lange tidsskalaer av nedbør eller en komplett mangel. S. pasteurii er ganske følsom for flere eksterne etater og må dyrkes med en høy grad av omsorg og presisjon for å sikre biokjemiske robusthet og repeterbarhet. Omfanget og dosering av anrikning er nå kjent for å diktere den kjemiske art av utfelling og følgelig må kontrolleres nøyaktig i tillegg.
Endringer / Feilsøking: Flere aspekter kan endres med litt variasjon i sluttresultatene. Kimtall behøver ikke å bli utført i henhold til teknikken som er beskrevet ovenfor (seriefortynning per the Miles Misra Method). Her har seriefortynning utført på en enkel agarplate ved å dele den inn i syv regioner av akkorder tegnet på sin bunnflate. Dette er ikke obligatorisk. Det er også vanlig praksis å benytte en hel agarplate for en bestemt fortynning ved å fremstille en spredning plate. Seriell fortynning utføres på en serie av suksessive spredt platene og en med et tellbart antall enkeltkolonier (20 - 200) er valgt for den endelige beregning. Hvilken som helst av de forskjellige andre celletellingsteknikker kan anvendes også her. Mikroskopi kan godt gjøres med enkle dekkglass eller lysbilder. Et kammer enhet er overhodet ikke obligatorisk.
Noen ganger, bakterier kan mislykkes i å danne utfellinger. Det er nyttig å overføre en liten mengde av det frosne kultur inn i et flytende medium først. Streker kan utføres etter at veksten har funnet sted i den flytende første.
Begrensninger: Dette er en langsom teknikk med en number av trinn, ett som fører til en annen. Det er betydelige sjanser for forurensning, kryssforurensning og andre kultur defekter på alle trinn. Intens forsiktighet må opprettholdes til enhver tid. Rundt 180 mg av bunnfallet dannet per ml kulturoppløsning.
Betydning: protokoll skisserer i detalj alle de nødvendige skritt for å sikre at en kultur av bakterien S. pasteurii trofast utfellinger kalsitt under påvirkning av eksternt lagt enrichments. Selv om kultur av denne bakterie i seg selv er en godt etablert protokoll, hele prosessen med anrikning og kvantifisering er ikke. Dette problemet er løst her.
Fremtidige anvendelser: Det kan være mulig å hensiktsmessig modulere denne bakterien å utfelles på forskjellige måter som i sin tur kan bli konstruert til forskjellige anvendelser, avhengig av arten av utfellinger. Det ble tidligere nevnt at derDet finnes flere ukjente med hensyn til MICP involverer S. pasteurii. Noen av disse ukjente omfatter rolle aggregative dynamikk S. pasteurii i MICP prosessen, rollen av mikromiljøet 26,27, slik som virkning av porøse media og fluidstrømmen. En standardisert protokoll kan utvikles som sikrer rask nedbør med en klar mulighet for å utføre riktig multi-modus mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petridish | Fisher Scientific | FB0875712 | Petridishes being used as Agar plate |
| Pyrex Flasks | Fisher Scientific | S63268 | Corning Erlenmeyer |
| Tris-Base | Promega | H5133 | being used to make Tris-Buffer |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture |
| Agar Powder | Sigma-Aldrich | A1296 | microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder |
| Ammonium Sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | for Molecular Biology |
| Yeast extract powder | Sigma-Aldrich | 51475 | |
| Measuring Cylinder | Cole-Parmer | CP08559GC | Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk |
| Analytical Balance | OHAUS | AX124E | being used to measure weight of reagents |
| Autoclave | Brinkmann | 58619000 | |
| Autoclave Tape | VWR | 52428864 | |
| Aluminum Foil | Sigma-Aldrich | Z185140 | being used to seal the flask before placing it in Autoclave |
| Bacterial Stock | Cedarlane | 11859 | -80 °C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No. |
| Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume | Biohit | 725010 | Marketed by VWR under catalog number 14005976 |
| Micropipette Tip | Fisher Scientific | 212772B | Used for scratching Agar plates |
| Incubator | Binder | 80079098 | Microbiology Incubator,BF Series |
| Shaking Incubator | VWR | 14004300 | VWR Signature Benchtop Shaking Incubators |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P7059 | |
| BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device | BD Biosciences | 357590 | Marketed by VWR under catalog number 53106220 |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Being used to seal Agar plates |
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | Enrichment for nutrient medium |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | Enrichment for nutrient medium |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | Enrichment for nutrient medium |
References
- Gibson, T. An investigation of the Bacillus pasteurii group. Journal of Bacteriology. 28, 491-502 (1934).
- Greenfield, L. J. Metabolism and concentration of calcium and magnesium and precipitation of calcium carbonate by a marine bacterium. Annals of the New York Academy of Sciences. 109, 23-45 (1963).
- Phillips, A. J. Engineered applications of ureolytic biomineralization: a review. Biofouling. 29, 715-733 (2013).
- Dhami, N. K., et al. Biomineralization of calcium carbonates and their engineered applications: a review. Frontiers in microbiology. 4, 314 (2013).
- Cuthbert, M. O., et al. Controls on the rate of ureolysis and the morphology of carbonate precipitated by S. Pasteurii biofilms and limits due to bacterial encapsulation. Ecological Engineering. 41, 32-40 (2012).
- Okwadha, G. D., et al. Optimum conditions for microbial carbonate precipitation. Chemosphere. 81, 1143-1148 (2010).
- Stocks-Fischer, S., et al. Microbiological precipitation of CaCO3. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1563-1571 (1999).
- Lauchnor, E. G., et al. Bacterially induced calcium carbonate precipitation and strontium coprecipitation in a porous media flow system. Environmental science & technology. 47, 1557-1564 (2013).
- Al Qabany, A., et al. Factors Affecting Efficiency of Microbially Induced Calcite Precipitation. Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering. 138, 992-1001 (2012).
- Morita, R. Y. Calcite precipitation by marine bacteria. Geomicrobiology Journal. 2, 63-82 (2009).
- Chafetz, H. S. Marine peloids: A product of bacterially induced carbonate precipitation. Journal of Sedimentary Petrology. 56, 812-817 (1986).
- Biomason.com. , Available from: http://www.biomason.com (2015).
- Whiffin, V. S. Microbial CaCO3 precipitation for the production of biocement. , Murdoch University. PhD thesis (2004).
- Paassen, L. A., et al. Scale up of BioGrout: a biological ground reinforcement method. Proceedings of the 17th International Conference on Soil Mechanics and Geotechnical Engineering. , 2328-2333 (2009).
- Cunningham, A. B., et al. Microbially enhanced geologic containment of sequestered supercritical CO2. Energy Procedia. 1, 3245-3252 (2009).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Cunningham, A. B., et al. Reducing the risk of well bore leakage of CO2 using engineered biomineralization barriers. Energy Procedia. 4, 5178-5185 (2011).
- Jonkers, H. M., et al. Application of bacteria as self-healing agent for the development of sustainable concrete. Ecological Engineering. 36, 230-235 (2010).
- Tobler, D. J., et al. Transport of Sporosarcina pasteurii in sandstone and its significance for subsurface engineering technologies. Applied Geochemistry. 42, 38-44 (2014).
- Mortensen, B. M., et al. Effects of environmental factors on microbial induced calcium carbonate precipitation. Journal of applied microbiology. 111, 338-349 (2011).
- Phillips, A. J., et al. Potential CO2 leakage reduction through biofilm-induced calcium carbonate precipitation. Environmental science & technology. 47, 142-149 (2013).
- Robbins, R. Scanning Electron Microscope Operation. , Available from: http://www.utdallas.edu/~rar011300/SEM/Scanning%20Electron%20Microscope%20Operation.pdf (2010).
- vander Heide, P. X-ray Photoelectron Spectroscopy: An introduction to Principles and Practices. , John Wiley & Sons. (2011).
- Wiley, W. R., et al. Requirement of an alkaline pH and ammonia for substrate oxidation by Bacillus pasteurii. Journal of Bacteriology. 84, (1962).
- Tagliaferri, F., et al. Observing strain localisation processes in bio-cemented sand using x-ray imaging. Granular Matter. 13, 247-250 (2011).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluidics and Nanofluidics. 14, 895-902 (2012).
- Valiei, A., et al. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a chip. 12, 5133-5137 (2012).
- LIVE/DEAD Bacterial Viability kit, Two-color bacterial viability assay. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf, https://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/protocols/live-dead-baclight-bacterial-viability-protocol.html (2004).
