Abstract
Den særlige bakterie under efterforskning her (S. pasteurii) er enestående i sin evne, under de rette betingelser, for at fremkalde hydrolyse af urea (ureolysis) i naturligt forekommende miljøer gennem sekretion af et enzym urease. Denne proces med ureolysis, via en kæde af kemiske reaktioner, fører til dannelsen af calciumcarbonat præcipitater. Dette er kendt som Mikrobiologisk Induced Calcite Nedbør (MICP). De korrekte kultur protokoller for MICP er beskrevet her. Endelig blev udført visualisering eksperimenter under forskellige former for mikroskopi til at forstå forskellige aspekter af udfældningsprocessen. Teknikker som optisk mikroskopi blev Scanning Electron Microscopy (SEM) og X-Ray Foto-elektron spektroskopi (XPS) ansat til kemisk karakterisere slutproduktet. Endvidere blev evnen af disse præcipitater at tilstoppe porerne inde i en naturlig porøst medium dokumenteres ved en kvalitativ eksperiment, hvor svampbarer blev anvendt til at efterligne en pore-netværk med en række længdeskalaer. En svamp bar dyppet i dyrkningsmediet indeholdende de bakterielle celler hærder på grund af tilstopning af dets porer som følge af den kontinuerlige proces med kemisk fældning. Dette hærdede svamp bar udviser overlegen styrke, når sammenlignet med en kontrol svamp bar, som bliver komprimeret og presset under indvirkning af en påført ekstern belastning, mens den hærdede bar er i stand til at understøtte den samme vægt med lille deformation.
Introduction
Sporosarcina pasteurii er en gram-positiv bakterie i stand til at overleve i stærkt alkaliske miljøer (pH ~ 10) 1 og er en af de bakterielle arter, der kan blive en agens af et fænomen kaldet Mikrobiologisk Induced Calcit Precipitation (MICP) 2-4. MICP er en fremgangsmåde, hvor udfældning af calciumcarbonat induceres af visse mikrober under egnede miljøbetingelser. S. pasteurii har antaget betydning i de seneste år på grund af sin identifikation som et muligt middel til at fremkalde betydelige mængder af MICP under visse betingelser. Denne mulighed skyldes, at S. pasteurii har den unikke evne til at udskille rigelige mængder af enzymet urease. Dette enzym fungerer som en katalysator, som fremmer en fremskyndet lysis af urinstof (et naturligt forekommende biokemisk forbindelse med udbredt og rigelig forsyning) i nærvær af vandmolekyler. Gennem en kaskade af reaktioner, denne proces ultimatively fører til generering af negativt ladede carbonationer. Disse ioner, til gengæld reagerer med positive metalioner såsom calcium til endelig danner præcipitater af calciumcarbonat (calcit); dermed etiketten MICP 5-9.
Processen med MICP har været kendt og undersøgt i flere årtier 10,11. I de seneste år har MICP blevet undersøgt for en bred vifte af teknik og miljø applikationer, herunder bottom-up grønt byggeri 12, forbedring af store strukturer 13,14 og kulstofbinding og opbevaring 15,16.
F.eks Cunnigham 17 et. al designet en højtryks- moderat temperatur flow reaktor indeholdende en Berea sandsten kerne. Reaktoren blev podet med bakterier S. fridgidimarina og under betingelser med højt tryk superkritisk carbondioxid injektion, en massiv akkumulering af biomasse inde i pore volmængderne, blev observeret, hvilket førte til mere end 95% reduktion i permeabilitet. Jonkers og Schlangen 18 undersøgte effekten af visse særlige stammer af bakterier på selvhelende proces i beton. Ekstern vand transporteres ind porenetværket ind gennem overfladeporerne forventes at aktivere de hvilende bakterier, som igen hjælper strukturel styrke via MICP. Tobler 19 et al. har sammenlignet ureolytiska aktivitet af S. pasteurii med en indfødt grundvand ureolytiska mikrokosmos under forhold favoriserer store MCIP og fandt, at S. pasteurii har en konsekvent evne til at forbedre calcit nedbør, selv når de oprindelige samfund manglede forudgående urease aktivitet. Mortensen 20 et.al har studeret virkningerne af eksterne faktorer som jordtype, koncentration af ammoniumchlorid, saltholdighed, oxygenkoncentration og lysis af celler på MICP. Deres demonstration, at den biologiske behandlingsproces er meget robust med hhvect til en bred variation i parameter rummet underbygger egnethed denne proces for forskellige store oprydning applikationer forudsat en ordentlig berigningsproces at styrke bakterier foretages. Phillips 21 et. al designet eksperimenter for at studere ændringerne i permeabiliteten og styrken af en sand-søjle og en sandsten kerne efter at være blevet injiceret med S. pasteurii kulturer. De fandt, at mens permeabiliteten faldt 2 - 4 gange, mens brudstyrken forøget tre gange.
S. pasteurii og dens rolle i MICP er emner af aktiv forskning og flere spørgsmål i forbindelse med mekanismen for kemisk fældning stadig ikke fuldt forstået. I lyset af dette, er det meget vigtigt at have et sæt af sammenhængende standardiserede protokoller til præcist kultur en passende beriget bestand af S. pasteurii at opnå MICP. Her vil vi skitsere en streng protokol, som vil sikre repeterbarhed og reproducerbarhed. Denne manuscript beskriver de detaljerede protokoller til dyrkning S. pasteurii og passende berigelse dyrkningsmediet for at inducere udfældning. Processen undersøgt gennem forskellige mikroskopiske teknikker, såsom optiske og scanningselektronmikroskopi (SEM) og X-Ray Foto-elektron spektroskopi (XPS). Fokus i manuskriptet er på processen med MICP. Procedurer som SEM og SIMS, idet veletablerede standard protokoller, er ikke beskrevet separat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Udfør de eksperimentelle protokoller i den nedenfor beskrevne rækkefølge. Den bakterielle kultur-protokollen er omtalt i afsnit 1 (se også figur 1). Afsnit 2 beskriver protokollen for at berige dyrkningsmediet brug af eksterne tilsætningsstoffer. Afsnit 3 beskriver de protokoller for multi-mode mikroskopi. Vægten af alle de individuelle komponenter kan måles ved anvendelse af en analytisk vægt. Volumen af hver opløsning kan måles ved anvendelse af et volumetrisk cylinder.
BEMÆRK: Korrekt biosikkerhed protokoller skal følges for afdeling 1 - 2. Se den institutionelle sikkerhed kontor for yderligere oplysninger.
1. bakteriekultur
- Kultur Bakterier - agarplademedium Forberedelse
- Saml udstyr og ingredienser såsom petriskåle, kolbe, Tris-base, HCI, agar, Millipore vand, pH-meter etc.Sterilize alle beholdere ved autoklavering ved 121 ° C før brug.
- Forbered 1 L 0,13 M vandig opløsning af Tris-buffer ved at blande 15,75 g Tris-base med 1 liter Millipore vand. For at sænke pH-niveau i den oprindelige opløsning (pH 10,4) tilsættes 2.800 pi HCI (50% koncentration). Check kontinuerligt under anvendelse af en pH-meter for at indstille pH = 9.
- Fordel 1 L buffer løsning i to dele som følger:
- Tag 800 ml af denne opløsning. Opdel det lige i to dele på 400 ml hver. Opløs 8 g (NH4) 2 SO4 til en opløsning og 16 g gærekstrakt til den anden opløsning.
- Tag de resterende (200 ml) opløsning, og deler det igen i to dele af 100 ml hver. Bland 2 g (NH4) 2 SO4 til én. Tilsæt 4 g gærekstrakt og 4 g agar til den anden.
- Autoklaver de 4 løsninger separat efter indpakning de respektive kolber i Al folie og stikning autoklave bånd.
BEMÆRK: Hvis der anvendes en bordplade autoklave enhed, mængden skal indstilles til 500 ml (temperatur og tryk automatmatisk angivet som funktion af volumen). - Efter at tage dem ud fra autoklaven, indstille de to 400 ml opløsninger til side til trin 1.3.1 (nedenfor). Bland de to 100 ml opløsninger til at have en 200 ml opløsning. Hæld blandingen i 10 - 12 petriskåle.
- Kultur Bakterier - agarplade Prøvefremstilling
- Fjern den bakterielle bestand fra fryseren (-80 ° C) og lad det tø. Efter optøning ordentligt, placere den bakterielle materiel og agarpladen inde i en biosikkerhed hætte.
- Vælg mikropipetten af mindste tilgængelige dimension (0,5-10 pi er et godt valg) til angribe spidsen med Sporosarcina pasteurii lager. Streak en agarplade med mikropipettespidsen. Placer stribede agarplade inde i en ikke-rysteinkubator ved 31 ° C i 48 timer.
- Efter 48 timer fjernes pladen fra inkubatoren og visuelt undersøger for eksistensen af enkelte kolonier. Hvis der ikke er enkelte kolonier, og derefter placere den i than inkubator i yderligere 24 timer.
- Gentage processen, indtil enkelte kolonier påvises. Må ikke overstige 7 dage retssag.
BEMÆRK: Hvis enkelte kolonier ikke vises, selv efter en uge, så konkluderes det, at de skridt, der ikke er blevet fulgt ordentligt og hele processen skal gentages fra trin 1.
- Kultur Bakterier - Final Sample Preparation
- Bland de to 400 ml opløsninger (Tris-buffer + (NH4) 2 SO4 og Tris-buffer + gærekstrakt (1.5.1) sammen for at opnå en 800 ml opløsning. Overfør 125 ml af denne opløsning i en kolbe.
- Udfør en visuel undersøgelse af overfladen af agarpladen at identificere regioner med høj koncentration af enkelte kolonier. Forsigtigt skubbe og bryde en af kolonier med en mikropipette spids.
- Dyp samme mikropipette spidsen ind i 125 ml kolbe og rør det grundigt for at sikre, at tilstrækkeligt antal celler til robust multiplikation få overført. Kolben anbringes i en rysteinkubator ved 150 rpm, 30 ° C i 2 - 3 dage. Efter 2 - 3 dage kolben fra inkubatoren fjerne.
- Kultur Bakterier - Final celletal
- Udføre seriel fortynding af den ikke-fortyndet dyrkningsopløsning anvendelse af PBS for at opnå en fortynding på mindst ti millioner (10 -7) for at sikre tællelige enkelte kolonier vises. Tegn syv parallelle ækvidistante linjer på en af de agar-plader.
- Gør dette ved at tegne fede linjer på bundfladen af petriskålen, fremtrædende nok til at være synlige fra toppen. Drop 3 små dråber af ikke-fortyndet opløsning ind ét segment. Der tilsættes 1 ml ufortyndet opløsning til 9 ml phosphatbufret saltvand (PBS) for at opnå en 1:10 fortynding.
- Tag en lille portion (~ 0,1 ml) af denne nyligt fortyndet opløsning med en pipette og slip endnu 3 små dråber på det næste segment. Overfør den nyligt fortyndet opløsning til en ny kolbe, og yderligere fortyndet ti gange (10x) vedtilsætning PBS. Dette bringer ned fortynding til 10 -2 eller 1: 100.
- Brug denne 1: 100 opløsning i det næste segment. Gentag denne han behandle med små mængder af de frisk fortyndede opløsninger ved successivt at overføre dem til nye kolber og løbende fortynding ti gange (10x) i tandem med PBS for at få flere og mere fortyndede prøver fra 10 -3 eller 1: 1000 hele vejen ned til 10 -7 eller 1:10 millioner ind det sidste segment.
- Udfør kolonidannende enhed (CFU) kimtal for at tælle antallet af celler til stede i agarpladen efter inkubering af pladen i 1 - 2 dage ved 31 ° C. Dette giver et kvantitativt mål for bakterietallet i den ufortyndede prøve.
BEMÆRK: CFU værdien måles på grundlag af systemets evne til at give anledning til kolonier under de særlige betingelser i næringssubstrat, temperatur og tid under forudsætning af, at hver koloni er adskilt og grundlagt af en enkelt levedygtig mikrobiel celle. - Forseglepetriskålene med selvforseglende film og opbevares resterende elementer i køleskab til senere brug.
- Udføre seriel fortynding af den ikke-fortyndet dyrkningsopløsning anvendelse af PBS for at opnå en fortynding på mindst ti millioner (10 -7) for at sikre tællelige enkelte kolonier vises. Tegn syv parallelle ækvidistante linjer på en af de agar-plader.
2. Protokol til Berigelse af Næringsstoffer, Accelerate Nedbør
- Transfer 9 ml af det forberedte dyrkningsvæske (celler + medium) i flere steriliserede centrifugeglas, der hver 10 ml volumen.
- Der fremstilles en 100 ml stamopløsning af eksterne berigelse bestående af fire komponenter i følgende koncentrationer i frisk medium: Urea: 2 g / l, Ammoniumchlorid: 1 g / l, natriumbicarbonat: 212 mg / l, Calciumchlorid: 280 mg / L. måle forsigtigt alle ingredienserne ved hjælp af en analytisk balance og bland alle, men urinstof med frisk medium i et bæger og sted i autoklaven (121 ° C, 15 psi, 15 min).
- Efter autoklav, blandes den nødvendige mængde urinstof (2 mg) med 1 ml frisk medium og passere gennem en sprøjte udstyret med 0,22 pm sprøjtefilter at fuldføre processen med berigelse.
- Tilsæt 1ml af denne berigelse medium med additiver til de steriliserede centrifugerør indeholdende 9 ml af det forberedte dyrkningsvæske (celler + medium) (se trin 2.1).
BEMÆRK: Af alle disse komponenter, urinstof er nedbrydeligt ved forhøjede temperaturer, kan ikke steriliseres i en autoklave. Efter anvendelsen andre komponenter er blevet autoklaveret (121 ° C, 15 psi, 15 min), urinstof tilsættes sidst gennem et 0,22 um sprøjtefilter.
- Vortex hvert rør grundigt med en mekanisk vortexer. Placer de berigede væsker (celler + medium + additiver) i en ikke-rysteinkubator ved 30 ° C. Overvåg alle enhederne regelmæssigt for initiering af nedbør. Under anvendelse af et lysmikroskop, begynder mikroskopiobservationer når indtræden af udfældning påvises med det blotte øje. Dette er normalt mellem 30 - 36 timer efter start af forsøg.
3. Protokol til Multi-mode Microscopy
- Overfør et lille volumen (~ 1 ml) af fluid til en høj Magnification mikroskopi-kamre dækglas til at udføre indledende observationer med lyse felt tilstand. Til at begynde med, starte alle observationer med den laveste forstørrelse (4X). hvilket giver en bred dækningsområde og dermed global information om fordelingen af bundfald.
- Vælg bestemte områder med betydelige mængder nedbør og zoom ind (20X, 40X, 60X) ved gradvist at øge forstørrelsen.
BEMÆRK: Da det er umuligt at korrekt løse celler fra den ekstracellulære Polymer Stof (EPS) under lyse-felt (på grund af meget tæt brydningsindeks), tænde fase-kontrast-tilstand når det er nødvendigt. I denne tilstand, kun omridsene af cellemembranerne (der er en anden fase end hovedparten celle) er synlige, således at visuel differentiering. - Endelig plette nogle kamre med live / Dead plet, der selektivt farvestoffer de strømførende dele som grønt, mens farve de døde komponenter i rødt. Se standardprotokoller 28 </ Sup>.
- Tænd fluorescerende tilstand til korrekt at skelne mellem de røde og grønne områder. Rød (Red filter terning med Excitation bølgelængde på 540 - 580 nm, Dichroic spejl af 595 nm og Barrier filter på 600 - 660 nm) og Green (GFP Lang-pass Green filter terning med excitationsbølgelængde på 440-480 nm, Dichroic spejl af 505 nm og spærrefilter af 510 nm) filter terninger anvendes til at lette fluorescerende mikrografer.
- Når alle multi-mode data er blevet indsamlet, udvælge de bedste billeder og manuelt overlay (individuel lysfelt, fase-kontrast og fluorescerende billeder) for at opnå den bedst mulige kontrast og klarhed.
- Udfør SEM på de tørrede faste prøver at forstå krystalstrukturer. Dette er en veletableret og standard procedure. 22 Udfør XPS at identificere kemiske underskrifter funktionelle grupper (carbonater). Dette er en veletableret og standard procedure så godt. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
S. pasteurii være en alkalifil 24 kan overleve relativt barske forhold. Da ovennævnte kultur protokol følges, og S. pasteurii dyrkes inde i et kammer, bakterierne fører til udfældning af calciumcarbonat over tid (figur 2A). Figur 2 (b) viser et fasekontrast-optisk mikroskopisk billede af bakteriecellen befolkning i dyrkningsmediet. Individuelle celler klart kan udskilles, med stang-lignende former, er karakteristiske for den bacillus klasse af bakterier ganske indlysende. Små brune pile er blevet anvendt til specifikt at fremhæve to individuelle celler. Udfældning af calciumcarbonat sker over en periode på flere dage. Figur 2A viser, hvordan præcipitaterne afregne ved bunden af et centrifugerør. Dette kan tydeligt ses med det blotte øje som et hvidligt pulver sidder under det flydende medium meden skarp kontrast i farve i modsætning til den gullig væske. Den gullig væske indeholder bakterier suspenderet i deres dyrkningsmedium. De hvide bundfald blev opsamlet og tørret, og senere filmede med SEM (figur 2C).
I figur 3A, de veldefinerede spaltningsprodukter linjer, et kendetegn for krystallinitet, let kan identificeres. Figur 3B viser XPS graf for den samme prøve til karakterisering. Toppe svarende til carbonat grupper pin-point eksistensen af calciumcarbonat. Således figur 3A og B sammen klart bevis genereringen af calcit som udfældede kemikalie.
En kvalitativ eksperiment blev udført for at vurdere evnen af MICP at ændre egenskaberne for porøse medier. Til dette formål har vi udført et forsøg med svampe, der forventes at efterligne en porøsmedium med en række længdeskalaer af pore- strukturer, som findes i en typisk naturlige struktur. En svamp bar (Mr. Clean, P & G) blev neddyppet i en opløsning af S. pasteurii i en periode på 7 dage og derefter tørret. Svampen efter lang eksponering for MICP proces hærdede og vises forbedret trykstyrke. Dette er afbildet i figur 4 Svampen, før nedsænkning (kontrol tilfælde), viste signifikant kompression når den udsættes for en 1 kg vægt (Figur 4A - B).. På den anden side, efter at være underkastet nedsænkning i S. pasteurii løsning, det har lidt pore tilstopning på grund af den resulterende calcit udfældning. Dette førte til en massiv stigning i styrke som følge af en udjævning af de pore rum og efterfølgende gjort det muligt bar at understøtte 1 kg belastning uden at tillade signifikant kompression (figur 4C - D).
En semi-kvantitativ idévedrørende hærdningsproces kan opnås gennem målinger af udbøjning højde af den fyldte bar. Den oprindelige svamp prøve er en rektangulær bar med en højde på 4,5 cm. Den afbøjning af kontrol prøven, meget nær punktet for anvendelse af belastningen, er ca. 1,6 cm. I tilfældet med de behandlede prøve, afbøjningen reducerer til 0,6 cm. Yderligere stringent kvantificering af hærdeprocessen er også mulig. For eksempel har en mekanistisk forklaring af denne proces i form af stigning i forskydningsstyrke, peak deviatoric stress og dilatancy vinkler blevet foreslået af Tagliaferri 25 et. al gennem røntgen billedbehandling og digital billedbehandling korrelation.
Figur 1. Oversigt over Hele Kultur protokollen Repræsenteret som en algoritmisk Skematisk. Til at begynde med, Tris-buffer og agar løsning er poured i en petriskål. Når agarplade er klar, er det stribet med en spids inficerede med bakterier. Den stribede Pladen inkuberes at vokse enkelte kolonier. En af de enkelte kolonier overføres til et medie kolbe og inkuberes igen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Cellerne og præcipitaterne (A) Cellerne i dyrkningsmediet afgrænset af et centrifugerør føre til klare observerbar kemisk udfældning (efter 5 - 7 dage). Der afregner ned i bunden og er synlig for det blotte øje. (B) Befolkning af bakterier immobiliseret på en overflade ses under fase-kontrast. Individuelle stavformede celler (bacilli, mærket Sp) kan ses tydeligt (et par af dem fremhævet med pile). (C) SEM billede af det hvide bundfald viser begge celler (SP) og krystaller (CC). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Krystaller og karakterisering. (A) scanning elektronmikroskop billede af det tørrede bundfald. Individuelle krystaller og tilknyttede spaltningsprodukter linjer er klart synlige. (B) X-Ray Foto-elektron spektroskopi (XPS) graf over den kemiske bundfald; massespektrometri toppe svarende til carbonat funktionel gruppe styrke muligheden for eksistensen af calcit. Klik her til view en større version af dette tal.
Figur 4. En Semi-kvantitativ Eksperimenter med Svamp barer serverer som Prototype porøse medier. (A) og (B) er friske tørre prøver ikke dyppet. (C) og (D) er våde prøver tordenskyl i en opløsning af medium og celler; de udviser en betydelig stigning i væsentlig modstand skyldes pore tilstopning som følge af calcit udfældning som set her fra reduceret kompression under indvirkning af en konstant vægt. Ubehandlede prøver er naturligvis porøse og lider massiv reduktion i volumen når det udsættes for en 1 kg vægt. Porerne klemme luften ud og kontrakten, hvilket fører til en samlet reduktion i størrelse. På den anden side har den behandlede prøve kunstigt opnået en betydelig mængde af stivhed i kraft af pore tilstopning. Det viser en markant forbedring i styrke, når det komfortabelt understøtter den samme belastning uden kompression. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin: Dette håndskrift beskriver i detaljer, protokollerne til dyrkning af en levedygtig prøve af S. pasteurii. Når kulturen er blevet klargjort, skal den passende berigelse. Dette er et vigtigt skridt afgørende for succes af forsøget, fordi en manglende den korrekte kemiske miljø fører til enten meget lange tidsskalaer for nedbør eller et komplet mangel på samme. S. pasteurii er ganske følsom over for flere eksterne bureauer og skal dyrkes med en høj grad af omhu og præcision for at sikre biokemisk robusthed og repeterbarhed. Omfanget og dosering af berigelse vides nu at diktere den kemiske natur af nedbør, hvorfor skal kontrolleres nøjagtigt samt.
Ændringer / Fejlfinding: Flere aspekter kan ændres med lidt varians i endelige resultater. Pladen tæller ikke påkrævet pr teknikken beskrevet ovenfor (seriel fortynding pr the Miles Misra Method). Her har seriefortynding blevet udført på en enkelt agarplade ved at inddele den i syv regioner ved akkorder trukket på dens bundflade. Dette er ikke obligatorisk. Det er også en almindelig praksis at anvende en hel agarplade til en bestemt fortynding ved fremstilling af en spread plade. Seriefortynding udføres på en række på hinanden spredte plader og den med en tællelig antal enkelte kolonier (20 - 200) er valgt til den endelige beregning. Enhver af de forskellige andre celletælling teknikker kan anvendes her. Mikroskopi kan meget vel udføres med enkle dækglas eller lysbilleder. Et kammer enhed er slet ikke obligatorisk.
Nogle gange kan bakterierne undlader at danne bundfald. Det er nyttigt at overføre en lille mængde af den frosne kultur i et flydende medium først. Striber kan udføres efter vækst har fundet sted i den flydende først.
Begrænsninger: Dette er en langsom teknik med en number af trin, den ene fører til en anden. Der er betydelige muligheder for forurening, krydsforurening og andre kulturelle defekter på alle trin. Intens pleje skal opretholdes til enhver tid. Omkring 180 mg bundfald pr ml dyrkningsopløsning.
Betydning: Den nuværende protokol skitserer i detaljer alle de nødvendige foranstaltninger til at sikre, at en kultur af bakterien S. pasteurii trofast udfælder calcit under indflydelse af eksternt tilsatte berigelser. Selvom kulturen af denne bakterie i sig selv er en veletableret protokol, hele processen med berigelse og kvantificering er ikke. Dette spørgsmål er blevet behandlet her.
Fremtidige applikationer: Det kunne være muligt at passende modulere denne bakterie til udfældning på forskellige måder, der igen kan konstrueres til forskellige anvendelser afhængigt af arten af bundfald. Det blev tidligere nævnt, at derfindes flere ubekendte med hensyn til MICP involverer S. pasteurii. Nogle af disse ubekendte indbefatter rolle aggregative dynamik S. pasteurii i MICP proces, rolle mikroskala miljø 26,27 såsom virkning af porøse medier og fluidstrømning. En standardiseret protokol kan udvikles, der sikrer hurtig udfældning med en klar mulighed for at udføre korrekt multi-mode mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petridish | Fisher Scientific | FB0875712 | Petridishes being used as Agar plate |
| Pyrex Flasks | Fisher Scientific | S63268 | Corning Erlenmeyer |
| Tris-Base | Promega | H5133 | being used to make Tris-Buffer |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture |
| Agar Powder | Sigma-Aldrich | A1296 | microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder |
| Ammonium Sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | for Molecular Biology |
| Yeast extract powder | Sigma-Aldrich | 51475 | |
| Measuring Cylinder | Cole-Parmer | CP08559GC | Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk |
| Analytical Balance | OHAUS | AX124E | being used to measure weight of reagents |
| Autoclave | Brinkmann | 58619000 | |
| Autoclave Tape | VWR | 52428864 | |
| Aluminum Foil | Sigma-Aldrich | Z185140 | being used to seal the flask before placing it in Autoclave |
| Bacterial Stock | Cedarlane | 11859 | -80 °C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No. |
| Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume | Biohit | 725010 | Marketed by VWR under catalog number 14005976 |
| Micropipette Tip | Fisher Scientific | 212772B | Used for scratching Agar plates |
| Incubator | Binder | 80079098 | Microbiology Incubator,BF Series |
| Shaking Incubator | VWR | 14004300 | VWR Signature Benchtop Shaking Incubators |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P7059 | |
| BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device | BD Biosciences | 357590 | Marketed by VWR under catalog number 53106220 |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Being used to seal Agar plates |
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | Enrichment for nutrient medium |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | Enrichment for nutrient medium |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | Enrichment for nutrient medium |
References
- Gibson, T. An investigation of the Bacillus pasteurii group. Journal of Bacteriology. 28, 491-502 (1934).
- Greenfield, L. J. Metabolism and concentration of calcium and magnesium and precipitation of calcium carbonate by a marine bacterium. Annals of the New York Academy of Sciences. 109, 23-45 (1963).
- Phillips, A. J. Engineered applications of ureolytic biomineralization: a review. Biofouling. 29, 715-733 (2013).
- Dhami, N. K., et al. Biomineralization of calcium carbonates and their engineered applications: a review. Frontiers in microbiology. 4, 314 (2013).
- Cuthbert, M. O., et al. Controls on the rate of ureolysis and the morphology of carbonate precipitated by S. Pasteurii biofilms and limits due to bacterial encapsulation. Ecological Engineering. 41, 32-40 (2012).
- Okwadha, G. D., et al. Optimum conditions for microbial carbonate precipitation. Chemosphere. 81, 1143-1148 (2010).
- Stocks-Fischer, S., et al. Microbiological precipitation of CaCO3. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1563-1571 (1999).
- Lauchnor, E. G., et al. Bacterially induced calcium carbonate precipitation and strontium coprecipitation in a porous media flow system. Environmental science & technology. 47, 1557-1564 (2013).
- Al Qabany, A., et al. Factors Affecting Efficiency of Microbially Induced Calcite Precipitation. Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering. 138, 992-1001 (2012).
- Morita, R. Y. Calcite precipitation by marine bacteria. Geomicrobiology Journal. 2, 63-82 (2009).
- Chafetz, H. S. Marine peloids: A product of bacterially induced carbonate precipitation. Journal of Sedimentary Petrology. 56, 812-817 (1986).
- Biomason.com. , Available from: http://www.biomason.com (2015).
- Whiffin, V. S. Microbial CaCO3 precipitation for the production of biocement. , Murdoch University. PhD thesis (2004).
- Paassen, L. A., et al. Scale up of BioGrout: a biological ground reinforcement method. Proceedings of the 17th International Conference on Soil Mechanics and Geotechnical Engineering. , 2328-2333 (2009).
- Cunningham, A. B., et al. Microbially enhanced geologic containment of sequestered supercritical CO2. Energy Procedia. 1, 3245-3252 (2009).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Cunningham, A. B., et al. Reducing the risk of well bore leakage of CO2 using engineered biomineralization barriers. Energy Procedia. 4, 5178-5185 (2011).
- Jonkers, H. M., et al. Application of bacteria as self-healing agent for the development of sustainable concrete. Ecological Engineering. 36, 230-235 (2010).
- Tobler, D. J., et al. Transport of Sporosarcina pasteurii in sandstone and its significance for subsurface engineering technologies. Applied Geochemistry. 42, 38-44 (2014).
- Mortensen, B. M., et al. Effects of environmental factors on microbial induced calcium carbonate precipitation. Journal of applied microbiology. 111, 338-349 (2011).
- Phillips, A. J., et al. Potential CO2 leakage reduction through biofilm-induced calcium carbonate precipitation. Environmental science & technology. 47, 142-149 (2013).
- Robbins, R. Scanning Electron Microscope Operation. , Available from: http://www.utdallas.edu/~rar011300/SEM/Scanning%20Electron%20Microscope%20Operation.pdf (2010).
- vander Heide, P. X-ray Photoelectron Spectroscopy: An introduction to Principles and Practices. , John Wiley & Sons. (2011).
- Wiley, W. R., et al. Requirement of an alkaline pH and ammonia for substrate oxidation by Bacillus pasteurii. Journal of Bacteriology. 84, (1962).
- Tagliaferri, F., et al. Observing strain localisation processes in bio-cemented sand using x-ray imaging. Granular Matter. 13, 247-250 (2011).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluidics and Nanofluidics. 14, 895-902 (2012).
- Valiei, A., et al. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a chip. 12, 5133-5137 (2012).
- LIVE/DEAD Bacterial Viability kit, Two-color bacterial viability assay. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf, https://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/protocols/live-dead-baclight-bacterial-viability-protocol.html (2004).
