Abstract
החיידק המסוים תחת החקירה כאן (pasteurii ס) הוא ייחודי ביכולתו, בתנאים המתאימים, כדי לגרום הידרוליזה של האוריאה (ureolysis) ב טבעי סביבות באמצעות הפרשה של באוראז אנזים. תהליך זה של ureolysis, דרך שרשרת של תגובות כימיות, מוביל להיווצרות של משקעי סידן פחם. תופעה זו ידועה בשם מיקרוביולוגי מושרה קלציט רטיבות (MICP). פרוטוקולי התרבות הראויים MICP מפורטים כאן. לבסוף, ניסויים להדמיה תחת מצבים שונים של מיקרוסקופיה בוצעו להבין היבטים שונים של התהליך המשקע. טכניקות כמו מיקרוסקופיה אופטית, מיקרוסקופית אלקטרונים סורק (SEM) ו- X-Ray תמונה אלקטרונים ספקטרוסקופיה (XPS) הועסקו לאפיין את המוצר הסופי כימית. יתר על כן, היכולת של משקעים אלה כדי לסתום נקבוביים בתוך מדיום נקבובי טבעי הודגמה באמצעות ניסוי איכותי שבו ספוגברים שימשו לחקות נקבובית-רשת עם מגוון של סולמות אורך. בר ספוג טבול מדיום התרבות המכיל תאי חיידקיים מתקשה בשל סתימת הנקבוביות שלה הנובעים התהליך המתמשך של משקעים כימיים. בר ספוג מוקשה זה מפגין כוח עליון בהשוואה ברה ספוג שליטה אשר הופך דחוס ולחץ תחת הפעולה של עומס חיצוני מיושם, ואילו הבר המוקשה הוא מסוגל לתמוך המשקל הזהה עם עיוות קטנה.
Introduction
Sporosarcina pasteurii הוא חיידק חיובי גרם מסוגל לשרוד בסביבות בסיסיות מאוד (pH ~ 10) 1 והוא אחד מיני חיידקים שיכולים להיות סוכן סיבתי של תופעה הנקראת מיקרוביולוגי מושרת קלציט רטיבות (MICP) 2-4. MICP הוא תהליך שבו משקעים של סידן פחמתי הוא המושרה על ידי חיידקים מסוימים בתנאים סביבתיים מתאימים. ס pasteurii מקבלת משנה חשיבות בשנים האחרונות בשל זיהויו כסוכן האפשר גרימת בהיקפים משמעותיים של MICP בתנאים מסוימים. אפשרות זו נובעת מהעובדה ש יש pasteurii את היכולת הייחודית להפריש כמויות עצומות של באוראז האנזים. אנזים זה פועל כזרז, קידום תמוגה מואץ של אוריאה (תרכובת ביוכימית טבעית עם אספקה נרחבת בשפע) בנוכחות של מולקולות מים. דרך מפל של תגובות, תהליך זה אולטימטיביly מוביל לדור של יונים טעונים שלילית קרבונט. יונים אלה, בתורם, מגיב עם יוני מתכת חיוביים כמו הסיד ולבסוף ליצירת משקעים של סידן פחם (קלציט); ומכאן תווית MICP 5-9.
תהליך MICP כבר ידוע ולמד במשך כמה עשורים 10,11. במהלך השנים האחרונות, MICP נחקרה על מגוון רחב של הנדסה ויישומים סביבתיים כולל בנייה ירוקה מלמטה למעלה 12, שיפור של מבנים בקנה מידה גדול 13,14 ו קיבוע פחמן ואחסון 15,16.
לדוגמה, et 17 Cunnigham. אל עצב כור זרימת טמפרטורה מתונה בלחץ גבוה המכיל גרעין חול ברא. הכור היה מחוסן עם החיידקים ס fridgidimarina ובתנאים של הזרקת פחמן דו חמצני סופר קריטי בלחץ גבוה, הצטברות מסיבית של ביומסה בתוך הכרך הנקבוביumes נצפתה, אשר הובילה יותר מ -95% הפחתה חדיר. 18 Jonkers ו Schlangen בחן את ההשפעה של זנים מיוחדים של חיידקים על תהליך ריפוי עצמי בבטון. מים חיצוניים מועברים לרשת הנקבובית נכנסת הדרך הנקבובית השטח צפוי להפעיל את החיידקים הרדומים אשר בתורו לעזור חוזק מבנים באמצעות MICP. טובלר 19 et al. השוו את פעילות ureolytic של ס pasteurii עם מיקרוקוסמוס ureolytic תהום הילידים בתנאים לטובת MCIP בקנה מידה גדול ומצא כי ס יש pasteurii יכולת עקבית כדי לשפר ממטרי קלציט גם כאשר קהילות ילידים חסרות פעילות באוראז מוקדמת. Et.al 20 מורטנסן חקרו את ההשפעות של גורמים חיצוניים כמו סוג הקרקע, ריכוז של אמוניום כלוריד, מליחות, ריכוז חמצן תמוגה של תאים על MICP. ההפגנה שלהם כי תהליך הטיפול הביולוגי הוא מאוד חזק עם שו"תect כדי וריאציה רחבה בחלל פרמטר ממחיש את הכושר של תהליך זה עבור יישומי משיקום בקנה מידה גדולה שונים הניתנים תהליך העשרה ראוי לחזק את החיידקים נעשה. Et 21 פיליפס. אל תוכנן ניסויים כדי ללמוד את השינויים בחדירות וכוח של טור חול גרעין חול לאחר שהוזרק לו ס תרבויות pasteurii. הם גילו כי בעוד חדירות ירד 2 - 4 פעמים ואילו הכוח לשברים שלוש פעמים.
Pasteurii ס ותפקידה MICP הם נושאים של מחקר פעיל וכמה סוגיות הנוגעות למנגנון של משקעים כימיים עדיין אינם מובנים במלואם. לאור זאת, חשוב מאוד להיות קבוצה של פרוטוקולים סטנדרטיים עקביים במדויק תרבות מניה מועשרת נאות ס pasteurii להשיג MICP. כאן, אנו מתארים פרוטוקול קפדני שיבטיח דירות ויכולת שחזור. ma זהnuscript מתאר את הפרוטוקולים המפורטים culturing ס pasteurii ובאופן הולם להעשיר את המדיום תרבות להשרות משקעים. התהליך הוא נחקר באמצעות טכניקות מיקרוסקופיות שונות כגון מיקרוסקופי אלקטרונים אופטיים סורק (SEM) ו- X-Ray תמונת אלקטרוני ספקטרוסקופיה (XPS). ההתמקדות של כתב היד היא על התהליך של MICP. נהלים כמו SEM ו SIMS, להיות פרוטוקולים סטנדרטיים ומבוססים, אינם מתוארים בנפרד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: בצע את פרוטוקולי הניסוי לפי הסדר המתואר להלן. פרוטוקול תרבית החיידקים נדון בסעיף 1 (ראה גם איור 1). סעיף 2 מתאר את פרוטוקול להעשרת התרבות בינוני באמצעות תוספים חיצוניים. סעיף 3 מתאר את הפרוטוקולים למיקרוסקופיה במצב מרובה. משקולות של כל הרכיבים הבודדים ניתן למדוד באמצעות איזון אנליטיים. נפח של כל פתרון ניתן למדוד באמצעות גליל נפח.
הערה: פרוטוקולי בטיחות ביולוגי פרופר חייבת להיות במעקב במשך סעיפי 1 - 2. התייעץ במשרד הבטיחות המוסדי לפרטים.
1. תרבית חיידקים
- התרבות חיידקים - אגר פלייט הכנה בינוני
- להרכיב ציוד וחומרי גלם כגון צלחות פטרי, בקבוק, טריס-בסיס, HCl, אגר, מי Millipore, pH מטר etc.Sterilize כל המכולות על ידי מעוקר ב 121 ° C לפני השימוש.
- כן 1 ליטר של 0.13 בתמיסה מימית M של טריס-חיץ על ידי ערבוב 15.75 גרם טריס בסיס עם 1 ליטר מים Millipore. כדי להוריד את רמת ה- pH של התמיסה המקורית (pH 10.4) להוסיף 2,800 μl של HCl (ריכוז 50%). בדוק ברציפות באמצעות מטר pH להגדיר pH = 9.
- מחלקים את הפתרון למאגר 1 L לשני חלקים כדלקמן:
- קח 800 מ"ל של פתרון זה. מחלקים אותו באופן שווה לשני חלקים של 400 מ"ל כל אחת. ממיסים 8 גרם (NH 4) 2 SO 4 על פתרון אחד ותמצית שמרים 16 גרם לפתרון אחרים.
- קח את הסכום הנותר (200 מ"ל של) פתרון ומחלקים אותו שוב לשני חלקים של 100 מ"ל כל אחת. מערבבים 2 גרם (NH 4) 2 SO 4 לאחד. הוסף 4 גרם תמצית שמרים 4 גרם אגר לקצה השני.
- חיטוי 4 הפתרונים בנפרד לאחר גלישת צלוחיות בהתאמה באל רדיד דבק קלטות חיטוי.
הערה: אם יחידת החיטוי המעבדתיים בשימוש, הנפח צריך להיות מוגדר 500 מיליליטר (טמפרטורה ולחץ אוטומטically שצוין כפונקציה של נפח). - לאחר שלקחו אותם מן החיטוי, להגדיר הפתרונות שני 400 מ"ל בצד צעד 1.3.1 (להלן). מערבבים הפתרונות שני 100 מ"ל יש פתרון 200 מ"ל. יוצקים את התערובת לתוך 10 - 12 צלחות פטרי.
- תרבות חיידקים - צלחת אגרה הכנת דוגמאות
- הסר את המניה חיידקי מהמקפיא (-80 ° C) ולאפשר לו להפשיר. לאחר ההפשרה כראוי, למקם את מניית חיידקי הצלחת אגרה בתוך ברדס biosafety.
- בחר את micropipette של ממד הקטן זמין (0.5 - 10 μl הן בחירה טובה) כדי לפשוט את הקצה עם מניית Sporosarcina pasteurii. Streak צלחת אגר עם קצה micropipette. מניח את הצלחת אגרה המפוספסת בתוך חממה שאינה רועדת ב 31 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
- אחרי 48 שעות, להסיר את הצלחת מן החממה חזותית לבחון לקיומו של מושבות אחת. אם אין מושבות אחת, ולאחר מכן למקם אותו tהוא חמם עוד 24 שעות.
- חזור על התהליך עד מושבות אחת מזוהות. אין לעבור 7 ימי משפט.
הערה: אם מושבות אחת אינה מופיעות אפילו אחרי שבוע, אז הוא הגיע למסקנה כי הצעדים לא הקפידו כראוי את כל התהליך יש לחזור משלב 1.
- תרבות חיידקים - מדגם סופי כנה
- מערבבים את שני פתרונות 400 מ"ל (טריס חיץ + (NH 4) 2 SO 4 ו טריס חיץ + תמצית שמרים (1.5.1) יחד כדי להשיג 800 מ"ל פתרון. העבר 125 מ"ל של פתרון זה לתוך הבקבוק.
- בצע בדיקה ויזואלית של פני השטח של הצלחת אגרה לזהות אזורים עם ריכוז גבוה של מושבות אחת. בעדינות דחיפה ולשבור אחת המושבות עם טיפ micropipette.
- טובלים אותו קצה micropipette לתוך 125 מ"ל בבקבוק ומערבבים אותו ביסודיות כדי להבטיח כי מספר מספיק של תאים לכפל חזקים מקבלים הועברו. מניחים את הבקבוק בתוך חממה רועד ב 150 סל"ד, 30 מעלות צלזיוס למשך 2 - 3 ימים. לאחר 2 - 3 ימים, להסיר את הבקבוק מן החממה.
- תרבות חיידקים - ספירת כדוריות סופית
- בצע דילול סדרתי של הפתרון לתרבות הלא-מדולל באמצעות PBS להשיג דילול של לפחות עשרה מיליון (10 -7) כדי להבטיח מופיעים מושבות אחת מנייה. צייר שבעה קווים מקבילים במרחק שווה על אחד-הצלחות אגרו.
- עושים זאת על ידי ציור קווים נועזים על המשטח התחתון של צלחת פטרי, מספיק בולט כדי להיות גלוי מלמעלה. ירידה של 3 טיפות קטנות של פתרון שאינו מדולל לתוך קטע אחד. הוסף 1 מ"ל של פתרון שאינו מדולל ל 9 מ"ל של בופר פוספט (PBS) כדי להשיג דילול 1:10.
- קח aliquot קטן (~ 0.1 מ"ל) של פתרון בדילול החדש הזה עם טפטפת ושחרר 3 יותר טיפות קטנות על הקטע הבא. מעביר את הפתרון החדש מדולל בבקבוק חדש ועשר פעמים מדוללות יותר (10x) על ידיהוספת PBS. זה מוריד את הדילול עד 10 -2 או 1: 100.
- השתמש באפשרות זו 1: פתרון 100 במגזר הבא. חזור על פעולה זו הוא לעבד עם כמויות קטנות של פתרונות בדילול טרי באמצעות העברתם ברציפות צלוחיות חדשים דילול ברציפות פי עשרה (10x) בד בבד עם PBS להשיג יותר דגימות לדלל יותר מ 10 -3 או 1: 1,000 כל הדרך עד 10 -7 או 1:10 מיליון לתוך הקטע האחרון.
- בצע יחידת קולוני-פורמינג (CFU) ספירת צלחת לספור את מספר התאים הנמצאים הצלחת אגרה לאחר דוגרי צלחת 1 - 2 ימים על 31 מעלות צלזיוס. זה נותן מדד כמותי של ספירת החיידקים במדגם החי.
הערה: ערך CFU נמדד בהתבסס על היכולת של המערכת כדי להצמיח מושבות בתנאים הספציפיים של מזין בינוני, טמפרטורה וזמן בהנחה שכל מושבה הוא נפרד שנוסד על ידי תא מיקרוביאלי יחיד קיימא. - חותםצלחות פטרי עם עצמי איטום סרט ולאחסן פריטים שנותרו במקרר לשימוש עתידי.
- בצע דילול סדרתי של הפתרון לתרבות הלא-מדולל באמצעות PBS להשיג דילול של לפחות עשרה מיליון (10 -7) כדי להבטיח מופיעים מושבות אחת מנייה. צייר שבעה קווים מקבילים במרחק שווה על אחד-הצלחות אגרו.
פרוטוקול 2. להעשרה של מזון כדי להאיץ רטיבות
- העברה 9 מיליליטר של נוזל התרבות המוכן (תאים + בינוני) לתוך צינורות צנטריפוגות כמה מעוקרים, כל אחד 10 מיליליטר נפח.
- כן פתרון מניות 100 מיליליטר של ההעשרה החיצונית מורכב מארבעת מרכיבים בריכוזים הבאים מדיום חדש: אוריאה: 2 g / L, אמוניום כלוריד: 1 גר '/ ל, סודיום ביקרבונט: 212 מ"ג / L, כלוריד סידן: 280 מ"ג / L. בזהירות למדוד את כל המרכיבים באמצעות איזון אנליטיים לערבב את כל אבל אוריאה עם מדיום חדש בכוס ומניחים החיטוי (121 ° C, 15 psi, 15 דק ').
- בעקבות החיטוי, לערבב את הסכום הדרוש של אוריאה (2 מ"ג) עם 1 מ"ל של מדיום חדש ולהעביר באמצעות מזרק מצויד עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר כדי להשלים את תהליך ההעשרה.
- הוסף 1מ"ל של מדיום העשרה זה עם ותוספות צינורות צנטריפוגה מעוקר המכיל 9 מ"ל של נוזל תרבות מוכן (תאים + בינוני) (ראה שלב 2.1).
הערה: מבין כל המרכיבים הללו, אוריאה להיות מתכלה בטמפרטורות גבוהות, לא ניתן לעקר ב החיטוי. לפיכך, לאחר הרכיבים האחרים כבר autoclaved (121 ° C, 15 psi, 15 דק '), אוריאה מתווסף האחרון דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר.
- וורטקס צינור אחד באמצעות vortexer מכני ביסודיות. מניח את הנוזלים המועשרים (תאים + תוספות + בינוניות) חממה שאינה רועדת ב 30 ° C. ניטור כל היחידות באופן קבוע עבור חניכה של משקעים. באמצעות מיקרוסקופ אור, להתחיל תצפיות מיקרוסקופיות פעם התפרצות של משקעים מזוהה עם בעין בלתי מזוינת. זה בדרך כלל בין 30 ל - 36 שעות לאחר תחילת הניסויים.
3. פרוטוקול למיקרוסקופיה Multi-mode
- העבר נפח קטן (~ 1 מ"ל) של נוזל אל-מגניפיקט גבוההיון מיקרוסקופיה-תאי במערכת coverglass לבצע תצפיות ראשוניות עם מצב שדה בהיר. כדי להתחיל עם, להתחיל כל התצפיות עם ההגדלה הנמוכה ביותר (4X). אשר מספקת שטח רחב של כיסויים ומכאן מידע הגלובלי על חלוקת משקעים.
- בחר אזורים מסוימים עם כמויות משמעותיות של משקעים זום (20X, 40X, 60X) על ידי הגדלת הגדלה בהדרגה.
הערה: מאחר שאי אפשר לפתור את התאים כמו שצריך שעשויים מהחומרים פולימריים התאי (EPS) תחת בהיר שדה (בשל מדדים שבירים קרובים מאוד), לעבור על מצב שלב בניגוד לפי צורך. במצב זה, רק את קווי המתאר של קרום התא (להיות בפאזה שונה מאשר התא בתפזורת) גלויים, ובכך לאפשר בידול ויזואלי. - לבסוף, להכתים כמה תאים עם כתם Live / Dead באופן סלקטיבי צבענים הרכיבים לחיות כפי ירוק ואילו צביעת המרכיבים מת באדום. עיין פרוטוקולים סטנדרטיים 28 </ Sup>.
- הפעל מצב פלורסנט להבחין כראוי בין האזורים האדומים וירוקים. האדום (קובייה מסננת אדומה עם גל עירור של 540 - 580 ננומטר, מראה Dichroic של 595 ננומטר גדר מסננת של 600 - 660 ננומטר) וגרין (קוביית מסנן GFP הארוך לעבור הירוק עם גל עירור של 440 - 480 ננומטר, מראה Dichroic של 505 ננומטר הגדר מסנן של 510 ננומטר) מסנן קוביות משמשים כדי להקל micrographs ניאון.
- לאחר שכל נתוני המצב מרובה נאספו, בחרו את התמונות הטובות ביותר ואת הכיסוי ידני (brightfield פרט, שלבו בניגוד ותמונות ניאון) כדי להשיג את הניגוד הטוב ביותר האפשרי ובהירות.
- בצע SEM על הדגימות המוצקות היבשות להבין מבנים גבישיים. זהו הליך ומבוסס סטנדרטי. 22 בצעו XPS לזהות חתימה כימית של קבוצות פונקציונליות (קרבונטים). זהו הליך ומבוסס סטנדרטי גם כן. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ס pasteurii להיות 24 alkaliphile יכול לשרוד בתנאים קשים יחסית. כאשר פרוטוקול התרבות הנ"ל מלווה, וס ' pasteurii הוא גדל בתוך חדר, החיידקים מובילים המשקע של סידן פחם לאורך הזמן (איור 2 א). איור 2 (ב) מראה תמונה מיקרוסקופית אופטית שלב בניגוד מאוכלוסיית תא החיידק בתוך המדיום לתרבות. תאים בודדים ניתן להבחין בבירור, עם צורות מוט דמוי מאפיין של מעמד חיידק חיידקים די ברורים. חצים חומים קטנים שימשו כדי להדגיש במיוחד שני תאים בודדים. משקעים של סידן פחמתי מתרחשת על פני תקופה של מספר ימים. איור 2 א מראה כיצד משקעים להתיישב בחלק התחתון של צינור צנטריפוגות. ניתן לראות זאת בבירור בעין בלתי מזוינת כאבקה לבנבן יושב מתחת במדיום נוזלי עםניגוד חריף בצבע בניגוד הנוזל הצהבהב. הנוזל הצהבהב מכיל חיידקים מושעים במדיום תרבותם. המשקעים הלבנים נאספו ומיובשים מאוחר צלמו באמצעות SEM (איור 2 ג).
באיור 3 א, קווי המחשוף המוגדרים היטב, סימן היכר של crystallinity, ניתן לזהות בקלות. איור 3 ב מציג את גרף XPS עבור אותו המדגם לאפיון. פסגות המתאימות לנקודת סיכת קבוצות קרבונט קיומו של סידן פחם. לכן, איור 3A ו- B יחד באופן חד משמעי להוכיח את הדור של קלציט כמו הכימי זרז.
ניסוי ואיכותי כדי להעריך את היכולת של MICP כדי לשנות את המאפיינים של בתווך נקבובי. לשם כך, ביצענו ניסוי מעורבים ספוגים אשר צפויים לחקות נקבוביבינוני עם מגוון של סולמות אורך של מבנים הנקבוביות, כפי שניתן למצוא מבנה טבעי טיפוסי. בר ספוג (מר נקי, P & G) היה שקוע בפתרון של ס pasteurii לתקופה של 7 ימים ולאחר מכן מיובש. ספוג לאחר חשיפה ממושכת לתהליך MICP מוקשה ומוצג משופרת חוזק לחיצה. זה מתואר באיור 4 הספוג, לפני הטבילה (במקרה שליטה), הראה דחיסה משמעותית כאשר נתון משקל 1 ק"ג (איור 4 א - ב).. מצד השני, אחרי שהייתי חשוף טבילת ס פתרון pasteurii, שספג הנקבוביות סתימה בשל משקעי קלציט שהתקבלו. זה הוביל לעלייה מסיבית כוח הנובע גישור של נקבוביות, ובהמשך לאפשר לבר לתמוך עומס 1 ק"ג מבלי לאפשר דחיסה משמעותית (4C איור - D).
רעיון וכמותיותניתן להשיג בכל הקשור לתהליך התקשות באמצעות מדידות של סטיה גובה של הבר טעון. המדגם ספוג המקורי הוא בר מלבני עם גובה של 4.5 ס"מ. הסטייה של דגימת השליטה, קרובה מאוד לנקודת יישום של עומס, היא כ -1.6 סנטימטר. במקרה של דגימת מטופלים, הסטייה מקטינה ל 0.6 סנטימטר. בהמשך כימות הקפדני של תהליך ההתקשות הוא גם אפשרי. לדוגמה, הסבר מכניסטי של תהליך זה במונחים של הגדלת כוח גזירה, מתח deviatoric השיא וזוויות dilatancy הוצע על ידי 25 et Tagliaferri. אל דרך הדמית רנטגן מתאם תמונה דיגיטלית.
איור 1. מתאר לפרוטוקול התרבות המיוצגת כקובץ אלגוריתמי סכמטי. כדי להתחיל עם, טריס-חיץ פתרון אגר הוא poureד בצלחת פטרי. לאחר הצלחת אגרה מוכנה, הוא מפוספס עם טיפ שורץ החיידקים. הצלחת המפוספסת היא מודגרות לגדול מושבות אחת. אחד המושבות האחת מועבר בבקבוק תקשורת וטופח שוב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תאים ואת המשקעים (א) התאים במדיום התרבות הכלוא יחדיו להוביל צינור צנטריפוגות כדי לנקות משקעים כימיים ניתן לצפייה (לאחר 5 - 7 ימים). כי נרגע בתחתית גלויה לעין בלתי המזוינת. (ב) אוכלוסייה של חיידקים משותקים על משטח לראות תחת-בניגוד שלב. תאי מוט בצורה אישיים (חיידקים, שכותרתו Sp) ניתן לראות בבירור (כמה מהם מודגשים על ידי חיצים). (C) תמונה SEM של המשקע הלבן מראה תאים הן (Sp) וקריסטלים (CC). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. גבישים אפיונם. (א) תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של המשקע יבשים. גבישים בודדים וקווי מחשוף הקשורים גלויים לעין. (ב) X-Ray ספקטרוסקופיה תמונת האלקטרונים (XPS) גרף של המשקע הכימי; פסגות ספקטרומטריית מסה מתאימות קרבונט קבוצה פונקציונלית לחזק את אפשרות קיומו של קלציט. נא ללחוץ כאן VIEW גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. ניסוי וכמותיות עם ברים ספוגים הגשה כמו Prototype נקבובי מדיה. (א) ו- (ב) הם דוגמאות יבשות טריות לא טבלו. (ג) ו- (ד) הם דוגמאות רטובות נוטפות פתרון של מדיום ותאי; הם מפגינים עלייה משמעותית התנגדות חומר בשל סתימת הנקבוביות הנובע ממטרי קלציט כפי שניתן לראות כאן, כתוצאה מלחץ מופחת תחת הפעולה של משקל קבוע. דגימות מטופל הם נקבוביות טבעי ולסבול הפחתה מסיבית נפח כאשר נתון משקל 1 קילו. הנקבוביות לסחוט באוויר החוזה, שמוביל הפחתה כוללת בגודל. מצד השני, במדגם המטופלים צבר כמות משמעותית מלאכותי של קשיחות מכוח הסתימה נקבובית. זה מדגים שיפור ניכר בחוזק כשזה בנוחות תומך אותו העומס ללא דחיסה כלשהי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קריטי שלבים: כתב יד זה מתאר בפירוט את הפרוטוקולים עבור culturing מדגם קיימא של ס pasteurii. לאחר בתרבות כבר הכינה, זה חייב להיות מועשר כראוי. זהו צעד מפתח חיוני להצלחת הניסוי בגלל חוסר היכולת לספק את הסביבה הכימית הנכונה מוביל או קשקשי זמן רבים מאוד של משקעים או חוסר מוחלט ממנו. ס pasteurii הוא די רגיש לכמה גורמי חוץ חייב להיות מתורבת עם רמה גבוהה של טיפול ודיוק כדי להבטיח יציבות ואת הדירות ביוכימיים. ההיקף והמינון של העשרה כיום ידוע להכתיב את האופי הכימי של משקעים ולכן חייבים להיות מבוקר במדויק גם כן.
שינויים / פתרון בעיות: היבטים אחדים עשויים להיות שונים עם שונות מעט-תוצאות סופיות. ספירת הצלחת לא צריכה להתבצע על פי הטכניקה המתוארת לעיל (דילול הסדרה לכל הדואר מיילס מיסרה שיטה). הנה, דילול הסדרה שבוצע על צלחת אגרה יחיד על ידי חלוקה אותו לשבעה אזורים לפי אקורדים שהונחו על פני התחתונה שלה. זו אינה חובה. זה גם מנהג נפוץ להשתמש צלחת אגרה כולו עבור דילול מסוים על ידי הכנת צלחת התפשטות. דילול סדרתי מבוצע על שורה של הצלחות רצופות התפשטות ואת אחד עם מספר מנייה של מושבות אחת (20 - 200) נבחר עבור החישוב הסופי. כל טכניקות ספירת תאים השונות אחרות עשויים להיות מיושמים גם כאן. מיקרוסקופי ניתן לבצע גם עם מכסה מחליק פשוט או שקופיות. יחידה קאמרית היא בכלל לא חובה.
לפעמים, החיידק עלול להיכשל כדי ליצור משקעים. כדאי להעביר כמות קטנה של התרבות קפואה לתוך מדיום נוזלי ראשון. קווים מפוספסים עשויים להתבצע לאחר הצמיחה שחלה הראשון הנוזלי.
מגבלות: זוהי טכניקה איטית עם נוmber של צעדים, אחד מוביל למשנהו. ישנם סיכויים משמעותיים של זיהום, זיהום צולבות ופגמי תרבות אחרים בכלל הצעדים. חייב להישמר טיפול אינטנסיבי בכל העת. בסביבות 180 מ"ג של משקע נוצר לכל מיליליטר של תמיסת התרבות.
המשמעות: הפרוטוקול הנוכחי מתאר בפירוט את כל הצעדים הדרושים כדי להבטיח כי תרבות של החיידק S. pasteurii משקעים קלציט בנאמנות בהשפעת enrichments הוסיף חיצוני. למרות התרבות של החיידק הזה עצמו הוא פרוטוקול ומבוסס, את כל התהליך של עשיית עושר וכימות אינו. בעיה זו טופלה כאן.
יישומים עתידיים: זה עשוי להיות אפשרי כראוי לווסת החיידק הזה כדי לזרז באופנים שונים אשר בתורו יכול להיות מהונדס ליישומים שונים בהתאם לאופי של משקעים. זה הוזכר בעבר כי שםקיימים מספר אלמונים ביחס MICP מעורב ס pasteurii. חלק אלמונים אלה כוללים תפקיד הדינמיקה המצרפית של ס pasteurii בתהליך MICP, תפקידה של הסביבה microscale 26,27 כגון השפעת התקשורת נקבובי זרימת הנוזל. פרוטוקול סטנדרטי ניתן לפתח מבטיח ממטרים מהר עם הזדמנות ברורה לביצוע מיקרוסקופיה מצב המרובה נכון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petridish | Fisher Scientific | FB0875712 | Petridishes being used as Agar plate |
| Pyrex Flasks | Fisher Scientific | S63268 | Corning Erlenmeyer |
| Tris-Base | Promega | H5133 | being used to make Tris-Buffer |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture |
| Agar Powder | Sigma-Aldrich | A1296 | microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder |
| Ammonium Sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | for Molecular Biology |
| Yeast extract powder | Sigma-Aldrich | 51475 | |
| Measuring Cylinder | Cole-Parmer | CP08559GC | Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk |
| Analytical Balance | OHAUS | AX124E | being used to measure weight of reagents |
| Autoclave | Brinkmann | 58619000 | |
| Autoclave Tape | VWR | 52428864 | |
| Aluminum Foil | Sigma-Aldrich | Z185140 | being used to seal the flask before placing it in Autoclave |
| Bacterial Stock | Cedarlane | 11859 | -80 °C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No. |
| Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume | Biohit | 725010 | Marketed by VWR under catalog number 14005976 |
| Micropipette Tip | Fisher Scientific | 212772B | Used for scratching Agar plates |
| Incubator | Binder | 80079098 | Microbiology Incubator,BF Series |
| Shaking Incubator | VWR | 14004300 | VWR Signature Benchtop Shaking Incubators |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P7059 | |
| BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device | BD Biosciences | 357590 | Marketed by VWR under catalog number 53106220 |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Being used to seal Agar plates |
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | Enrichment for nutrient medium |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | Enrichment for nutrient medium |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | Enrichment for nutrient medium |
References
- Gibson, T. An investigation of the Bacillus pasteurii group. Journal of Bacteriology. 28, 491-502 (1934).
- Greenfield, L. J. Metabolism and concentration of calcium and magnesium and precipitation of calcium carbonate by a marine bacterium. Annals of the New York Academy of Sciences. 109, 23-45 (1963).
- Phillips, A. J. Engineered applications of ureolytic biomineralization: a review. Biofouling. 29, 715-733 (2013).
- Dhami, N. K., et al. Biomineralization of calcium carbonates and their engineered applications: a review. Frontiers in microbiology. 4, 314 (2013).
- Cuthbert, M. O., et al. Controls on the rate of ureolysis and the morphology of carbonate precipitated by S. Pasteurii biofilms and limits due to bacterial encapsulation. Ecological Engineering. 41, 32-40 (2012).
- Okwadha, G. D., et al. Optimum conditions for microbial carbonate precipitation. Chemosphere. 81, 1143-1148 (2010).
- Stocks-Fischer, S., et al. Microbiological precipitation of CaCO3. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1563-1571 (1999).
- Lauchnor, E. G., et al. Bacterially induced calcium carbonate precipitation and strontium coprecipitation in a porous media flow system. Environmental science & technology. 47, 1557-1564 (2013).
- Al Qabany, A., et al. Factors Affecting Efficiency of Microbially Induced Calcite Precipitation. Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering. 138, 992-1001 (2012).
- Morita, R. Y. Calcite precipitation by marine bacteria. Geomicrobiology Journal. 2, 63-82 (2009).
- Chafetz, H. S. Marine peloids: A product of bacterially induced carbonate precipitation. Journal of Sedimentary Petrology. 56, 812-817 (1986).
- Biomason.com. , Available from: http://www.biomason.com (2015).
- Whiffin, V. S. Microbial CaCO3 precipitation for the production of biocement. , Murdoch University. PhD thesis (2004).
- Paassen, L. A., et al. Scale up of BioGrout: a biological ground reinforcement method. Proceedings of the 17th International Conference on Soil Mechanics and Geotechnical Engineering. , 2328-2333 (2009).
- Cunningham, A. B., et al. Microbially enhanced geologic containment of sequestered supercritical CO2. Energy Procedia. 1, 3245-3252 (2009).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Cunningham, A. B., et al. Reducing the risk of well bore leakage of CO2 using engineered biomineralization barriers. Energy Procedia. 4, 5178-5185 (2011).
- Jonkers, H. M., et al. Application of bacteria as self-healing agent for the development of sustainable concrete. Ecological Engineering. 36, 230-235 (2010).
- Tobler, D. J., et al. Transport of Sporosarcina pasteurii in sandstone and its significance for subsurface engineering technologies. Applied Geochemistry. 42, 38-44 (2014).
- Mortensen, B. M., et al. Effects of environmental factors on microbial induced calcium carbonate precipitation. Journal of applied microbiology. 111, 338-349 (2011).
- Phillips, A. J., et al. Potential CO2 leakage reduction through biofilm-induced calcium carbonate precipitation. Environmental science & technology. 47, 142-149 (2013).
- Robbins, R. Scanning Electron Microscope Operation. , Available from: http://www.utdallas.edu/~rar011300/SEM/Scanning%20Electron%20Microscope%20Operation.pdf (2010).
- vander Heide, P. X-ray Photoelectron Spectroscopy: An introduction to Principles and Practices. , John Wiley & Sons. (2011).
- Wiley, W. R., et al. Requirement of an alkaline pH and ammonia for substrate oxidation by Bacillus pasteurii. Journal of Bacteriology. 84, (1962).
- Tagliaferri, F., et al. Observing strain localisation processes in bio-cemented sand using x-ray imaging. Granular Matter. 13, 247-250 (2011).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluidics and Nanofluidics. 14, 895-902 (2012).
- Valiei, A., et al. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a chip. 12, 5133-5137 (2012).
- LIVE/DEAD Bacterial Viability kit, Two-color bacterial viability assay. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf, https://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/protocols/live-dead-baclight-bacterial-viability-protocol.html (2004).
