Abstract
La bacteria en particular bajo investigación aquí (S. pasteurii) es único en su capacidad, en las condiciones adecuadas, para inducir la hidrólisis de la urea (ureolysis) en entornos naturales a través de la secreción de una enzima ureasa. Este proceso de ureolysis, a través de una cadena de reacciones químicas, conduce a la formación de precipitados de carbonato de calcio. Esto se conoce como inducida microbiológicamente Calcita Precipitación (MICP). Los protocolos de cultivo adecuados para MICP se detallan aquí. Por último, se realizaron experimentos de visualización en diferentes modos de microscopía de comprender diversos aspectos del proceso de precipitación. Técnicas como la microscopía óptica, se emplearon Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) y X-Ray Photo-electrón Spectroscopy (XPS) para caracterizar químicamente el producto final. Además, la capacidad de estos precipitados a obstruir los poros dentro de un medio poroso naturales se demostró a través de un experimento cualitativo donde esponjabarras se utilizan para imitar un poro de la red con una gama de escalas de longitud. Una barra de esponja sumergido en el medio de cultivo que contiene las células bacterianas se endurece debido a la obstrucción de sus poros resultantes del proceso continuo de precipitación química. Esta barra de esponja endurecido exhibe una resistencia superior en comparación con una barra de esponja de control que se comprime y apretó bajo la acción de una carga externa aplicada, mientras que la barra de endurecido es capaz de soportar el mismo peso con poca deformación.
Introduction
Sporosarcina pasteurii es una bacteria gram-positiva capaces de sobrevivir en entornos altamente alcalinas (pH ~ 10) 1 y es uno de las especies bacterianas que pueden convertirse en un agente causal de un fenómeno llamado inducida microbiológicamente Calcita Precipitación (MICP) 2-4. MICP es un proceso en el que la precipitación de carbonato de calcio es inducido por ciertos microbios en condiciones ambientales adecuadas. S. pasteurii ha cobrado importancia en los últimos años debido a su identificación como un posible agente para inducir un volumen significativo de MICP bajo ciertas condiciones. Esta posibilidad surge del hecho de que S. pasteurii tiene la capacidad única de secretar grandes cantidades de la enzima ureasa. Esta enzima actúa como un catalizador, la promoción de una lisis acelerada de urea (un compuesto orgánico que existe de forma natural con el suministro generalizada y abundante) en presencia de moléculas de agua. A través de una cascada de reacciones, este proceso finalLy conduce a la generación de iones carbonato con carga negativa. Estos iones, a su vez, reaccionan con iones metálicos positivos como el calcio para formar finalmente precipitados de carbonato de calcio (calcita); por lo tanto, la etiqueta MICP 5-9.
El proceso de MICP ha sido conocido y estudiado durante varias décadas 10,11. En los últimos años, se ha investigado MICP para una amplia gama de aplicaciones ambientales, incluyendo la construcción verde de abajo hacia arriba 12, la mejora de las estructuras a gran escala 13,14 y la captura de carbono y almacenamiento 15,16 ingeniería y.
Por ejemplo, Cunnigham 17 et. Al diseñado un reactor de flujo temperatura moderada a alta presión que contiene un núcleo de arenisca Berea. El reactor se inoculó con las bacterias S. fridgidimarina y en condiciones de inyección de dióxido de carbono supercrítico a alta presión, una acumulación masiva de biomasa dentro del poro volse observó umes, lo que condujo a la reducción de más de 95% de la permeabilidad. Jonkers y Schlangen 18 estudiaron el efecto de ciertas cepas especiales de bacterias en el proceso de auto-sanación en el hormigón. Se espera externa de agua transportada en la red de poros entra a través de los poros de la superficie para activar las bacterias inactivas que a su vez ayudan a la resistencia estructural a través de MICP. Tobler 19 et al. han comparado la actividad de S. ureolíticas pasteurii con un agua subterránea microcosmos ureolíticas indígena en condiciones que favorecen MCIP a gran escala y se encontró que S. pasteurii tiene una capacidad constante para mejorar la precipitación de calcita incluso cuando las comunidades indígenas carecían de actividad de la ureasa antes. Mortensen 20 et.al han estudiado los efectos de los factores externos, como el tipo de suelo, la concentración de cloruro de amonio, salinidad, concentración de oxígeno y la lisis de las células en MICP. Su demostración de que el proceso de tratamiento biológico es muy robusto con respect a una amplia variación en el espacio de parámetros corrobora la idoneidad de este proceso para diversas aplicaciones de remediación a gran escala proporciona un proceso de enriquecimiento adecuado para reforzar las bacterias se lleva a cabo. Phillips 21 et. al diseñado experimentos para estudiar los cambios en la permeabilidad y la fuerza de una columna de arena y un núcleo de arenisca después de haber sido inyectados con S. culturas pasteurii. Ellos encontraron que mientras que la permeabilidad disminuyó 2 - 4 veces, mientras que la resistencia a la fractura aumentó tres veces.
S. pasteurii y su papel en MICP son temas de investigación activa y varias cuestiones relacionadas con el mecanismo de precipitación química todavía no se entienden completamente. A la luz de esto, es muy importante contar con un conjunto de protocolos estandarizados coherentes con la cultura con precisión una población enriquecida de manera adecuada S. pasteurii para lograr MICP. A continuación, se describe un protocolo riguroso que garantice la repetibilidad y la reproducibilidad. esta manuscript describe los protocolos detallados para el cultivo de S. pasteurii y adecuadamente el enriquecimiento del medio de cultivo para inducir la precipitación. El proceso se investigó a través de diversas técnicas microscópicas tales como óptica y microscopía electrónica de barrido (SEM) y X-Ray Photo-electrón Spectroscopy (XPS). El foco del manuscrito está en el proceso de MICP. Los procedimientos como SEM y SIMS, siendo protocolos estándar bien establecidos, no se describen por separado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Realice los protocolos experimentales en el orden que se describe a continuación. El protocolo de cultivo bacteriano se discute en la Sección 1 (véase también la figura 1). Sección 2 se describe el protocolo para enriquecer el medio de cultivo utilizando aditivos externos. Sección 3 describe los protocolos para la microscopía de multi-modo. Los pesos de todos los componentes individuales se puede medir usando una balanza analítica. Volumen de cada solución se puede medir usando un cilindro volumétrico.
NOTA: los protocolos adecuados de bioseguridad debe ser seguido por las secciones 1 - 2. Consultar la oficina de seguridad institucional para obtener más detalles.
1. bacteriana Cultura
- Las bacterias Cultura - agar placa de medio Preparación
- Montar equipo y los ingredientes tales como placas de Petri, frasco, Tris-base, HCl, agar, Millipore agua, pH-metro etc.Sterilize todos los contenedores en autoclave a 121 ° C antes de su uso.
- Preparar 1 L de 0,1solución 3 M acuosa de tampón Tris mezclando 15,75 g de Tris-base con 1 L de agua Millipore. Para bajar el nivel de pH de la solución original (pH 10,4) añadir 2.800 l de HCl (concentración 50%). Comprobar continuamente usando un pH-metro para ajustar pH = 9.
- Dividir la solución tampón 1 L en dos partes como sigue:
- Tomar 800 ml de esta solución. Divida igualmente en dos partes de 400 ml cada uno. Disolver 8 g (NH 4) 2 SO 4 a una solución y 16 g de extracto de levadura a la otra solución.
- Tomar las restantes (200 ml de) solución y se divide de nuevo en dos partes de 100 ml cada uno. Mezclar 2 g (NH 4) 2 SO 4 a uno. Añadir 4 g de extracto de levadura y 4 g de agar a la otra.
- Autoclave las 4 soluciones por separado después de concluir los respectivos frascos de lámina de aluminio y se pegue cintas de autoclave.
NOTA: Si se utiliza un equipo de mesa autoclave, el volumen debe establecerse en 500 ml (temperatura y presión autómatacamente especificado como una función del volumen). - Después de sacarlos del autoclave, ajustar las dos soluciones de 400 ml a un lado para el paso 1.3.1 (a continuación). Mezclar las dos soluciones de 100 ml para tener una solución de 200 ml. Verter la mezcla en 10 - 12 placas de Petri.
- Las bacterias Cultura - placa de agar Preparación de muestras
- Retire la acción bacteriana del congelador (-80 ° C) y deje que se descongele. Después de descongelar correctamente, coloque la población bacteriana y la placa de agar dentro de una campana de bioseguridad.
- Seleccione la micropipeta de menor dimensión disponible (0,5 - 10 l es una buena opción) para infestar la punta con el caldo de pasteurii Sporosarcina. Racha de una placa de agar con la punta de la micropipeta. Coloque la placa de agar con rayas dentro de una incubadora no agitación a 31 ° C durante 48 horas.
- Después de 48 horas, retire la placa de la incubadora y examinar visualmente para detectar la existencia de colonias individuales. Si no hay colonias individuales, luego se coloca en tél incubadora durante otras 24 horas.
- Repita el proceso hasta que se detectan colonias individuales. No exceda de 7 días de prueba.
NOTA: Si no aparecen incluso después de una semana, entonces se concluye que las medidas no se han aplicado correctamente y todo el proceso debe repetirse desde el paso 1 colonias individuales.
- Las bacterias Cultura - Muestra final Preparación
- Mezclar las dos soluciones de 400 ml (tampón de Tris + (NH 4) 2 SO 4 y tampón de Tris + extracto de levadura (1.5.1) entre sí para obtener una solución de 800 ml. De transferencia de 125 ml de esta solución en un matraz.
- Realizar un examen visual de la superficie de la placa de agar para identificar regiones con alta concentración de colonias individuales. empujar suavemente y romper una de las colonias con una punta de micropipeta.
- Moje la misma punta de la micropipeta en el matraz de 125 ml y se remueve a fondo para asegurar que un número suficiente de células para la multiplicación robusta ser transferido. Colocar el matraz en un incubador con agitación a 150 rpm, 30 ° C durante 2 - 3 días. Después de 2 - 3 días, retirar el matraz de la incubadora.
- Las bacterias Cultura - Recuento de Células final
- Realizar dilución en serie de la solución de cultivo no diluido con PBS para alcanzar una dilución de al menos diez millones (10 -7) para asegurar aparecen colonias individuales contables. Dibuje siete líneas equidistantes paralelas sobre una de las placas de agar.
- Para ello, dibujando líneas en negrita en la superficie inferior de la placa de Petri, lo suficientemente prominente como para ser visible desde la parte superior. Caída de 3 pequeñas gotas de solución no diluida en un segmento. Añadir 1 ml de solución no diluida a 9 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener una dilución de 1:10.
- Tomar una pequeña alícuota (~ 0,1 ml) de esta solución recién diluida con una pipeta y colocar 3 gotas más pequeñas en el siguiente segmento. Transferir la solución recién diluida a un nuevo matraz y más diluidas diez veces (10x) porla adición de PBS. Esto hace bajar la dilución de 10 -2 o 1: 100.
- Utilice esta solución 1: 100 en el siguiente segmento. Repita este se procesa con pequeños volúmenes de las soluciones diluidas por ellos recién transferir sucesivamente a nuevos frascos y diluyendo de forma continua de diez veces (10x) en conjunto con PBS para obtener más y más muestras diluidas de 10 -3 ó 1: 1.000 de todo el camino hasta 10 -7 o 1:10 millones en el último segmento.
- Realizar formadoras de colonias recuento Unidad (CFU) Placa para contar el número de células presentes en la placa de agar después de incubar la placa durante 1 - 2 días a 31 ° C. Esto da una medida cuantitativa de la recuento de bacterias en la muestra sin diluir.
NOTA: El valor CFU se mide en base a la capacidad del sistema para dar lugar a colonias en las condiciones específicas de medio nutriente, temperatura y tiempo asumiendo que todas las colonias es independiente y fundada por una sola célula microbiana viable. - Sellolas placas de Petri con la película de cierre automático y tienda de artículos restante en un refrigerador para su uso futuro.
- Realizar dilución en serie de la solución de cultivo no diluido con PBS para alcanzar una dilución de al menos diez millones (10 -7) para asegurar aparecen colonias individuales contables. Dibuje siete líneas equidistantes paralelas sobre una de las placas de agar.
2. Protocolo para el enriquecimiento de nutrientes para acelerar la precipitación
- Transferencia de 9 ml de líquido de cultivo preparada (células + medio) en varios tubos de centrífuga estériles, cada una de 10 ml de volumen.
- Preparar una solución madre de 100 ml del enriquecimiento externo que consta de cuatro componentes en las siguientes concentraciones en medio fresco: Urea: 2 g / L, cloruro de amonio: 1 g / L, bicarbonato de sodio: 212 mg / L, cloruro de calcio: 280 mg / L. medir cuidadosamente todos los ingredientes usando una balanza analítica y se mezcla todo, pero la urea con medio fresco en un vaso de precipitados y el lugar en el autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min).
- Después de autoclave, se mezcla la cantidad requerida de urea (2 mg) con 1 ml de medio fresco y pasar a través de una jeringa equipada con filtro de jeringa de 0,22 micras para completar el proceso de enriquecimiento.
- Añadir 1ml de este medio de enriquecimiento con aditivos a los tubos de centrífuga estériles que contienen 9 ml de líquido de cultivo preparada (células + medio) (véase el paso 2.1).
NOTA: de todos estos componentes, urea ser degradable a temperaturas elevadas, no puede ser esterilizado en un autoclave. Por lo tanto, después de que los otros componentes han sido tratado en autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min), se añade urea pasado a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras.
- Vortex cada tubo a fondo usando un agitador vorticial mecánica. Coloque los líquidos enriquecidos (células + aditivos + medio) en una incubadora no agitación a 30 ° C. Supervisar todas las unidades con regularidad para la iniciación de la precipitación. El uso de un microscopio de luz, comenzar observaciones microscópicas una vez que se detecta inicio de la precipitación con el ojo desnudo. Esto es por lo general entre 30 - 36 hr después del inicio de los experimentos.
3. Protocolo de Microscopía varios modos de funcionamiento
- Transferir un volumen pequeño (~ 1 ml) de líquido a una alta magníficatión sistema cubreobjetos microscopio de la recámara para realizar observaciones iniciales con el modo de campo claro. Para empezar, iniciar todas las observaciones con el aumento más bajo (4X). que proporciona una amplia área de cobertura y, por tanto, la información sobre la distribución mundial de precipitados.
- Seleccionar áreas particulares con volúmenes significativos de precipitaciones y un zoom (20X, 40X, 60X) aumentando progresivamente el aumento.
NOTA: Ya que es imposible resolver adecuadamente las células de la sustancia polimérica extracelular (EPS) en el marco de campo brillante (debido a los índices de refracción muy cerca), cambiar el modo de contraste de fase siempre que sea necesario. En este modo, sólo los contornos de las membranas celulares (siendo una fase diferente de la célula a granel) son visibles, lo que permite la diferenciación visual. - Por último, algunas cámaras de manchar con tinción Live / Dead que tiñe selectivamente los componentes vivos como verde, mientras que la coloración de los componentes de muertos en rojo. Remitirse a los protocolos estándar 28 </ Sup>.
- Activar el modo fluorescente para distinguir correctamente entre las regiones rojas y verdes. Rojo (filtro de cubo rojo con la excitación de longitud de onda de 540 - 580 nm, espejo dicroico de 595 nm y Barrera filtro de 600 - 660 nm) y de paso largo GFP verde (filtro de cubo verde con excitación de longitud de onda de 440 - 480 nm, espejo dicroico de 505 nm y filtro de barrera de 510 nm cubos) de filtro se utilizan para facilitar micrografías fluorescentes.
- Una vez que todos los datos multimodo se han reunido, seleccionar las mejores imágenes y superposición de forma manual (campo claro individual, de contraste de fases y las imágenes fluorescentes) para obtener el mejor contraste y la claridad posible.
- Realizar SEM de las muestras sólidas secas de entender las estructuras de cristal. Este es un procedimiento bien establecido y estándar. 22 Realizar XPS para identificar las firmas químicas de los grupos funcionales (carbonatos). Este es un procedimiento bien establecido y estándar, así. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
S. pasteurii ser un Alcalófilo 24 puede sobrevivir en condiciones relativamente duras. Cuando el protocolo de cultivo antes mencionado se siguió, y S. pasteurii se cultiva dentro de una cámara, las bacterias lleva a la precipitación de carbonato de calcio con el tiempo (Figura 2A). La figura 2 (b) muestra una imagen microscópica óptica de contraste de fases de la población de células bacterianas en el medio de cultivo. Las células individuales se pueden distinguir claramente, con formas similares a barras característicos de la clase de bacterias Bacillus bastante evidentes. flechas marrones pequeños se han utilizado para poner de relieve específicamente dos células individuales. La precipitación de carbonato de calcio se produce durante un período de varios días. La Figura 2A muestra cómo los precipitados se establecen en la parte inferior de un tubo de centrífuga. Esto puede verse claramente a simple vista como un polvo blanquecino que se sienta debajo de la medio líquido conun fuerte contraste de color en comparación con el líquido amarillento. El líquido amarillento contiene bacterias suspendidas en su medio de cultivo. Los precipitados blancos se recogieron y secaron y después utilizando imágenes SEM (Figura 2C).
En la Figura 3A, las líneas de corte bien definidos, una característica de la cristalinidad, se puede identificar fácilmente. La Figura 3B muestra el gráfico de XPS para la misma muestra para caracterización. Picos correspondientes a los grupos carbonato de precisar la existencia de carbonato de calcio. Así, la Figura 3A y B juntos demuestran concluyentemente la generación de calcita como el compuesto químico precipitado.
Un experimento cualitativo se realizó con el fin de evaluar la capacidad de MICP a cambiar las propiedades de medios porosos. Con este fin, se realizó un experimento con las esponjas que se espera para imitar una porosamedio con una gama de escalas de longitud de las estructuras de poros, tal como se encuentra en una típica estructura natural. Una barra de esponja (Mr. Clean, P & G) se sumergió en una solución de S. pasteurii por un período de 7 días y después se seca. La esponja después de la exposición a largo para el proceso MICP se endureció y se muestra mejorada resistencia a la compresión. Esto se representa en la Figura 4 La esponja, antes de la inmersión (caso control), mostró una compresión significativa cuando se someten a un peso de 1 kg (Figura 4A - B).. Por otra parte, después de ser sometido a la inmersión en el S. solución pasteurii, sufrió obstrucción de los poros debido a la precipitación de calcita resultante. Esto condujo a un aumento masivo de la fuerza resultante de un puente de los espacios de los poros y, posteriormente, activar la barra para soportar la carga de 1 kg sin permitir una compresión significativa (Figura 4 C - D).
Una idea semi-cuantitativaen relación con el proceso de endurecimiento puede ser adquirida a través de mediciones de altura de la desviación de la barra cargada. La muestra de esponja original es una barra rectangular con una altura de 4,5 cm. La desviación de la muestra de control, muy cerca del punto de aplicación de carga, es de aproximadamente 1,6 cm. En el caso de la muestra tratada, la desviación se reduce a 0,6 cm. Además cuantificación rigurosa del proceso de endurecimiento también es posible. Por ejemplo, una explicación mecanicista de este proceso en términos de aumento de la resistencia al cizallamiento, tensión desviadora pico y los ángulos de dilatancia ha sido propuesto por Tagliaferri 25 et. Al través de imágenes de rayos X y la correlación de imágenes digitales.
Figura 1. El perfil del protocolo de cultivo completo Representado como un Esquema algorítmico. Para empezar, Tris-buffer y solución de agar es poured en una placa de Petri. Una vez que la placa de agar está listo, se raya con una punta infestado con la bacteria. La placa se incuba con rayas para crecer colonias individuales. Una de las colonias individuales se transfiere a un matraz de medios de comunicación y se incubaron de nuevo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Las células y los precipitados (A) Las células en el medio de cultivo confinado dentro de un tubo de centrífuga de plomo para borrar la precipitación química observable (después de 5 - 7 días). Que se establece en la parte inferior y es visible a simple vista. (B) Población de bacterias inmovilizadas en una superficie visto bajo contraste de fase. las células en forma de bastoncillos individuales (bacilos, Sp marcado) pueden verse claramente (un par de ellos señala con flechas). (C) Imagen SEM del precipitado blanco que muestra tanto las células (SP) y cristales (CC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los Cristales y su caracterización. Imagen de microscopio (A) electrónica de barrido del precipitado seco. Los cristales individuales y líneas de corte asociados son claramente visibles. (B) X-Ray Foto-electrón Espectroscopía (XPS) gráfico del precipitado químico; picos de espectrometría de masa correspondientes a carbonato grupo funcional reforzar la posibilidad de la existencia de calcita. Por favor, haga clic aquí para VIew una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Un experimento semi-cuantitativa con barras de esponja que sirven como prototipo de medios porosos. (A) y (B) son muestras secas frescas no sumergidas. (C) y (D) son muestras húmedas empapados en una solución de medio y las células; que exhiben un aumento significativo de resistencia del material debido a la obstrucción de los poros resultantes de la precipitación de calcita como se ve aquí de compresión reducida bajo la acción de un peso constante. Las muestras no tratadas son naturalmente porosa y sufren una reducción masiva en el volumen cuando se someten a un peso de 1 kg. Los poros se le vaya el aire y el contrato, lo que lleva a una reducción general de tamaño. Por otra parte, la muestra tratada ha ganado artificialmente una cantidad significativa de la rigidez en virtud de obstrucción de los poros. Esto demuestra una mejora notable de la fuerza cuando se apoya cómodamente la misma carga sin ningún tipo de compresión. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los pasos críticos: Este manuscrito describe en detalle los protocolos para el cultivo de una muestra viable de S. pasteurii. Una vez que el cultivo ha sido preparado, que debe ser enriquecida adecuadamente. Este es un paso clave fundamental para el éxito del experimento debido a una falta de proporcionar el ambiente químico adecuado conduce a cualquiera de las escalas de tiempo muy largos de precipitación o una falta completa de la misma. S. pasteurii es bastante sensible a varios organismos externos y debe ser cultivado con un alto grado de cuidado y precisión para asegurar la solidez bioquímica y repetibilidad. El grado y la dosis de enriquecimiento ahora se sabe que dictará la naturaleza química de precipitación y por lo tanto deben ser controladas con precisión también.
Modificaciones / Solución de problemas: Varios aspectos pueden ser modificados con poca variación en los resultados finales. El recuento en placa no tiene que ser realizada por la técnica descrita anteriormente (por dilución en serie THe Millas Misra Método). Aquí, la dilución en serie se ha realizado en una sola placa de agar dividiéndolo en siete regiones por acordes dibujados en su superficie inferior. Esto no es obligatorio. Es también una práctica común el uso de una placa de agar entera para una dilución particular, mediante la preparación de una placa de propagación. La dilución en serie se realiza en una serie de placas separadas sucesivas y el uno con un número contable de colonias individuales (20 - 200) se elige para el cálculo final. Cualquiera de las diversas otras técnicas de recuento de células se puede aplicar aquí también. Microscopía bien puede ser realizada con hojas de la cubierta simples o diapositivas. Una unidad de cámara no es en absoluto obligatoria.
A veces, las bacterias pueden fallar para formar precipitados. Es útil para transferir una pequeña cantidad de cultivo congelado en un medio líquido primero. El rayado puede llevarse a cabo después del crecimiento se ha producido en el primer líquido.
Limitaciones: Esta es una técnica lenta con una numbre de pasos, una que conduce a otro. Hay posibilidades significativas de la contaminación, la contaminación cruzada y otros defectos culturales en todos los pasos. intenso cuidado debe mantenerse en todo momento. Alrededor de 180 mg de precipitado se forma por ml de solución de cultivo.
Importancia: El presente protocolo se describen en detalle todos los pasos necesarios para asegurar que un cultivo de la bacteria S. pasteurii fielmente precipitados calcita bajo la influencia de enriquecimientos añadidos externamente. Aunque la cultura de esta bacteria en sí es un protocolo bien establecido, todo el proceso de enriquecimiento y cuantificación no lo es. Este tema ha sido abordado aquí.
Aplicaciones futuras: Podría ser posible modular adecuadamente esta bacteria para precipitar de diferentes maneras que a su vez pueden ser diseñados para diversas aplicaciones dependiendo de la naturaleza de precipitados. Se mencionó anteriormente que hayexisten varias incógnitas con respecto a la participación de MICP S. pasteurii. Algunas de estas incógnitas incluyen papel de la dinámica de agregación de S. pasteurii en el proceso de MICP, papel del medio ambiente microescala 26,27 tales como efecto de un medio poroso y el flujo de fluido. Un protocolo estandarizado puede ser desarrollado que asegura la precipitación rápida con una clara oportunidad para la realización adecuada de microscopía multimodo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petridish | Fisher Scientific | FB0875712 | Petridishes being used as Agar plate |
| Pyrex Flasks | Fisher Scientific | S63268 | Corning Erlenmeyer |
| Tris-Base | Promega | H5133 | being used to make Tris-Buffer |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture |
| Agar Powder | Sigma-Aldrich | A1296 | microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder |
| Ammonium Sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | for Molecular Biology |
| Yeast extract powder | Sigma-Aldrich | 51475 | |
| Measuring Cylinder | Cole-Parmer | CP08559GC | Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk |
| Analytical Balance | OHAUS | AX124E | being used to measure weight of reagents |
| Autoclave | Brinkmann | 58619000 | |
| Autoclave Tape | VWR | 52428864 | |
| Aluminum Foil | Sigma-Aldrich | Z185140 | being used to seal the flask before placing it in Autoclave |
| Bacterial Stock | Cedarlane | 11859 | -80 °C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No. |
| Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume | Biohit | 725010 | Marketed by VWR under catalog number 14005976 |
| Micropipette Tip | Fisher Scientific | 212772B | Used for scratching Agar plates |
| Incubator | Binder | 80079098 | Microbiology Incubator,BF Series |
| Shaking Incubator | VWR | 14004300 | VWR Signature Benchtop Shaking Incubators |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P7059 | |
| BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device | BD Biosciences | 357590 | Marketed by VWR under catalog number 53106220 |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Being used to seal Agar plates |
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | Enrichment for nutrient medium |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | Enrichment for nutrient medium |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | Enrichment for nutrient medium |
References
- Gibson, T. An investigation of the Bacillus pasteurii group. Journal of Bacteriology. 28, 491-502 (1934).
- Greenfield, L. J. Metabolism and concentration of calcium and magnesium and precipitation of calcium carbonate by a marine bacterium. Annals of the New York Academy of Sciences. 109, 23-45 (1963).
- Phillips, A. J. Engineered applications of ureolytic biomineralization: a review. Biofouling. 29, 715-733 (2013).
- Dhami, N. K., et al. Biomineralization of calcium carbonates and their engineered applications: a review. Frontiers in microbiology. 4, 314 (2013).
- Cuthbert, M. O., et al. Controls on the rate of ureolysis and the morphology of carbonate precipitated by S. Pasteurii biofilms and limits due to bacterial encapsulation. Ecological Engineering. 41, 32-40 (2012).
- Okwadha, G. D., et al. Optimum conditions for microbial carbonate precipitation. Chemosphere. 81, 1143-1148 (2010).
- Stocks-Fischer, S., et al. Microbiological precipitation of CaCO3. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1563-1571 (1999).
- Lauchnor, E. G., et al. Bacterially induced calcium carbonate precipitation and strontium coprecipitation in a porous media flow system. Environmental science & technology. 47, 1557-1564 (2013).
- Al Qabany, A., et al. Factors Affecting Efficiency of Microbially Induced Calcite Precipitation. Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering. 138, 992-1001 (2012).
- Morita, R. Y. Calcite precipitation by marine bacteria. Geomicrobiology Journal. 2, 63-82 (2009).
- Chafetz, H. S. Marine peloids: A product of bacterially induced carbonate precipitation. Journal of Sedimentary Petrology. 56, 812-817 (1986).
- Biomason.com. , Available from: http://www.biomason.com (2015).
- Whiffin, V. S. Microbial CaCO3 precipitation for the production of biocement. , Murdoch University. PhD thesis (2004).
- Paassen, L. A., et al. Scale up of BioGrout: a biological ground reinforcement method. Proceedings of the 17th International Conference on Soil Mechanics and Geotechnical Engineering. , 2328-2333 (2009).
- Cunningham, A. B., et al. Microbially enhanced geologic containment of sequestered supercritical CO2. Energy Procedia. 1, 3245-3252 (2009).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Cunningham, A. B., et al. Reducing the risk of well bore leakage of CO2 using engineered biomineralization barriers. Energy Procedia. 4, 5178-5185 (2011).
- Jonkers, H. M., et al. Application of bacteria as self-healing agent for the development of sustainable concrete. Ecological Engineering. 36, 230-235 (2010).
- Tobler, D. J., et al. Transport of Sporosarcina pasteurii in sandstone and its significance for subsurface engineering technologies. Applied Geochemistry. 42, 38-44 (2014).
- Mortensen, B. M., et al. Effects of environmental factors on microbial induced calcium carbonate precipitation. Journal of applied microbiology. 111, 338-349 (2011).
- Phillips, A. J., et al. Potential CO2 leakage reduction through biofilm-induced calcium carbonate precipitation. Environmental science & technology. 47, 142-149 (2013).
- Robbins, R. Scanning Electron Microscope Operation. , Available from: http://www.utdallas.edu/~rar011300/SEM/Scanning%20Electron%20Microscope%20Operation.pdf (2010).
- vander Heide, P. X-ray Photoelectron Spectroscopy: An introduction to Principles and Practices. , John Wiley & Sons. (2011).
- Wiley, W. R., et al. Requirement of an alkaline pH and ammonia for substrate oxidation by Bacillus pasteurii. Journal of Bacteriology. 84, (1962).
- Tagliaferri, F., et al. Observing strain localisation processes in bio-cemented sand using x-ray imaging. Granular Matter. 13, 247-250 (2011).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluidics and Nanofluidics. 14, 895-902 (2012).
- Valiei, A., et al. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a chip. 12, 5133-5137 (2012).
- LIVE/DEAD Bacterial Viability kit, Two-color bacterial viability assay. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf, https://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/protocols/live-dead-baclight-bacterial-viability-protocol.html (2004).
