Abstract
La particolare batterio sotto inchiesta qui (S. pasteurii) è unico nella sua capacità, nelle giuste condizioni, di indurre l'idrolisi di urea (ureolysis) in ambienti presenti in natura attraverso la secrezione di un ureasi. Questo processo di ureolysis, attraverso una catena di reazioni chimiche, porta alla formazione di precipitati di carbonato di calcio. Questo è noto come Microbiologicamente Induced Calcite Precipitazioni (MICP). I protocolli di coltura adeguate per MICP sono descritti qui. Infine, esperimenti di visualizzazione in diverse modalità di microscopia sono state effettuate per capire i vari aspetti del processo di precipitazione. Tecniche come la microscopia ottica, microscopia elettronica a scansione (SEM) e X-Ray Photo-elettroni Spectroscopy (XPS) sono stati impiegati per caratterizzare chimicamente il prodotto finale. Inoltre, la capacità di questi precipitati ad ostruire i pori all'interno di un mezzo poroso naturale è stato dimostrato attraverso un esperimento qualitativa dove spugnabarre sono stati usati per simulare un poro-rete con una gamma di scale di lunghezza. Una barra spugna imbevuta nel terreno di coltura contenente le cellule batteriche indurisce l'intasamento dei suoi pori risultanti dal processo continuo di precipitazione chimica. Questa barra spugna indurito presenta una resistenza superiore rispetto a un bar spugna controllo che si comprime e spremuto sotto l'azione di un carico esterno applicato, mentre la barra indurito è in grado di sostenere lo stesso peso con poca deformazione.
Introduction
Sporosarcina pasteurii è un batterio gram-positivo in grado di sopravvivere in ambienti fortemente alcaline (pH ~ 10) 1 ed è una delle specie batteriche che possono diventare un agente causativo di un fenomeno chiamato Microbiologicamente Induced Calcite Precipitation (MICP) 2-4. MICP è un processo in cui la precipitazione di carbonato di calcio è indotta da certi microbi in condizioni ambientali idonee. S. pasteurii ha assunto importanza negli ultimi anni a causa della sua identificazione come possibile agente per indurre un significativo volume di MICP in determinate condizioni. Questa possibilità deriva dal fatto che S. pasteurii ha la capacità unica di secernere grandi quantità di ureasi. Questo enzima agisce come un catalizzatore, promuovendo una lisi accelerata di urea (un composto biochimico naturale con fornitura diffusa e abbondante) in presenza di molecole di acqua. Attraverso una cascata di reazioni, questo processo finalely porta alla generazione di ioni carbonato carica negativa. Questi ioni, a sua volta, reagire con ioni metallici positivi come calcio per formare infine precipitati di carbonato di calcio (calcite); da qui l'etichetta MICP 5-9.
Il processo di MICP è stato conosciuto e studiato per diversi decenni 10,11. Nel corso degli ultimi anni, MICP è stato studiato per un'ampia gamma di applicazioni tecniche e ambientali, compresa bottom-up costruzione verde 12, il miglioramento delle strutture di grandi dimensioni 13,14 e il sequestro del carbonio e lo stoccaggio 15,16.
Ad esempio, Cunnigham 17 et. Al progettato un reattore a flusso temperatura moderata ad alta pressione contenente un nucleo di arenaria Berea. Il reattore è stato inoculato con il batterio S. fridgidimarina e in condizioni di alta pressione carbonica supercritica iniezione anidride, un massiccio accumulo di biomassa all'interno del poro volUmes stato osservato, che ha portato ad una riduzione superiore al 95% in permeabilità. Jonkers e Schlangen 18 hanno studiato l'effetto di alcuni ceppi di batteri speciali sul processo di auto-guarigione in calcestruzzo. acqua esterna trasportata nella rete dei pori che entra attraverso i pori della superficie si prevede di attivare i batteri dormienti che a loro volta aiutano resistenza strutturale tramite MICP. Tobler 19 et al. hanno confrontato l'attività ureolytic di S. pasteurii con una falda indigena ureolytic microcosmo in condizioni che favoriscono MCIP su larga scala e ha scoperto che S. pasteurii ha una capacità costante di migliorare la calcite precipitazioni anche quando le comunità indigene mancava attività ureasica prima. Mortensen 20 et.al hanno studiato gli effetti di fattori esterni come il tipo di suolo, la concentrazione di cloruro di ammonio, salinità, concentrazione di ossigeno e lisi delle cellule su MICP. La loro dimostrazione che il processo di trattamento biologico è molto robusto con respect ad un'ampia variazione nella spazio dei parametri sostanzia l'idoneità di questo processo per varie applicazioni di bonifica su larga scala di cui un processo di arricchimento adeguato per rinforzare i batteri è intrapresa. Phillips 21 et. al progettato esperimenti per studiare i cambiamenti nella permeabilità e la forza di una colonna di sabbia ed un nucleo di arenaria dopo l'iniezione con S. culture pasteurii. Essi hanno scoperto che, mentre la permeabilità diminuita 2 - 4 volte mentre la resistenza alla frattura è aumentato tre volte.
S. pasteurii e il suo ruolo nella MICP sono argomenti di ricerca attiva e di diverse questioni relative al meccanismo di precipitazione chimica non sono ancora pienamente compresi. Alla luce di questo, è molto importante avere un set di protocolli standardizzati coerenti con precisione la cultura un magazzino opportunamente arricchito di S. pasteurii per raggiungere MICP. Qui, descriviamo un protocollo rigoroso che assicuri ripetibilità e la riproducibilità. Questo manuscript descrive i protocolli dettagliati per la coltura di S. pasteurii ed opportunamente arricchendo il terreno di coltura per indurre la precipitazione. Il processo è indagato attraverso varie tecniche microscopiche, come ottica e microscopia elettronica a scansione (SEM) e X-Ray Photo-elettrone Spectroscopy (XPS). Il focus del manoscritto è sul processo di MICP. Procedure come SEM e SIMS, essendo protocolli standard consolidati, non sono descritte separatamente.
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Protocol
NOTA: Eseguire i protocolli sperimentali nell'ordine descritto di seguito. Il protocollo di coltura batterica è discusso nella sezione 1 (vedi anche figura 1). Sezione 2 descrive il protocollo per arricchire il terreno di coltura utilizzando additivi esterni. La sezione 3 descrive i protocolli per la microscopia multi-mode. I pesi di tutti i singoli componenti possono essere misurati con una bilancia analitica. Volume di ogni soluzione può essere misurata utilizzando un cilindro tarato.
NOTA: i protocolli di biosicurezza adeguato devono essere seguite per le sezioni 1 - 2. Consultare l'ufficio di sicurezza istituzionale per i dettagli.
1. coltura batterica
- Batteri Cultura - Agar piastra Media Preparazione
- Assemblare attrezzature e gli ingredienti, come piastre di Petri, fiasco, Tris-base, HCl, agar, Millipore acqua, pH-metro etc.Sterilize tutti i contenitori in autoclave a 121 ° C prima dell'uso.
- Preparare 1 L di 0,13 soluzione acquosa M di Tris-buffer mescolando 15.75 g Tris-base con 1 L di acqua Millipore. Per abbassare il pH della soluzione originale (pH 10,4) aggiungere 2.800 ml di HCl (concentrazione 50%). Controllare continuamente con un pH-metro per impostare pH = 9.
- Dividere la soluzione tampone 1 L in due parti:
- Prendere 800 ml di questa soluzione. Dividerlo equamente in due parti di 400 ml ciascuna. Sciogliere 8 g (NH 4) 2 SO 4 con una soluzione e 16 g estratto di lievito per l'altra soluzione.
- Dai rimanenti (200 ml) soluzione e dividerla nuovamente in due parti di 100 ml ciascuna. Mescolare 2 g (NH 4) 2 SO 4 a uno. Aggiungere 4 g di estratto di lievito e 4 g di agar all'altro.
- Autoclave le 4 soluzioni separatamente, dopo aver terminato i rispettivi palloni in foglio di alluminio e attaccare nastri autoclave.
NOTA: Se viene utilizzato un apparecchio da banco autoclave, il volume deve essere impostato a 500 ml (temperatura e pressione automatcamente specificato in funzione del volume). - Dopo averli tolti dal autoclave, impostare i due 400 ml di soluzioni da parte per passo 1.3.1 (qui di seguito). Mescolare le due soluzioni 100 ml di una soluzione di 200 ml. Versare il composto in 10 - 12 capsule di Petri.
- Batteri Cultura - piastra di agar Preparazione del campione
- Rimuovere il magazzino batterica dal congelatore (-80 ° C) e lasciarlo scongelare. Dopo lo scongelamento correttamente, posizionare il magazzino batterica e la piastra di agar all'interno di una cappa di biosicurezza.
- Selezionare la micropipetta di piccola dimensione disponibili (0,5-10 ml è una buona scelta) ad infestare la punta con il brodo pasteurii Sporosarcina. Streak una piastra di agar con la punta micropipetta. Posizionare la piastra di agar striato all'interno di un incubatore non agitazione a 31 ° C per 48 ore.
- Dopo 48 ore, rimuovere la piastra dal termostato di esaminare visivamente l'esistenza di singole colonie. Se non ci sono singole colonie, poi posto in tegli incubatrice per un altro 24 ore.
- Ripetere il processo fino a quando vengono rilevati singole colonie. Non superare i 7 giorni di prova.
NOTA: Se singole colonie non appaiono anche dopo una settimana, poi si conclude che le misure non sono state seguite correttamente e l'intero processo deve essere ripetuto dal punto 1.
- Batteri Cultura - campione finale Preparazione
- Mescolare le due soluzioni 400 ml (tampone Tris + (NH 4) 2 SO 4 e tampone Tris + estratto di lievito (1.5.1) insieme per ottenere una soluzione di 800 ml. Trasferire 125 ml di questa soluzione in un pallone.
- Eseguire un esame visivo della superficie della piastra di agar per identificare le regioni ad alta concentrazione di singole colonie. Delicatamente spingere e rompere una delle colonie con una punta micropipetta.
- Immergere la stessa punta micropipetta nel pallone 125 ml e mescolare accuratamente per garantire che il numero sufficiente di cellule per la moltiplicazione robusta vengono trasferite. Porre il pallone in un incubatore agitazione a 150 rpm, 30 ° C per 2 - 3 giorni. Dopo 2 - 3 giorni, togliere il pallone dal termostato.
- Batteri Cultura - Finale Cell Count
- Eseguire diluizioni seriali della soluzione di coltura non diluito con PBS per ottenere una diluizione di almeno dieci milioni (10 -7) garantire appaiono singole colonie numerabili. Disegnare sette linee equidistanti parallele su una delle agar-piastre.
- Eseguire questa disegnando linee in grassetto sulla superficie inferiore del piatto Petri, abbastanza importante per essere visibile dall'alto. Goccia 3 piccole gocce di soluzione non diluita in un segmento. Aggiungere 1 ml di soluzione non diluita a 9 ml di tampone fosfato (PBS) per ottenere una diluizione 1:10.
- Prendere una piccola aliquota (~ 0,1 ml) di questa nuova soluzione diluita con una pipetta e rilasciare 3 più piccole gocce sul segmento successivo. Trasferire la nuova soluzione diluita in un pallone e ulteriormente diluita dieci volte (10x) byaggiungendo PBS. Questo fa scendere la diluizione di 10 -2 o 1: 100.
- Utilizzare questo 1: soluzione 100 nel segmento successivo. Ripetere questo si elabora con piccoli volumi di soluzioni diluite appena trasferendoli successivamente a nuovi flaconi e diluendo continuamente dieci volte (10x) in tandem con PBS per ottenere campioni sempre più diluite da 10 -3 o 1: 1.000 fino fino a 10 -7 o 1:10 milioni nell'ultimo segmento.
- Eseguire Colony-Forming count Unit (CFU) piastra per contare il numero di cellule presenti nella piastra di agar dopo incubazione la piastra per 1 - 2 giorni a 31 ° C. Questo dà una misura quantitativa della carica batterica nel campione non diluito.
NOTA: Il valore CFU viene misurata in base alla capacità del sistema di dare origine a colonie nelle condizioni specifiche di mezzo nutriente, temperatura e tempo supponendo che ogni colonia è separata e fondata da una singola cellula microbica vitali. - Focale piastre di Petri con autosigillante pellicola e conservare rimanendo elementi in frigorifero per un utilizzo futuro.
- Eseguire diluizioni seriali della soluzione di coltura non diluito con PBS per ottenere una diluizione di almeno dieci milioni (10 -7) garantire appaiono singole colonie numerabili. Disegnare sette linee equidistanti parallele su una delle agar-piastre.
2. Il protocollo per l'arricchimento di nutrienti per accelerare Precipitazioni
- Transfer 9 ml della coltura liquida preparata (cellule + medium) in diverse provette per centrifuga sterilizzati, ciascuno di 10 ml di volume.
- Preparare una soluzione stock di arricchimento esterno costituito da quattro componenti nelle seguenti concentrazioni in mezzo fresco 100 ml: Urea: 2 g / L, cloruro di ammonio: 1 g / L, bicarbonato di sodio: 212 mg / L, cloruro di calcio: 280 mg / L. Misurare attentamente tutti gli ingredienti con una bilancia analitica e mescolare tutto, ma l'urea con terreno fresco in un bicchiere e posto in autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min).
- Dopo autoclave, mescolare la quantità necessaria di urea (2 mg) con 1 ml di mezzo fresco e passare attraverso una siringa con filtro a siringa da 0,22 micron per completare il processo di arricchimento.
- Aggiungere 1ml di questo terreno di arricchimento con additivi per le provette da centrifuga sterili contenenti 9 ml di coltura liquida preparata (cellule + media) (vedi punto 2.1).
NOTA: Di tutti questi componenti, urea essendo degradabile a temperature elevate, non può essere sterilizzato in autoclave. Quindi, dopo gli altri componenti sono stati autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min), l'urea viene aggiunto per ultimo attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron.
- Vortex ogni provetta accuratamente con un vortex meccanico. Posizionare i liquidi arricchiti (cellule + additivi medie +) in un incubatore non agitazione a 30 ° C. Monitorare tutte le unità regolarmente per l'inizio di precipitazioni. Utilizzando un microscopio ottico, iniziare osservazioni al microscopio volta insorgenza di precipitazione viene rilevata ad occhio nudo. Questo è di solito tra 30 - 36 ore dopo l'inizio degli esperimenti.
3. Protocollo per Multi-mode Microscopia
- Trasferire un piccolo volume (~ 1 ml) di fluido ad un alto magnificatione del sistema di microscopia coprioggetti-camerata per eseguire le osservazioni iniziali con modalità campo chiaro. Per cominciare, avviare tutte le osservazioni con l'ingrandimento più basso (4X). che fornisce un'ampia area di copertura e informazioni quindi globale sulla distribuzione di precipitati.
- Selezionare aree particolari con volumi significativi di precipitazioni e zoom (20X, 40X, 60X) aumentando progressivamente l'ingrandimento.
NOTA: Dal momento che è impossibile risolvere correttamente le cellule dalla sostanza extracellulare polimerico (EPS) in campo chiaro (a causa di molto vicino indici di rifrazione), attivare la modalità a contrasto di fase in caso di necessità. In questo modo, solo i contorni delle membrane cellulari (essendo una fase differente rispetto alla cella bulk) sono visibili, permettendo così differenziazione visiva. - Infine, macchiare alcune camere con Live macchia / Morto che tinge selettivamente le componenti in tensione, come verde, mentre la colorazione dei componenti morti in rosso. Fare riferimento a protocolli standard 28 </ Sup>.
- Attivare la modalità fluorescente di distinguere correttamente tra le regioni rosse e verdi. Red (cubo filtro rosso con eccitazione lunghezza d'onda di 540-580 nm, dicroico specchio di 595 nm e Barriera filtro di 600-660 nm) e passaggio lungo verde (GFP cubo filtro verde con eccitazione lunghezza d'onda di 440-480 nm, dicroico specchio 505 filtro nm e Barriera di 510 cubi nm) di filtro sono utilizzati per facilitare il microscopio a fluorescenza.
- Una volta che sono stati raccolti tutti i dati multi-mode, selezionare le migliori immagini e sovrapposizione manualmente (individuale campo chiaro, contrasto di fase e le immagini fluorescenti) per ottenere il miglior contrasto possibile e chiarezza.
- Eseguire SEM sui campioni solidi secchi di capire strutture cristalline. Questa è una procedura ben consolidata e standard. 22 Eseguire XPS per identificare le firme chimiche dei gruppi funzionali (carbonati). Questa è una procedura ben consolidata e standard pure. 23
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Representative Results
S. pasteurii essere un alkaliphile 24 possono sopravvivere in condizioni relativamente difficili. Quando il protocollo cultura di cui sopra è seguita, e S. pasteurii è cresciuto all'interno di una camera, i batteri porta alla precipitazione di carbonato di calcio nel tempo (Figura 2A). Figura 2 (b) mostra un contrasto di fase ottica dell'immagine microscopica della popolazione cellulare batterica nel terreno di coltura. Le singole celle possono essere chiaramente distinti, con forme a bastoncino caratteristici della classe bacillo batteri abbastanza evidenti. Le piccole frecce marroni sono stati utilizzati per evidenziare in particolare due celle individuali. La precipitazione di carbonato di calcio si verifica in un periodo di diversi giorni. La Figura 2A mostra come i precipitati stabilirsi sul fondo di un tubo da centrifuga. Questo può essere vividamente visto ad occhio nudo come una polvere biancastra seduta sotto il mezzo liquidoun netto contrasto di colore rispetto al liquido giallastro. Il liquido giallastro contiene batteri in sospensione nel loro terreno di coltura. I precipitati bianchi sono stati raccolti ed essiccati e successivamente ripreso con SEM (Figura 2C).
Nella Figura 3A, le linee di frattura ben definite, una caratteristica di cristallinità, può essere facilmente identificato. Figura 3B mostra il grafico XPS per lo stesso campione per la caratterizzazione. Picchi corrispondenti ai gruppi pin-point carbonato dell'esistenza di carbonato di calcio. Così, la figura 3A e B insieme conclusivamente dimostrano la generazione di calcite quella del composto precipitato.
Un esperimento qualitativa è stata eseguita al fine di valutare la capacità di MICP di modificare le proprietà di mezzi porosi. A tal fine, abbiamo effettuato un esperimento che coinvolge spugne che si prevede di imitare un porosamedia con una gamma di scale di lunghezza delle strutture dei pori, come si trova in una tipica struttura naturale. Una barra di spugna (Mr. Clean, P & G) è stato immerso in una soluzione di S. pasteurii per un periodo di 7 giorni e quindi essiccato. La spugna dopo una lunga esposizione al processo MICP indurito e visualizzata migliorata resistenza alla compressione. Questo è illustrato in Figura 4 La spugna, prima dell'immersione (caso di controllo), ha mostrato significativa compressione quando sottoposto ad un peso di 1 kg (Figura 4A - B).. D'altra parte, dopo essere stato sottoposto ad immersione nella S. soluzione pasteurii, ha subito dei pori intasamento dovuto alla precipitazione di calcite risultante. Ciò ha portato ad un massiccio aumento della forza risultante da ponte tra i pori e successivamente attivata la barra per supportare il carico 1 kg senza consentire una notevole compressione (Figura 4C - D).
Un'idea semi-quantitativaper quanto riguarda il processo di indurimento può essere acquisita tramite misurazioni di altezza deformazione della barra caricata. Il campione spugna originale è una barra rettangolare con un'altezza di 4,5 cm. La deflessione del campione di controllo, molto vicino al punto di applicazione del carico, è di circa 1,6 CM. Nel caso del campione trattati, la deflessione riduce a 0,6 cm. Ulteriore rigorosa quantificazione del processo di indurimento è anche possibile. Ad esempio, una spiegazione meccanicistica di questo processo in termini di aumento della resistenza a taglio, picco di stress di rotazione e angoli dilatanza è stato proposto da Tagliaferri 25 et. al attraverso imaging a raggi X e la correlazione di immagini digitali.
Figura 1. Lo schema del protocollo cultura intera rappresentato come un algoritmico schematica. Per cominciare, Tris-buffer e la soluzione di agar è poured in una capsula di Petri. Una volta piastra di agar è pronto, è striata con una punta infestato con i batteri. La piastra striato è incubata a crescere singole colonie. Una delle singole colonie viene trasferito in un pallone media e incubate di nuovo. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Le celle ei precipitati (A) Le cellule nel mezzo di coltura confinato all'interno di un cavo provetta per deselezionare osservabile precipitazione chimica (dopo 5 - 7 giorni). Che si stabilisce in basso ed è visibile ad occhio nudo. (B) Popolazione di batteri immobilizzati su una superficie visto sotto a contrasto di fase. Singole cellule a forma di bastoncino (bacilli, etichettato SP) possono essere visti chiaramente (un paio di loro evidenziato dalle frecce). Immagine (C) SEM del precipitato bianco che mostra entrambe le cellule (SP) e cristalli (CC). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. I Cristalli e loro caratterizzazione. Immagine al microscopio (A) elettronica a scansione del precipitato essiccato. cristalli individuali e linee di scissione associati sono chiaramente visibili. (B) X-Ray Photo-elettroni Spectroscopy (XPS) grafico del precipitato chimica; picchi di spettrometria di massa corrispondente al carbonato di gruppo funzionale rafforzare la possibilità dell'esistenza di calcite. Clicca qui a view una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Un esperimento semi-quantitativa con la spugna bar che servono come prototipo mezzi porosi. (A) e (B) sono campioni freschi secchi non immersi. (C) e (D) sono campioni umidi inzuppato in una soluzione di medio e cellule; essi mostrano un significativo aumento della resistenza del materiale a causa di intasamento dei pori risultanti da calcite precipitazione come visto qui dal ridotto compressione sotto l'azione di un peso costante. campioni non trattati sono naturalmente porose e soffrono massiccia riduzione del volume quando è sottoposto ad un peso 1 kg. I pori far uscire l'aria e il contratto, portando ad una riduzione complessiva in termini di dimensioni. D'altra parte, il campione trattato ha artificialmente acquisito una notevole quantità di rigidità in virtù di intasamento dei pori. Essa dimostra un marcato miglioramento nella forza quando si supporta comodamente lo stesso carico, senza alcuna compressione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Passi critici: Questo manoscritto descrive in dettaglio i protocolli per la coltura di un campione vitale di S. pasteurii. Una volta che la coltura è stato preparato, deve essere opportunamente arricchito. Questo è un passo chiave fondamentale per il successo dell'esperimento, perché un fallimento per fornire l'ambiente chimico adeguato porta a uno scale temporali molto lunghi di precipitazioni o di una completa mancanza della stessa. S. pasteurii è molto sensibile a diverse aziende esterne e deve essere coltivato con un alto grado di cura e precisione per garantire robustezza biochimica e ripetibilità. La portata e dosaggio di arricchimento è ormai noto a dettare la natura chimica delle precipitazioni, per cui devono essere controllati accuratamente pure.
Modifiche / risoluzione dei problemi: Diversi aspetti possono essere modificati con poca varianza risultati finali. Il tenore di germi non deve essere eseguita secondo la tecnica descritta in precedenza (diluizione in serie per °una e Miles Metodo Misra). Qui, la diluizione seriale è stata eseguita su una singola piastra di agar dividendolo in sette regioni accordi disegnati sulla sua superficie inferiore. Questo non è obbligatorio. E 'anche una pratica comune utilizzare una intera piastra di agar per una particolare diluizione preparando una piastra di diffusione. Diluizioni seriali viene eseguita su una serie di piastre di diffusione successivi e quello con un numero numerabile di singole colonie (20 - 200) viene scelto per il calcolo finale. Qualsiasi delle varie altre tecniche di conteggio delle cellule può essere applicato anche qui. Microscopia potrebbe essere eseguita con semplici vetrini o diapositive. Un'unità camera non è affatto obbligatoria.
A volte, i batteri possono non riuscire a formare precipitati. È utile per trasferire una piccola quantità di cultura congelata in un mezzo liquido prima. Striature può essere eseguita dopo la crescita si è verificata nel primo liquido.
Limitazioni: Questa è una tecnica lenta con un number di passaggi, uno che porta ad un altro. Ci sono possibilità notevoli di contaminazione, la contaminazione incrociata e altri difetti culturali in tutte le fasi. cura intenso deve essere mantenuta in ogni momento. Circa 180 mg di precipitato è formato per ml di soluzione di coltura.
Significato: Il presente protocollo descrive in dettaglio tutti i passi necessari per garantire che una cultura del batterio S. pasteurii precipita fedelmente calcite sotto l'influenza di arricchimenti aggiunte esternamente. Sebbene la cultura di questo batterio è di per sé un protocollo consolidata, l'intero processo di arricchimento e quantificazione non è. Questo problema è stato risolto qui.
Applicazioni future: Potrebbe essere possibile modulare opportunamente questo batterio per precipitare in diversi modi, che a sua volta può essere progettato per varie applicazioni a seconda della natura dei precipitati. Si è già detto che viesistono varie incognite rispetto al MICP coinvolge S. pasteurii. Alcune di queste incognite comprendono ruolo della dinamica aggregative di S. pasteurii nel processo MICP, ruolo dell'ambiente microscala 26,27 come effetto di mezzi porosi e flusso di fluido. Un protocollo standardizzato può essere sviluppato che garantisce la precipitazione veloce con una chiara opportunità per l'esecuzione corretta di microscopia multi-mode.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petridish | Fisher Scientific | FB0875712 | Petridishes being used as Agar plate |
| Pyrex Flasks | Fisher Scientific | S63268 | Corning Erlenmeyer |
| Tris-Base | Promega | H5133 | being used to make Tris-Buffer |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture |
| Agar Powder | Sigma-Aldrich | A1296 | microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder |
| Ammonium Sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | for Molecular Biology |
| Yeast extract powder | Sigma-Aldrich | 51475 | |
| Measuring Cylinder | Cole-Parmer | CP08559GC | Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk |
| Analytical Balance | OHAUS | AX124E | being used to measure weight of reagents |
| Autoclave | Brinkmann | 58619000 | |
| Autoclave Tape | VWR | 52428864 | |
| Aluminum Foil | Sigma-Aldrich | Z185140 | being used to seal the flask before placing it in Autoclave |
| Bacterial Stock | Cedarlane | 11859 | -80 °C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No. |
| Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume | Biohit | 725010 | Marketed by VWR under catalog number 14005976 |
| Micropipette Tip | Fisher Scientific | 212772B | Used for scratching Agar plates |
| Incubator | Binder | 80079098 | Microbiology Incubator,BF Series |
| Shaking Incubator | VWR | 14004300 | VWR Signature Benchtop Shaking Incubators |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P7059 | |
| BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device | BD Biosciences | 357590 | Marketed by VWR under catalog number 53106220 |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Being used to seal Agar plates |
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | Enrichment for nutrient medium |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | Enrichment for nutrient medium |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | Enrichment for nutrient medium |
References
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