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Bioengineering

Microbiologically प्रेरित केल्साइट वर्षा द्वारा मध्यस्थता Published: April 16, 2016 doi: 10.3791/53253
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Alberta, 2Department of Mechanical Engineering, York University, 3Department of Civil and Environmental Engineering, University of Alberta

Abstract

यहां जांच के तहत विशेष रूप से जीवाणु (एस pasteurii) स्वाभाविक रूप से एक एंजाइम urease के स्राव के माध्यम से वातावरण होने वाली यूरिया (ureolysis) की hydrolysis के लिए प्रेरित करने की क्षमता में अद्वितीय है, सही परिस्थितियों में। ureolysis की यह प्रक्रिया, रासायनिक प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से, कैल्शियम कार्बोनेट अवक्षेप के गठन की ओर जाता है। इस microbiologically प्रेरित केल्साइट वर्षा (MICP) के रूप में जाना जाता है। MICP के लिए उचित संस्कृति प्रोटोकॉल यहाँ विस्तृत रहे हैं। अंत में, माइक्रोस्कोपी के विभिन्न साधनों के तहत दृश्य प्रयोगों वर्षा की प्रक्रिया के विभिन्न पहलुओं को समझने के लिए प्रदर्शन किया गया। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तरह की तकनीक, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और एक्स-रे फोटो-इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी (XPS) रासायनिक अंत उत्पाद को चिह्नित करने के लिए कार्यरत थे। इसके अलावा, रोकना एक प्राकृतिक झरझरा मध्यम अंदर pores इन अवक्षेप की क्षमता एक गुणात्मक प्रयोग जहां स्पंज के माध्यम से प्रदर्शन किया गयासलाखों के तराजू लंबाई की एक सीमा के साथ एक ताकना नेटवर्क नकल करने के लिए इस्तेमाल किया गया। एक स्पंज बार संस्कृति बैक्टीरियल कोशिकाओं से युक्त मध्यम में डूबा अपने pores रासायनिक वर्षा की सतत प्रक्रिया से उत्पन्न के clogging के कारण मज़बूत बनाता है। यह कठोर स्पंज बार बेहतर ताकत को दर्शाती है जब, एक नियंत्रण स्पंज बार जो संकुचित और एक आवेदन बाहरी लोड की कार्रवाई के तहत निचोड़ा हो जाता है की तुलना करते हुए कठोर बार थोड़ा विरूपण के साथ एक ही वजन का समर्थन करने में सक्षम है।

Introduction

Sporosarcina pasteurii एक ग्राम पॉजिटिव जीवाणु अत्यधिक क्षारीय वातावरण (पीएच ~ 10) 1 में जीवित करने में सक्षम है और बैक्टीरियल प्रजातियों कि एक घटना microbiologically प्रेरित केल्साइट वर्षा (MICP) 2-4 बुलाया के एक प्रेरणा का एजेंट बन सकता है में से एक है। MICP एक ऐसी प्रक्रिया है जिसमें कैल्शियम कार्बोनेट की वर्षा उपयुक्त पर्यावरणीय परिस्थितियों में निश्चित रोगाणुओं से प्रेरित है है। एस pasteurii कुछ शर्तों के तहत MICP के महत्वपूर्ण मात्रा में उत्प्रेरण के लिए एक संभावित एजेंट के रूप में अपनी पहचान के कारण हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण हो गया है। इस बात की संभावना है कि इस तथ्य से उपजा एस pasteurii एंजाइम urease की प्रचुर मात्रा में स्रावित करने की अद्वितीय क्षमता है। इस एंजाइम, एक उत्प्रेरक के रूप में कार्य करता है एक त्वरित पानी के अणुओं की उपस्थिति में यूरिया की सेल (व्यापक और प्रचुर मात्रा में आपूर्ति के साथ एक स्वाभाविक रूप से जैव रासायनिक यौगिक) को बढ़ावा देने। प्रतिक्रियाओं का एक झरना है, इस प्रक्रिया के माध्यम से परमLy नकारात्मक आरोप लगाया कार्बोनेट आयनों की पीढ़ी के लिए होता है। इन आयनों, बारी में, कैल्शियम जैसे सकारात्मक धातु आयनों अंत में कैल्शियम कार्बोनेट (केल्साइट) के अवक्षेप के लिए फार्म के साथ प्रतिक्रिया; इसलिए लेबल MICP 5-9।

MICP की प्रक्रिया ज्ञात किया गया है और कई दशकों के अध्ययन के लिए 10,11। पिछले कुछ वर्षों में, MICP इंजीनियरिंग और बॉटम-अप हरी निर्माण 12, बड़े पैमाने पर संरचनाओं 13,14 और कार्बन ज़ब्ती और भंडारण 15,16 की वृद्धि सहित पर्यावरण आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए जांच की गई है।

उदाहरण के लिए, Cunnigham 17 एट। अल एक उच्च दबाव मध्यम तापमान प्रवाह एक Berea बलुआ पत्थर कोर युक्त रिएक्टर बनाया गया है। रिएक्टर बैक्टीरिया एस के साथ inoculated किया गया था fridgidimarina और उच्च दबाव सुपर कार्बन डाइऑक्साइड इंजेक्शन, ताकना खंड के अंदर बायोमास का एक विशाल संचय की शर्तों के तहतumes मनाया गया था, जो पारगम्यता में अधिक से अधिक 95% की कमी करने के लिए नेतृत्व किया। Jonkers और Schlangen 18 कंक्रीट में आत्म चिकित्सा की प्रक्रिया पर बैक्टीरिया की कुछ विशेष नस्लों के प्रभाव का अध्ययन किया। सतह छिद्रों के माध्यम से प्रवेश करने ताकना नेटवर्क में ले जाया बाहरी पानी निष्क्रिय बैक्टीरिया है जो बदले में MICP के माध्यम से संरचनात्मक ताकत मदद को सक्रिय करने की उम्मीद है। Tobler 19 एट अल। एस के ureolytic गतिविधि की तुलना में है बड़े पैमाने पर MCIP पक्ष की शर्तों के तहत एक स्वदेशी भूजल ureolytic सूक्ष्म जगत के साथ pasteurii और पाया कि एस pasteurii भी जब स्वदेशी समुदायों से पहले urease गतिविधि का अभाव केल्साइट वर्षा में सुधार करने के लिए एक सुसंगत क्षमता है। Mortensen 20 et.al मिट्टी के प्रकार, अमोनियम क्लोराइड, लवणता, ऑक्सीजन एकाग्रता और MICP पर कोशिकाओं के सेल की एकाग्रता जैसे बाह्य कारकों के प्रभाव का अध्ययन किया है। उनके प्रदर्शन है कि जैविक उपचार प्रक्रिया resp के साथ बहुत मजबूत हैपैरामीटर अंतरिक्ष में एक व्यापक बदलाव के लिए ect विभिन्न बड़े पैमाने पर remediation एक उचित संवर्धन प्रक्रिया बैक्टीरिया सुदृढ़ करने के लिए किया जाता है प्रदान की अनुप्रयोगों के लिए इस प्रक्रिया की फिटनेस substantiates। फिलिप्स 21 एट। अल एस के साथ इंजेक्शन लगने के बाद पारगम्यता और एक रेत स्तंभ और एक बलुआ पत्थर कोर की ताकत में परिवर्तन का अध्ययन करने के प्रयोगों के लिए बनाया गया pasteurii संस्कृतियों। उन्होंने पाया कि जब पारगम्यता में कमी आई 2 - 4 बार जबकि फ्रैक्चर ताकत में तीन गुना वृद्धि हुई है।

एस pasteurii और MICP में अपनी भूमिका सक्रिय अनुसंधान और रासायनिक वर्षा के तंत्र से संबंधित कई मुद्दों के विषयों अभी भी पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं। इस के प्रकाश में, यह लगातार मानकीकृत प्रोटोकॉल का एक सेट के लिए सही करने के लिए संस्कृति एस का एक उपयुक्त समृद्ध शेयर होना बहुत जरूरी है MICP प्राप्त करने के लिए pasteurii। यहाँ, हम एक कठोर प्रोटोकॉल है कि repeatability और reproducibility सुनिश्चित करेगा रूपरेखा। इस एमएnuscript एस संवर्धन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन pasteurii और उपयुक्त वर्षा प्रेरित करने के लिए संस्कृति के माध्यम से समृद्ध। प्रक्रिया जैसे ऑप्टिकल और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और एक्स-रे फोटो-इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी (XPS) के रूप में विभिन्न सूक्ष्म तकनीक के माध्यम से जांच की है। पांडुलिपि का ध्यान केंद्रित MICP की प्रक्रिया चल रही है। SEM और एस की तरह प्रक्रियाओं, किया जा रहा है अच्छी तरह से स्थापित मानक प्रोटोकॉल, अलग से वर्णित नहीं कर रहे हैं।

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Protocol

नोट: नीचे वर्णित क्रम में प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदर्शन करना। जीवाणु संस्कृति प्रोटोकॉल धारा 1 में चर्चा की है (इसके अलावा चित्रा 1 देखें)। धारा 2 बाहरी additives का उपयोग संस्कृति के माध्यम से समृद्ध बनाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है। धारा 3 बहु मोड माइक्रोस्कोपी के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है। सब अलग-अलग घटकों की बाट एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करके मापा जा सकता है। प्रत्येक समाधान की मात्रा एक बड़ा सिलेंडर का उपयोग करके मापा जा सकता है।

नोट: - विवरण के लिए संस्थागत सुरक्षा कार्यालय से परामर्श 2. उचित जैव सुरक्षा प्रोटोकॉल धारा 1 के लिए पीछा किया जाना चाहिए।

1. जीवाणु संस्कृति

  1. संस्कृति बैक्टीरिया - अगर प्लेट माध्यम तैयारी
    1. ऐसे पेट्री डिश, कुप्पी के रूप में उपकरण और सामग्री इकट्ठा, Tris आधार, एचसीएल, अग्रवाल, Millipore पानी, पीएच मीटर etc.Sterilize उपयोग करने से पहले 121 डिग्री सेल्सियस पर autoclaving द्वारा सभी कंटेनरों।
    2. 0.1 की 1 एल तैयारMillipore पानी का 1 एल के साथ 15.75 छ Tris आधार मिश्रण से Tris-बफर के 3 एम जलीय समाधान। मूल समाधान (10.4 पीएच) का पीएच स्तर को कम करने के लिए एचसीएल (50% एकाग्रता) के 2,800 μl जोड़ें। पीएच स्थापित करने के लिए एक = 9 पीएच मीटर का उपयोग कर लगातार जाँच करें।
    3. इस प्रकार के रूप में दो भागों में 1 एल बफर समाधान फूट डालो:
      1. इस समाधान के 800 मिलीलीटर ले लो। यह भी उतना ही फूट डालो 400 मिलीलीटर प्रत्येक के दो भागों में। 8 ग्राम (एनएच 4) 2 अतः 4 एक अन्य समाधान का हल और 16 ग्राम खमीर निकालने के लिए भंग।
      2. शेष समाधान (200 मिलीलीटर) ले लो और इसे फिर से विभाजित 100 मिलीलीटर प्रत्येक के दो भागों में। 2 जी (एनएच 4) 2 अतः 4 एक को मिक्स। 4 जी खमीर निकालने और अन्य को 4 ग्राम अगर जोड़ें।
    4. अलग से अल पन्नी में संबंधित बोतल लपेटकर और आटोक्लेव टेप चिपका के बाद 4 समाधान आटोक्लेव।
      नोट: एक benchtop आटोक्लेव यूनिट का इस्तेमाल किया जाता है, मात्रा 500 मिलीलीटर (तापमान और दबाव आटोमैटिक करने के लिए सेट किया जाना चाहिएically मात्रा के एक समारोह के रूप में निर्दिष्ट)।
    5. आटोक्लेव से उन्हें बाहर लेने के बाद, एक तरफ कदम 1.3.1 (नीचे) के लिए दो 400 मिलीलीटर समाधान निर्धारित किया है। दो 100 मिलीलीटर के समाधान के मिश्रण से एक 200 मिलीलीटर समाधान है। 12 पेट्री डिश - 10 में मिश्रण डालो।
  2. संस्कृति बैक्टीरिया - अगर प्लेट नमूना तैयार
    1. फ्रीजर (-80 डिग्री सेल्सियस) से बैक्टीरियल शेयर निकालें और यह पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं। ठीक से विगलन के बाद, बैक्टीरियल शेयर और अगर प्लेट एक जैव सुरक्षा हुड के अंदर जगह है।
    2. Sporosarcina pasteurii स्टॉक के साथ टिप हमला करने के लिए - (10 μl एक अच्छा विकल्प है 0.5) सबसे छोटी उपलब्ध आयाम के micropipette का चयन करें। स्ट्रीक micropipette टिप के साथ एक अगर प्लेट। 48 घंटे के लिए 31 डिग्री सेल्सियस पर एक गैर-झटकों इनक्यूबेटर अंदर रेखादार अगर थाली रखें।
    3. 48 घंटे के बाद, इनक्यूबेटर से थाली निकालें और नेत्रहीन एकल कालोनियों के अस्तित्व के लिए जांच करते हैं। कोई एकल कालोनियों देखते हैं, तो टी में जगहवह एक और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर।
    4. प्रक्रिया को दोहराएं जब तक एकल कालोनियों पता चला रहे हैं। परीक्षण के 7 दिनों से अधिक नहीं है।
      ध्यान दें: एकल कालोनियों एक सप्ताह के बाद भी, तो यह निष्कर्ष निकाला है कि इस कदम का ठीक से पालन नहीं किया गया है और पूरी प्रक्रिया के चरण 1 से दोहराया जाना चाहिए नहीं दिखाई देते हैं।
  3. संस्कृति बैक्टीरिया - अंतिम नमूना तैयार
    1. दो 400 मिलीलीटर समाधान (Tris बफर + (एनएच 4) मिश्रण 2 अतः 4 और Tris बफर + खमीर निकालने (1.5.1) एक साथ प्राप्त करने के लिए एक 800 एमएल समाधान। एक फ्लास्क में इस समाधान के 125 मिलीलीटर स्थानांतरण।
    2. एकल कालोनियों के उच्च एकाग्रता के साथ क्षेत्रों की पहचान करने के लिए अगर प्लेट की सतह का एक दृश्य परीक्षा प्रदर्शन। धीरे कुहनी से हलका धक्का और एक micropipette टिप के साथ कालोनियों में से एक को तोड़ने।
    3. 125 मिलीलीटर फ्लास्क में एक ही micropipette टिप डुबकी और यह अच्छी तरह से हलचल मजबूत गुणा के लिए कोशिकाओं की है कि पर्याप्त संख्या सुनिश्चित करने के लिए स्थानांतरित हो। 3 दिन - 150 आरपीएम, 2 के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते इनक्यूबेटर में कुप्पी रखें। 2 के बाद - 3 दिन, इनक्यूबेटर से फ्लास्क को हटा दें।
  4. संस्कृति बैक्टीरिया - अंतिम कोशिका गिनती
    1. गैर-पतला संस्कृति समाधान पीबीएस का उपयोग कम से कम दस लाख (10 -7) के कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए गणनीय एकल कालोनियों दिखाई सुनिश्चित करने के धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करना। आगर-प्लेटों में से एक पर सात समानांतर समान दूरी पर लाइनों ड्रा।
      1. पेट्री डिश, पर्याप्त प्रमुख ऊपर से दिखाई करने के लिए के नीचे सतह पर बोल्ड लाइनों ड्राइंग द्वारा यह मत करो। एक खंड में गैर-पतला समाधान के 3 छोटे बूँदें गिरा। 1:10 कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए बफर फॉस्फेट खारा (पीबीएस) के 9 मिलीलीटर के लिए गैर-पतला समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. एक विंदुक के साथ इस नव पतला समाधान के एक छोटे से विभाज्य (~ 0.1 एमएल) ले लो और अगले खंड पर 3 से अधिक छोटे बूंदों ड्रॉप। एक नई कुप्पी और आगे पतला दस गुना (10x) द्वारा करने के लिए नव पतला समाधान स्थानांतरणपीबीएस जोड़ने। यह नीचे लाता है 10 -2 या 1 से कमजोर पड़ने: 100।
      1. अगले खंड में 100 समाधान: यह 1 का प्रयोग करें। 1,000 सभी तरह: क्रमिक उन्हें नई बोतल को स्थानांतरित करने और लगातार पीबीएस के साथ मिलकर में दस गुना (10x) गिराए 10 -3 या 1 से अधिक से अधिक पतला नमूने प्राप्त करने के द्वारा यह है कि वह हौसले पतला समाधान की छोटी मात्रा के साथ इस प्रक्रिया को दोहराने करने के लिए नीचे 10 -7 या 01:10 मिलियन पिछले खंड में।
    3. 31 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिन - कॉलोनी के गठन इकाई (CFU) प्लेट गिनती 1 के लिए थाली incubating के बाद अगर थाली में मौजूद कोशिकाओं की संख्या गिनने के लिए करते हैं। इस undiluted नमूने में बैक्टीरियल गिनती का एक मात्रात्मक उपाय देता है।
      नोट: CFU मूल्य प्रणाली की क्षमता को यह सोचते हैं कि हर कॉलोनी अलग है और एक भी व्यवहार्य माइक्रोबियल सेल द्वारा स्थापित किया गया है पोषक तत्व मध्यम, तापमान और समय की विशिष्ट परिस्थितियों के तहत कालोनियों को जन्म देने के लिए के आधार पर मापा जाता है।
    4. सीलफिल्म स्वयं सील और भविष्य में उपयोग के लिए एक रेफ्रिजरेटर में आइटम शेष की दुकान के साथ पेट्री डिश।

2. पोषक तत्व के संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल वर्षा में तेजी लाने के लिए

  1. स्थानांतरण कई निष्फल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में तैयार संस्कृति तरल (कोशिकाओं + मध्यम) के 9 मिलीलीटर, 10 मिलीलीटर की मात्रा में से प्रत्येक।
  2. यूरिया: 2 जी / एल, अमोनियम क्लोराइड: बाहरी ताजा माध्यम में निम्नलिखित सांद्रता में चार घटकों से मिलकर संवर्धन का एक 100 मिलीलीटर शेयर समाधान तैयार 1 जी / एल, सोडियम बाइकार्बोनेट: 212 मिलीग्राम / एल, कैल्शियम क्लोराइड: 280 मिलीग्राम / एल। ध्यान से एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग सभी मुद्दों को मापने के लिए और आटोक्लेव में एक बीकर में ताजा मध्यम और जगह (121 डिग्री सेल्सियस, 15 साई, 15 मिनट) के साथ सभी लेकिन यूरिया मिश्रण।
    1. आटोक्लेव के बाद, ताजा माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ यूरिया (2 मिलीग्राम) की आवश्यक राशि का मिश्रण है और एक सिरिंज संवर्धन की प्रक्रिया को पूरा करने के साथ 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर फिट के माध्यम से गुजरती हैं।
    2. 1 जोड़ेतैयार संस्कृति तरल (कोशिकाओं + मध्यम) के 9 मिलीलीटर युक्त निष्फल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के लिए additives के साथ इस संवर्धन माध्यम की मिलीलीटर (2.1 कदम देखें)।
      नोट: इन सभी घटकों के, यूरिया ऊंचा तापमान पर सड़ सकने जा रहा है, एक आटोक्लेव में निष्फल नहीं किया जा सकता। इसलिए, के बाद अन्य घटकों autoclaved दिया है (121 डिग्री सेल्सियस, 15 साई, 15 मिनट), यूरिया पिछले एक 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से जोड़ा जाता है।
  3. भंवर प्रत्येक ट्यूब को अच्छी तरह से एक यांत्रिक vortexer का उपयोग कर। 30 डिग्री सेल्सियस पर एक गैर-मिलाते इनक्यूबेटर में समृद्ध तरल पदार्थ (कोशिकाओं + मध्यम + योजक) रखें। वर्षा की दीक्षा के लिए नियमित रूप से सभी इकाइयों की निगरानी। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, सूक्ष्म टिप्पणियों शुरू एक बार वर्षा की शुरुआत नग्न आंखों से पता चला है। प्रयोगों की शुरुआत के बाद 36 घंटा - यह 30 के बीच आमतौर पर है।

3. मल्टी मोड माइक्रोस्कोपी के लिए प्रोटोकॉल

  1. एक उच्च Magnificat के लिए तरल पदार्थ की एक छोटी मात्रा (~ 1 मिलीलीटर) स्थानांतरणआयन उज्ज्वल क्षेत्र मोड के साथ प्रारंभिक टिप्पणियों प्रदर्शन करने के लिए माइक्रोस्कोपी संभाग coverglass प्रणाली। के साथ शुरू करने के लिए, सबसे कम बढ़ाई (4X) के साथ सभी टिप्पणियों शुरू करते हैं। जो कवरेज और अवक्षेप के वितरण के बारे में इसलिए वैश्विक जानकारी का एक व्यापक क्षेत्र प्रदान करता है।
  2. वर्षा की महत्वपूर्ण संस्करणों के साथ विशेष क्षेत्रों का चयन करें और में (20X, 40X, 60X) उत्तरोत्तर बढ़ती बढ़ाई द्वारा ज़ूम।
    नोट: चूंकि यह ठीक से (बहुत करीब अपवर्तक सूचकांक के कारण) कोशिकी Polymeric पदार्थ (ईपीएस) उज्ज्वल क्षेत्र के नीचे से कोशिकाओं को हल करने के लिए असंभव है, चरण विपरीत मोड पर स्विच जब भी आवश्यक है। इस मोड में, सिर्फ कोशिका झिल्ली (थोक सेल से एक अलग चरण जा रहा है) की रूपरेखा दिखाई दे रहे हैं, इस प्रकार दृश्य भेदभाव सक्षम करने से।
  3. अंत में, लाइव / मृत दाग है कि चुनिंदा हरे रंग के रूप में रहते घटकों रंजक, जबकि लाल रंग में मृत घटक रंग के साथ कुछ कक्षों दाग। मानक प्रोटोकॉल 28 को देखें </ Sup>।
  4. फ्लोरोसेंट मोड पर स्विच ठीक से लाल और हरे क्षेत्रों के बीच भेद करने के लिए। लाल (के 540 उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ लाल फिल्टर घन - 580 एनएम, 600 से 595 एनएम और बैरियर फिल्टर के Dichroic दर्पण - 660 एनएम) और ग्रीन (GFP लंबी पास ग्रीन फिल्टर घन के 440 उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ - 480 एनएम, की Dichroic दर्पण 510 एनएम) फिल्टर क्यूब्स के 505 एनएम और बैरियर फिल्टर फ्लोरोसेंट micrographs की सुविधा के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
  5. एक बार सभी बहु मोड डेटा, इकट्ठा किया गया है सबसे अच्छा संभव विपरीत और स्पष्टता प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छा चित्र और मैन्युअल ओवरले (व्यक्तिगत brightfield, चरण विपरीत और फ्लोरोसेंट छवियों) का चयन करें।
  6. क्रिस्टल संरचनाओं को समझने के लिए सूखे ठोस नमूनों पर SEM प्रदर्शन करना। यह एक अच्छी तरह से स्थापित और मानक प्रक्रिया है। 22 को पूरा करें कार्य समूहों (कार्बोनेट) की रासायनिक हस्ताक्षर की पहचान करने के एक्सपीएस। यह एक अच्छी तरह से स्थापित और मानक प्रक्रिया के रूप में भी है। 23

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Representative Results

एस एक alkaliphile 24 अपेक्षाकृत कठोर परिस्थितियों जीवित रह सकते हैं किया जा रहा है pasteurii। जब ऊपर उल्लेख संस्कृति प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है, और एस pasteurii एक कक्ष के अंदर उगाया जाता है, बैक्टीरिया समय (2A चित्रा) से अधिक कैल्शियम कार्बोनेट की वर्षा हो जाती है। चित्रा 2 (ख) मध्यम संस्कृति के भीतर बैक्टीरिया कोशिका आबादी का एक चरण विपरीत ऑप्टिकल सूक्ष्म छवि को दर्शाता है। व्यक्तिगत कोशिकाओं स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, बैक्टीरिया काफी स्पष्ट की बेसिलस वर्ग की विशेषता छड़ी की तरह आकार के साथ। छोटे भूरे रंग के तीर विशेष रूप से दो अलग-अलग कक्षों को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। कैल्शियम कार्बोनेट की वर्षा कई दिनों की अवधि में होता है। चित्रा 2A दिखाता है कि कैसे अवक्षेप एक अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे बसने। इस ताजा एक सफेद के साथ तरल माध्यम नीचे बैठे पाउडर के रूप में नग्न आंखों से देखा जा सकता हैरंग में एक तेज विपरीत के रूप में पीले रंग के तरल करने का विरोध किया। पीले रंग के तरल उनकी संस्कृति माध्यम में निलंबित बैक्टीरिया होते हैं। सफेद अवक्षेप एकत्र की है और सूखे और बाद में SEM (चित्रा -2) का उपयोग imaged थे।

चित्रा 3 ए, अच्छी तरह से परिभाषित दरार लाइनों, स्फटिकता की एक बानगी में आसानी से पहचाना जा सकता है। चित्रा 3 बी लक्षण वर्णन के लिए एक ही नमूना के लिए एक्सपीएस ग्राफ दिखाता है। चोटियों कार्बोनेट समूहों पिन बिंदु करने के लिए इसी कैल्शियम कार्बोनेट का अस्तित्व। इस प्रकार, चित्रा 3 ए और बी एक साथ निर्णायक केल्साइट की पीढ़ी उपजी रासायनिक रूप में साबित होते हैं।

एक गुणात्मक प्रयोग आदेश MICP की क्षमता झरझरा मीडिया के गुणों को बदलने के लिए आकलन करने के लिए प्रदर्शन किया था। यह अंत करने के लिए, हम एक प्रयोग स्पंज शामिल है जो एक झरझरा की नकल करने की उम्मीद कर रहे हैं प्रदर्शनताकना संरचनाओं की लंबाई तराजू के एक सीमा के साथ मध्यम, के रूप में एक विशिष्ट प्राकृतिक संरचना में पाया जाता है। एक स्पंज बार (श्री स्वच्छ, पी एंड जी) एस के समाधान में डूब गया था 7 दिनों के लिए और फिर सूखे की अवधि के लिए pasteurii। स्पंज MICP प्रक्रिया के लिए लंबे समय तक प्रदर्शन के बाद कठोर और compressive शक्ति को बढ़ाया का प्रदर्शन किया। यह 4 चित्र में दिखाया गया है स्पंज, इससे पहले विसर्जन (नियंत्रण मामले), महत्वपूर्ण संपीड़न पता चला जब एक 1 किलो वजन (चित्रा -4 ए - बी) के अधीन है।। दूसरी ओर, के बाद एस में विसर्जन करने के लिए किए जा रहा है pasteurii समाधान है, यह परिणामस्वरूप केल्साइट वर्षा के कारण ताकना clogging सामना करना पड़ा। इस ताकना रिक्त स्थान की एक ब्रिजिंग से उत्पन्न शक्ति में भारी वृद्धि करने के लिए नेतृत्व और बाद में बार सक्षम महत्वपूर्ण संपीड़न (चित्रा 4C - डी) की अनुमति के बिना 1 किलो भार का समर्थन करने के लिए।

एक अर्द्ध मात्रात्मक विचारसख्त प्रक्रिया के बारे में भरी हुई पट्टी के नीचे को झुकाव ऊंचाई की माप के माध्यम से प्राप्त की जा सकती है। मूल स्पंज नमूना 4.5 सेमी की ऊंचाई के साथ एक आयताकार पट्टी है। नियंत्रण नमूना के नीचे को झुकाव है, बहुत ही लोड के आवेदन के बिंदु के पास, लगभग 1.6 सेमी है। इलाज किया नमूना के मामले में, नीचे को झुकाव 0.6 सेमी तक कम कर देता है। सख्त प्रक्रिया के आगे कठोर मात्रा का ठहराव भी संभव है। उदाहरण के लिए, कतरनी ताकत, शिखर deviatoric तनाव और dilatancy कोण में वृद्धि के मामले में इस प्रक्रिया का एक यंत्रवत स्पष्टीकरण Tagliaferri 25 एट द्वारा प्रस्तावित किया गया है। एक्स-रे इमेजिंग और डिजिटल छवि सह-संबंध के माध्यम से अल।

आकृति 1
चित्रा 1. पूरी संस्कृति प्रोटोकॉल एक एल्गोरिथम योजनाबद्ध रूप में प्रतिनिधित्व की रूपरेखा।, Tris बफर और अगर समाधान के साथ शुरू करने के लिए poure हैएक पेट्री डिश में घ। एक बार अगर थाली तैयार है, यह एक टिप बैक्टीरिया के साथ पीड़ित के साथ परेशान कर रहा है। परेशान प्लेट एकल कालोनियों विकसित करने के लिए incubated है। एकल कालोनियों में से एक एक मीडिया फ्लास्क को हस्तांतरित और फिर incubated है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. कोशिकाओं और Precipitates (ए) संस्कृति के माध्यम से एक अपकेंद्रित्र ट्यूब नेतृत्व के अंदर ही सीमित नमूदार रासायनिक वर्षा स्पष्ट करने (5 के बाद - 7 दिन) में कोशिकाओं। कि नीचे बैठ जाती है और नग्न आंखों के लिए दिख रहा है। (बी) के एक सतह चरण विपरीत तहत देखा पर स्थिर बैक्टीरिया की जनसंख्या। व्यक्तिगत छड़ के आकार की कोशिकाओं (बेसिली, लेबल सपा) स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है (उनमें से एक जोड़ी तीर से प्रकाश डाला)। सफेद दोनों कोशिकाओं (सपा) और क्रिस्टल (सीसी) दिखा वेग (सी) SEM छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. क्रिस्टल और उनकी विशेषता। सूखे वेग (ए) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवि। व्यक्तिगत क्रिस्टल और संबद्ध दरार लाइनों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। (बी) के एक्स-रे फोटो-इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी (XPS) रासायनिक वेग का ग्राफ; मास स्पेक्ट्रोमेट्री चोटियों कार्बोनेट के लिए कार्यात्मक समूह केल्साइट के अस्तित्व की संभावना को मजबूत इसी। vi के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण ईडब्ल्यू।

चित्रा 4
चित्रा 4. एक अर्द्ध मात्रात्मक रूप में प्रोटोटाइप झरझरा मीडिया सेवित स्पंज सलाखों के साथ प्रयोग करें। (ए) और (बी) डूबा नहीं ताजा सूखी नमूने हैं। (सी) और (डी) मध्यम और कोशिकाओं का एक समाधान में भीग गीला नमूने हैं; वे ताकना clogging केल्साइट वर्षा से उत्पन्न के रूप में एक लगातार वजन की कार्रवाई के तहत कम हो संपीड़न से यहाँ देखा के कारण सामग्री प्रतिरोध में एक महत्वपूर्ण वृद्धि दिखा रहे हैं। अनुपचारित नमूने स्वाभाविक रूप से असुरक्षित हैं और जब एक 1 किलो वजन के अधीन मात्रा में भारी कमी से पीड़ित हैं। pores हवा और अनुबंध बाहर निचोड़, आकार में एक समग्र कमी के लिए अग्रणी। दूसरी ओर, इलाज नमूना कृत्रिम रूप से ताकना clogging के आधार पर कठोरता का एक महत्वपूर्ण राशि प्राप्त की है। यह शक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि को दर्शाता है, जब यह आराम से किसी भी संपीड़न के बिना ही लोड समर्थन करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

महत्वपूर्ण कदम: इस पांडुलिपि में विस्तार से एस का एक व्यावहारिक नमूना संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन pasteurii। एक बार जब संस्कृति सज गया है, यह उपयुक्त रूप से समृद्ध किया जाना चाहिए। यह एक महत्वपूर्ण कदम प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि उचित रासायनिक वातावरण प्रदान करने के लिए एक विफलता के लिए या तो वर्षा या उसके एक पूर्ण अभाव के बहुत लंबे समय के तराजू ले जाता है। एस pasteurii कई बाहरी एजेंसियों को काफी संवेदनशील है और जैव रासायनिक मजबूती और repeatability सुनिश्चित करने के लिए देखभाल और परिशुद्धता के एक उच्च डिग्री के साथ सुसंस्कृत किया जाना चाहिए। हद और संवर्धन की खुराक अब वर्षा की रासायनिक प्रकृति हुक्म लिए जाना जाता है और इसलिए रूप में अच्छी तरह सही ढंग से नियंत्रित किया जाना चाहिए।

संशोधन / समस्या निवारण: कई पहलुओं अंत परिणामों में थोड़ा विचरण के साथ संशोधित किया जा सकता है। प्लेट गिनती तकनीक (ध प्रति धारावाहिक कमजोर पड़ने से ऊपर वर्णित के अनुसार प्रदर्शन होने की जरूरत नहींई मीलों मिश्रा विधि)। इधर, धारावाहिक कमजोर पड़ने सात क्षेत्रों में अपनी नीचे की सतह पर तैयार chords से विभाजित करके एक भी अगर प्लेट पर प्रदर्शन किया गया है। यह अनिवार्य नहीं है। यह भी एक फैल प्लेट तैयार करके एक विशेष कमजोर पड़ने के लिए एक पूरे अगर प्लेट का उपयोग करने के लिए एक आम बात है। अंतिम गणना के लिए चुना जाता है - धारावाहिक कमजोर पड़ने लगातार प्रसार प्लेटों की एक श्रृंखला और एकल कालोनियों (200 20) की एक गणनीय संख्या के साथ एक पर किया जाता है। विभिन्न अन्य सेल गिनती तकनीकों के किसी भी यहाँ के रूप में अच्छी तरह से लागू किया जा सकता है। माइक्रोस्कोपी अच्छी तरह से सरल कवर फिसल जाता है या स्लाइड के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है। एक चैम्बर इकाई सब पर अनिवार्य नहीं है।

कभी कभी, बैक्टीरिया अवक्षेप के लिए फार्म विफल हो सकता है। यह पहली बार एक तरल माध्यम में जमे हुए संस्कृति की एक छोटी राशि के हस्तांतरण के लिए उपयोगी है। Streaking वृद्धि के बाद तरल पहले में हुई है प्रदर्शन किया जा सकता है।

सीमाएं: यह एक परमाणु के साथ एक धीमी तकनीक हैकदम के mber, एक दूसरे के लिए अग्रणी। वहाँ सभी चरणों में संदूषण, पार संक्रमण और अन्य सांस्कृतिक दोषों के महत्वपूर्ण संभावना है। तीव्र देखभाल हर समय बनाए रखा जाना चाहिए। वेग के लगभग 180 मिलीग्राम संस्कृति के समाधान के प्रति मिलीलीटर का गठन किया है।

महत्व: वर्तमान प्रोटोकॉल में विस्तार की रूपरेखा सभी आवश्यक कदम सुनिश्चित करने के लिए कि जीवाणु एस की एक संस्कृति pasteurii ईमानदारी से बाहर से जोड़ा संवर्धन के प्रभाव में केल्साइट precipitates। हालांकि इस जीवाणु ही की संस्कृति एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल, संवर्धन और मात्रा का ठहराव की पूरी प्रक्रिया नहीं है। इस मुद्दे को यहाँ संबोधित किया गया है।

भविष्य आवेदन: यह उपयुक्त विभिन्न शिष्टाचार है कि बारी में अवक्षेप की प्रकृति के आधार पर विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इंजीनियर हो सकता है में वेग को यह जीवाणु मिलाना संभव हो सकती है। यह पहले उल्लेख किया गया था कि वहांMICP एस को शामिल करने के लिए सम्मान के साथ कई अज्ञात मौजूद pasteurii। इन अज्ञात के कुछ एस के योगात्मक गतिशीलता की भूमिका में शामिल ऐसे झरझरा मीडिया और तरल पदार्थ के प्रवाह के प्रभाव के रूप में MICP प्रक्रिया में pasteurii, microscale पर्यावरण 26,27 की भूमिका। एक मानकीकृत प्रोटोकॉल विकसित किया जा सकता है कि उचित बहु मोड माइक्रोस्कोपी के प्रदर्शन के लिए एक स्पष्ट अवसर के साथ तेज वर्षा करता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Petridish Fisher Scientific FB0875712 Petridishes being used as Agar plate
Pyrex Flasks Fisher Scientific S63268 Corning Erlenmeyer
Tris-Base Promega H5133 being used to make Tris-Buffer
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich H9892 1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture
Agar Powder Sigma-Aldrich A1296 microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder
Ammonium Sulphate Sigma-Aldrich A4418 for Molecular Biology
Yeast extract powder Sigma-Aldrich 51475
Measuring Cylinder Cole-Parmer CP08559GC Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk
Analytical Balance OHAUS AX124E being used to measure weight of reagents
Autoclave Brinkmann 58619000
Autoclave Tape VWR 52428864
Aluminum Foil Sigma-Aldrich Z185140 being used to seal the flask before placing it in Autoclave
Bacterial Stock Cedarlane 11859 -80 °C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.
Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume Biohit 725010 Marketed by VWR under catalog number 14005976
Micropipette Tip Fisher Scientific 212772B Used for scratching Agar plates
Incubator Binder 80079098 Microbiology Incubator,BF Series
Shaking Incubator VWR 14004300 VWR Signature Benchtop Shaking Incubators
Phosphate Buffer Saline (PBS)  Sigma-Aldrich P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device BD Biosciences 357590 Marketed by VWR under catalog number 53106220
Parafilm Sigma-Aldrich P7793 Being used to seal Agar plates
Urea Sigma-Aldrich U1250 Enrichment for nutrient medium
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S8875 Enrichment for nutrient medium
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016 Enrichment for nutrient medium

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References

  1. Gibson, T. An investigation of the Bacillus pasteurii group. Journal of Bacteriology. 28, 491-502 (1934).
  2. Greenfield, L. J. Metabolism and concentration of calcium and magnesium and precipitation of calcium carbonate by a marine bacterium. Annals of the New York Academy of Sciences. 109, 23-45 (1963).
  3. Phillips, A. J. Engineered applications of ureolytic biomineralization: a review. Biofouling. 29, 715-733 (2013).
  4. Dhami, N. K., et al. Biomineralization of calcium carbonates and their engineered applications: a review. Frontiers in microbiology. 4, 314 (2013).
  5. Cuthbert, M. O., et al. Controls on the rate of ureolysis and the morphology of carbonate precipitated by S. Pasteurii biofilms and limits due to bacterial encapsulation. Ecological Engineering. 41, 32-40 (2012).
  6. Okwadha, G. D., et al. Optimum conditions for microbial carbonate precipitation. Chemosphere. 81, 1143-1148 (2010).
  7. Stocks-Fischer, S., et al. Microbiological precipitation of CaCO3. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1563-1571 (1999).
  8. Lauchnor, E. G., et al. Bacterially induced calcium carbonate precipitation and strontium coprecipitation in a porous media flow system. Environmental science & technology. 47, 1557-1564 (2013).
  9. Al Qabany, A., et al. Factors Affecting Efficiency of Microbially Induced Calcite Precipitation. Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering. 138, 992-1001 (2012).
  10. Morita, R. Y. Calcite precipitation by marine bacteria. Geomicrobiology Journal. 2, 63-82 (2009).
  11. Chafetz, H. S. Marine peloids: A product of bacterially induced carbonate precipitation. Journal of Sedimentary Petrology. 56, 812-817 (1986).
  12. Biomason.com. , Available from: http://www.biomason.com (2015).
  13. Whiffin, V. S. Microbial CaCO3 precipitation for the production of biocement. , Murdoch University. PhD thesis (2004).
  14. Paassen, L. A., et al. Scale up of BioGrout: a biological ground reinforcement method. Proceedings of the 17th International Conference on Soil Mechanics and Geotechnical Engineering. , 2328-2333 (2009).
  15. Cunningham, A. B., et al. Microbially enhanced geologic containment of sequestered supercritical CO2. Energy Procedia. 1, 3245-3252 (2009).
  16. Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
  17. Cunningham, A. B., et al. Reducing the risk of well bore leakage of CO2 using engineered biomineralization barriers. Energy Procedia. 4, 5178-5185 (2011).
  18. Jonkers, H. M., et al. Application of bacteria as self-healing agent for the development of sustainable concrete. Ecological Engineering. 36, 230-235 (2010).
  19. Tobler, D. J., et al. Transport of Sporosarcina pasteurii in sandstone and its significance for subsurface engineering technologies. Applied Geochemistry. 42, 38-44 (2014).
  20. Mortensen, B. M., et al. Effects of environmental factors on microbial induced calcium carbonate precipitation. Journal of applied microbiology. 111, 338-349 (2011).
  21. Phillips, A. J., et al. Potential CO2 leakage reduction through biofilm-induced calcium carbonate precipitation. Environmental science & technology. 47, 142-149 (2013).
  22. Robbins, R. Scanning Electron Microscope Operation. , Available from: http://www.utdallas.edu/~rar011300/SEM/Scanning%20Electron%20Microscope%20Operation.pdf (2010).
  23. vander Heide, P. X-ray Photoelectron Spectroscopy: An introduction to Principles and Practices. , John Wiley & Sons. (2011).
  24. Wiley, W. R., et al. Requirement of an alkaline pH and ammonia for substrate oxidation by Bacillus pasteurii. Journal of Bacteriology. 84, (1962).
  25. Tagliaferri, F., et al. Observing strain localisation processes in bio-cemented sand using x-ray imaging. Granular Matter. 13, 247-250 (2011).
  26. Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluidics and Nanofluidics. 14, 895-902 (2012).
  27. Valiei, A., et al. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a chip. 12, 5133-5137 (2012).
  28. LIVE/DEAD Bacterial Viability kit, Two-color bacterial viability assay. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf, https://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/protocols/live-dead-baclight-bacterial-viability-protocol.html (2004).

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जैव अभियांत्रिकी अंक 110 microbiologically प्रेरित केल्साइट वर्षा, झरझरा मध्यम संस्कृति प्रोटोकॉल कार्बन भंडारण
Microbiologically प्रेरित केल्साइट वर्षा द्वारा मध्यस्थता<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em
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Bhaduri, S., Debnath, N., Mitra, S., … More

Bhaduri, S., Debnath, N., Mitra, S., Liu, Y., Kumar, A. Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii. J. Vis. Exp. (110), e53253, doi:10.3791/53253 (2016).

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