Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Epitelceller Återplantering och framställning av gnagare Extracellular Matrix Byggnadsställningar för njurvävnad utveckling

Published: August 10, 2015 doi: 10.3791/53271
Automatic Translation
1,2, 1,2,3,4, 1,2, 1,2, 5, 6, 7,8, 1,2,3,4,8,9
1Comprehensive Transplant Center, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 4Simpson Querrey Institute for BioNanotechnology in Medicine, Northwestern University, 5Department of Internal Medicine, University of New Mexico HSC, 6Department of Pathology, University of New Mexico HSC, 7Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, 8Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, 9Department of Surgery, Jesse Brown VA Medical Center

ERRATUM NOTICE

Abstract

Detta protokoll detaljer alstringen av acellulära, ännu biofunktionella, njur extracellulär matris (ECM) byggnadsställningar som är användbara som småskaliga modellsubstrat för organ skala vävnadsutveckling. Sprague Dawley råttnjurar kanyleras genom insättning av en kateter in i njurartären och perfuserades med en serie detergenter lågkoncentrerade (Triton X-100 och natriumdodecylsulfat (SDS)) över 26 timmar för att härleda intakta, hela njur ställningar med intakt perfusable kärl, glomeruli, och njurtubuli. Efter decellularisering, är den renala ställningen placeras inuti ett skräddarsytt perfusionsbioreaktor kärlet och kateter njurartären är ansluten till en perfusionskrets som består av: en peristaltisk pump; slang; och valfria sönder för pH, löst syre, och tryck. Efter sterilisering ställningen med perättiksyra och etanol, och balansera pH (7,4), är njuren ställningen förberedd för sådd via perfusion odlingsmedium inom en large-kapacitet inkubator som hölls vid 37 ° C och 5% CO2. Fyrtio miljoner renal kortikal rörformiga epiteliala (RCTE) celler injiceras genom njurartären, och snabbt perfunderades genom ställningen under högt flöde (25 ml / min) och tryck (~ 230 mm Hg) under 15 min innan minska flödet till en fysiologisk hastighet (4 ml / min). RCTE celler befolka främst rörformiga ECM nisch inom njurbarken, förökar sig och bildar tubulära epitelceller strukturer under sju dagar perfusionsodling. En 44 iM resazurin lösning i odlingsmedium perfuseras genom njuren under 1 timme under medel utbyte för att ge en fluorometrisk, redox-baserade metabolisk bedömning av cellviabilitet och spridning under tubulogenesis. Njuren perfusionsbioreaktor tillåter icke-invasiv provtagning av medium för biokemisk bedömning, och flera inloppsportar tillåter alternativa bakåtsträvande sådd genom njurvenen eller urinledaren. Dessa protokoll kan användas för att recellularize njur ställningar med enolika celltyper, inklusive vascular endothelial, tubulär epitel, och stromala fibroblaster, för snabb utvärdering inom detta system.

Introduction

Eftersom antalet patienter som lider av slutstadiet njursvikt fortsätter att öka, det är en allvarlig och växande brist i antalet givar njurar tillgängliga för transplantation. Oförmågan att möta efterfrågan av ett ständigt ökande antal kandidater vänta-listade för njurtransplantation har lett till forskning inom njurorganteknik med det yttersta målet att utveckla kundanpassade, implanterbara njurtransplantat på begäran 1,2. Att bygga fungerande njurvävnad från en patients egna celler skulle eliminera behovet av livslångt immunsuppression, minska den tid patienter tillbringar på dialys väntar på en njurtransplantation, och utöka livräddande transplantation till fler patienter med kronisk njursjukdom.

Det första steget mot bioteknik en njurvävnad med hjälp av patientgenererade celler är att utveckla en byggnadsställning som fungerar som en stödjande substrat för njurparenkym (t.ex. tubulär epitheLial), stroma fibroblast och kärlcelltillväxt. Biomaterial ställningar som härrör från naturliga organextracellulära matriser (ECM) har flera egenskaper som gör dem önskvärda för användning i vävnadsteknik, inklusive deras naturliga biologiska sammansättning; lämplig makro- och mikro att förse fysiologiska funktioner; och cellulära biokompatibilitet, främja celladhesion, migrering och konstruktiv vävnad remodeling 3. En lovande metod för framställning av ställningar för njurvävnadsregenerering är genom decellularisering av allogena eller xenogena njurar som bevarar en stor del av den komplexa naturliga proteinkompositionen av njuren ECM 4, behålla den inneboende arkitektoniska intrikat av organet, och övervinna svårigheten i samband med bottom upp konstruktion av tjocka cellularized vävnader genom att tillhandahålla en vaskulär tillförsel till utvecklings celler efter byggnadsställning recellularization 5.

Perfusion decellularisering är en process ivilka detergenter, enzymer eller andra cellstörande lösningar likformigt avges genom det vaskulära nätverket av organet 6. Denna strategi har etablerats som en effektiv process för att härleda acellulära organbaserade ECM ställningar som tredimensionella (3D), biologiska mallar för hela organteknik 6-8, vilket framgår av utvecklingen av acellulära njur mallar från kasserade mänskliga njurar 9 och xenogena njurar som erhållits från stora djur (t.ex. gris 10, get 11) och gnagare källor 12. I synnerhet användningen av små djurmodeller såsom gnagare kräver färre celler och odlingsmedia, vilket är särskilt användbart för organ recellularization studier där cellantalet är vanligen begränsade, såsom är fallet med stamcellshärledda vävnader. Målet med den beskrivna decellularisering protokollet är att producera ett acellulärt njur ECM som kan användas som en 3D-byggnadsställningssystem för regenerering av njure structures, inklusive nephron tubuli som nyinsatta i föreliggande exempel med humant renalt kortikala tubulära epitelceller (RCTE) -celler. Vi beskrev tidigare vår noggrann utvärdering av en optimal, tvättmedel baserade råttnjure decellularisering protokoll 7, vilket är snabbare (cirka en dag) än andra metoder som tidigare rapporterats (Ross et al .- 5 dagar 12, Song et al .- 4,5 dagar 13), och exponerar organet till en betydligt lägre koncentration (0,1%) av den denaturerings natriumdodecylsulfat (SDS) under decellularisering än tidigare rapporter 12-15.

Ett begränsat antal studier har beskrivit användningen av gnagare njurar för decellularisering och efterföljande användning som en 3D-byggnadsställning för cellulär återinsättning (ses över någon annanstans 1) 12-16. I detta protokoll ger vi en detaljerad beskrivning av vår tidigare fastställda, optimala decellularisering strategi för framställning av acellulära njur byggnadsställningarfrån Sprague Dawley råttnjurar 7. Använda skräddarsydda perfusion bioreaktorer kan dubbla sådd och underhåll perfusionsodling 17, vi recellularize de acellulära njur ställningar med mänskliga RCTE celler, som konsekvent återbefolka den rörformiga komponenten i dessa decellulariserade matriser, föröka sig och överleva i perfusion kultur för över en vecka. Vi visar ytterligare vår användning av resazurin perfusion analys - en billig, icke-cytotoxiska och icke-invasiv metabolic bedömning som tidigare använts för cytotoxicitetsstudier 17 - att ge en indikation på cellviabilitet och spridning inom de recellularized njurar över tiden 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ETIK UTTALANDE: Alla som deltar i djurförsök utfördes enligt riktlinjer som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Northwestern University.

1. Njure decellularisering

  1. Bered decellularisering lösningar. Förbered följande volymer av reagens för varje njure ska decellulariseras, plus en extra volym (t.ex. för 4 njurar, förbereda 5,000 ml Triton X-100 för steg 1.1.3.):
    1. Förbered 500 ml omvänd osmos (ROH 2 O). Obs: Alternativt kan avjoniserat vatten användas i steg där ROH 2 O anges.
    2. Förbered 1000 ml Triton X-100, 1% (volym / volym) i ROH 2 O. Tillsätt långsamt 10 ml Triton X-100 till 990 ml vatten i en stor bägare under snabb omröring på en omrörningsplatta. Låt reagenset för fullständig upplösning före användning (minst 10 minuter).
    3. Förbered 1000 ml Triton X-100, 1% (volym / volym) i ROH 2 O (septemberarate volym).
    4. Förbered 1,000 ml natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1% (v / v) i ROH 2 O. Tillsätt långsamt 5 ml SDS (20% stamlösning) till 995 ml vatten i en stor bägare enligt snabb omröring på en omrörningsplatta. Låt reagenset blandas likformigt före användning (minst 10 minuter).
    5. Förbered 500 ml ROH 2 O (separat volym).
  2. Förbered njurar för decellularisering.
    1. Återställa en njure från en Sprague Dawley råtta (250-300 g) som tidigare beskrivits 7.
      1. Söva råttan genom intraperitoneal injektion av pentobarbital (50 mg / kg kroppsvikt). Ofta undersöka anestesidjupet (varje 10-15 min) genom att övervaka lungfunktion, hjärtfrekvens och tå nypa respons under operation. Om djuret har en förhöjd andningsfrekvens eller positiv pedal reflex, administrera en extra dos (med 1/3 till 1/4 av den initiala dosen) av pentobarbital.
      2. Utför en längsgående mittlinje abdominal snitt för att exponera njurar, bukaortan och den nedre hålvenen.
      3. Spruta 2.000 USP heparin-enheter / kg kroppsvikt i penis ven.
      4. Mobilisera båda njurarna genom varsam dissektion. Ta försiktigt loss njure från perirenalt fett, samtidigt som njurkapseln som omger njuren intakt. Perfundera njurarna med kall saltlösning (10 ml) genom infrarenal abdominal aorta.
    2. Sätt i en 24 gauge kateter i njurartären, tätt ligera katetern till artären, och (med användning av en spruta) försiktigt BEGJUTA njuren med 10 ml kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och fullständigt klar orgeln av blod.
    3. Sänk njure i 25 ml PBS i en petriskål och lägg i en -20 ° C frys gradvis frysa organ (och därigenom framkalla cellys) för lagring tills decellularisering.
      Anmärkning: om så önskas kan den urinledaren och / eller njur venen också kanylerades för retrograd sådd, men inte beskrivs i this protokoll.
    4. Helt tina frusna njure (equilibriate vid rumstemperatur (RT)), och försiktigt BEGJUTA med 10 ml PBS för att kontrollera ligerade njurartärstenos för läckor. Om läckage eller betydande motstånd observeras, åter ANVÄNDA KATETER njurartären.
  3. Förbered utrustning för decellularisering. Montera decellularisering perfusionssystemet såsom avbildas i figur 1B.
    1. Anslut en 8 "längd slangpumpar (Figur 1D, f) till två tillräckliga längder (> 36" rekommenderas) av 1/16 "inre diameter (ID) silikongummi slang (Figur 1D, h). Använd två manliga Luerlås till 1/8 "hullingförsedda adaptrar sällskap av en hona Luer x hona Luer adapter för att ansluta sig till segment av slang (Figur 1D, j). Sätt en ytterligare Luer lås till 1/8 "hullingförsedda adaptern (Figur 1D, c) in i den nedströms belägna änden av perfusionsledningen för fastsättning på den renalaartärkateter.
    2. Anslut varje slangpumpar segment till 4-rullen pumphuvud med hjälp av en stor pumpkassett.
    3. Efter att ha placerat uppströms änden av silikongummi slangen i den första lösningen behållaren (ROH 2 O), håll "Prime" -knappen för att helt prime varje perfusionskretsen med lösning. KRITISK: Kontrollera att inga bubblor förblir infångad i slangen, och att den uppströms änden (vänster öppna för att dra vätska) av silikongummislang är fäst under vätske-luftgränssnittet av reagensbehållaren, såsom visas i figur 1B.
  4. Utför decellularisering protokollet vid RT 7.
    1. Anslut njurartärkateter av varje tinade njure till slutet av perfusionskretsen slangen nedströms från pumpen, som säkerställer att inga luftbubblor är infångade i katetern. Tillåt njuren att hängas längs innerväggen av en tom 5 liter bägare (perfusat uppsamlingsbehållare, se Figure 1B) så att njurartären är inte är vikt eller lindad.
    2. Justera pumpdrivningen till 5 ml / min, och tryck på "Start" -knappen. Bekräfta att varje njure är perfusion genom att observera lösningar droppa från botten av organet.
    3. Perfundera varje njure med följande reagens, såsom beskrivs i figur 1 A
      1. Perfundera med 500 ml ROH 2 O vid 5 ml / min under 1 h, 40 min.
      2. Perfundera med 1000 ml 1% Triton X-100 vid 5 ml / min under 3 h, 20 min.
      3. Perfundera med 1000 ml 1% Triton X-100 vid 1 ml / min under 16 h, 40 min.
      4. Perfundera med 1000 ml 0,1% SDS vid 5 ml / min under 3 h, 20 min.
      5. Perfundera med 500 ml ROH 2 O vid 5 ml / min under 1 h, 40 min.
        Obs: Varje decellulariserad njure kan lagras i PBS (utan tillsatser) i en 50 ml koniskt rör vid 4 ° C under högst två veckor före användning.

2. PerFusion Bioreaktor Assembly, njure Sterilisering, och förberedelse för Recellularization

  1. Förbered bioreaktor fartyg.
    1. Tvätta glas bioreaktor reservoarer (kroppskomponent) och bioreaktor huvuden med varm, utspädd diskmedel lösningar (t.ex.. 1% diskmedel lösning i kranvatten) och skölj noggrant med kranvatten och sedan ROH 2 O. Låt komponenterna torka helt.
    2. Applicera en liten volym (~ 5 ml) av med silikon reagens till botten av varje behållare. Se till att reagenset väter hela bottenytan i flera sekunder och sedan dränera överskottsvätska.
    3. Låt behållarna torka i ett dragskåp vid RT O / N. Alternativt kan reservoarerna torkas i en ugn vid 100 ° C under 30 min för att påskynda torkning och förbättra hållbarheten hos beläggningen, som är avsedd att förhindra vidhäftning av celler till botten av glaset bioreaktorn reservoaren.
  2. Förbered perfusion kretskomponenter för sterilisering (fig1D).
    1. Skär följande slanglängder (för varje bioreaktor):
      1. Klipp två 25 "längder av 1/16" ID silikongummislangen (Figur 1D, h).
      2. Skär en 8 "längd slangpumpar (Figur 1D, f).
      3. Skär en 4,25 "längd 1/16" ID silikongummislangen.
      4. Skär två 1 "längder av tjockväggiga 1/16" ID-silikongummislang (figur 1D, g).
      5. Klipp en 2 "längd 1/4" ID x 0,5 "ytterdiameter (OD) silikongummislang (Figur 1D, e).
    2. Förbered följande Luer adapter (för varje bioreaktor):
      1. Förbered 10 Luer lås till 1/8 "hullingförsedda adaptrar (Figur 1D, c)
      2. Förbered 2 Luer pluggar (Figur 1D, a)
      3. Förbered två kvinnliga Luer lock (figur 1D, b)
      4. Förbered 5 kvinnlig Luerx honluerkoppling adaptrar (x5, Figur 1D, d)
    3. Tvätta alla slangar och Luer adapter med varm, utspädd maträtt detergentlösningar, skölj noga i kranvatten och sedan ROH 2 O, och låt dem torka.
  3. Montera perfusion kretsar.
    1. Lyft 1 "längd tjocka väggar 1/16" ID silikongummislang över inloppet Luer acceptor som finns på huvudet av bioreaktorn. Placera Luer lås till 1/8 "ID hull adaptern i öppna änden av slangen. Upprepa för den andra inlopps Luer acceptor, och anslut en kvinnlig luerlocket att täta port (avsedd för uretär eller venösa sådd tekniker som inte beskrivs i detta protokoll).
    2. Anslut varje 25 "segment av 1/16" ID silikongummislangen till 8 "-segmentet av slangpumpar med hjälp av Luer lås till 1/8" ID hulling och kvinnliga Luer x Luer adapter (Figur 1D, j).
    3. Anslut en öppen ände av silikongummi Tubing till media perfusatet utlopp på utsidan av bioreaktorn huvudet. Anslut 4,25 "längden 1/16" ID slang till det motsatta (inre) sidan av medie perfusat utlopp på insidan av bioreaktor huvudet.
    4. Anslut en Luer lås till 1/8 "ID-hullingförsedda adaptern till den återstående öppna änden av perfusionskretsen slangen. Anslut en kvinnlig Luer x hona Luer-adaptern till Luer lock. Anslut Luer x hona Luer adapter till den öppna Luer lås som leder in i inloppet Luer acceptor på bioreaktorn. Detta kommer att fungera som media perfusatet inloppet som leder direkt till den kateter njurartären.
    5. Se till att inga portar på bioreaktor locket lämnas öppet eller utsätts. Sluter tätt vakuumventilen på bioreaktor kroppen.
    6. Montera bioreaktorn huvudet över behållarkroppen, med en O-ring inklämt mellan de identiska spåren kantar varje komponent. Placera en metallisk klämma över gränssnittet för att hålla de två komponenterna tillsammans.
    7. Montera ventilations porten på bioreaktorn huvudet med en 0,2 mikron ventilationsfilter, som förbinder de två komponenterna med hjälp av en 2 "längd av 1/4" ID x 0,5 "OD silikongummislangen (Figur 1D, e). Öppna avluftningsventilen.
    8. Lossa den röda skruvlock på bioreaktorn huvudet.
    9. Placera de återstående Luer adaptrar och 6 "sågtandade prov tång i en autoklaverbar påse och tätning.
  4. Autoklavera de monterade bioreaktorer och hanluer pluggar.
  5. Förbered följande reagenser för ställnings sterilisering och medieperfusionshastighet innan sådd (volymer listas per decellulariserad njure):
    1. Inom ett dragskåp, framställa en 50 ml 0,1% perättiksyra, 4% etanol-lösning genom att tillsätta 2,56 ml perättiksyralösning (39% slut-koncentration) och 40 ml 200 proof etanol till ~ 957 ml ROH 2 O i en 1 L flaska. Blanda noggrant genom att upprepade gånger vända flaskan, och placera i biologiska säkerhetsskåp.
    2. Förbereden 150 ml 1x PBS-lösning, pre-steriliserades genom autoklavering.
    3. Bered 50 ml DMEM / F12-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin (Pen-Strep).
  6. Samla de återstående posterna för perfusionsbioreaktor montering. Placera alla objekt i en biologisk säkerhet skåp. KRITISK: Se till att den biologiska säkerhetsbänk är utrustad med arbets eluttag för att driva den digitala pumpdrivningen. Alternativt kan du använda en förlängningssladd för att ansluta pump enheten till externa eluttag utanför skåpet.
    1. Samla decellulariserade njurar.
    2. Samla autoklave bioreaktorer med tillhörande perfusion kretsar.
    3. Samla autoklaveras påse innehållande Luer adaptrar och pincett.
    4. Samla digital pumpdrivning med bifogad 4-rulle huvud och stora pumppatroner (1 per perfusionskretsen).
  7. Fullborda perfusionskretsen såsom beskrivs i figur 1C under steril cILLKOR inom en biologisk säkerhet skåp.
    1. Anslut en 3-vägs avstängningskran (Figur 1D, i) mellan han-Luer-låset till 1/8 "ID-hulling adapter nära medie perfusat inloppet och hon-Luer-x hon-Luer-adapter. Lämna alla tre portar på kranen öppen.
    2. Ta bort den röda skruvlocket på bioreaktorn huvudet och pipettera 50 ml av den 0,1% perättiksyra, 4% etanollösning i mediet reservoaren genom öppningen.
    3. Anslut den peristaltiska pumpen slangsegmentet till pumphuvudet med en stor pumpkassett. Justera flödeshastigheten till 5 ml / min, tryck på "start", och tillåta kretsen att prima.
      1. När vätskan fyller perfusionsledningen och når den återstående öppna porten på trevägskran, anslut porten med en Luer plug (Figur 1D, a).
      2. Låt kretsen till fullo prime tills ingen luft observeras i perfusionskretsen slangar eller på insidan av inloppet Luer-acceptor. Om necessarf, öka flödeshastigheten att tillfälligt driva ut bubblor från perfusionsledningen. När brädden stoppa pumpdrivningen.
    4. Plug försiktigt hon-Luer-änden av njurartären kateter i den manliga inlopp Luer-acceptor på den inre ytan av bioreaktom huvudet med de steriliserade 6 "pincett. Kontrollera att anslutningen är tät och att ingen luft kvar i katetern. Låt njuren för att försiktigt hänga från njurartärkateter, så att njurartären inte vrider sig eller kink.
    5. Dra den metalliska klämman som håller samman bioreaktorn huvud och kropp, så att bioreaktorn reservoaren är tätt tillsluten. Stäng röda skruvlock på bioreaktorn huvudet.
  8. Sterilisera njurar vid RT genom perfusion med 0,1% perättiksyra, 4% etanol-lösning vid 5 ml / min under 1 h, sedan tre sekventiella 1-hr perfusioner vid RT med 50 ml PBS vid 5 ml / min.
    1. Ändra lösningar:
      1. Efter 1 timme, stoppa pumpen och öppna röd skruvlock. Med hjälp av en sterile (autoklav) pasteurpipett försiktigt aspirera all lösning från bioreaktorn reservoaren. Låt perfusionskretsen till brädden.
      2. Pipett 50 ml färsk lösning i bioreaktorn behållaren, stäng skruvlock, och starta pumpen.
  9. Efter den sista PBS-sköljning, aspirera PBS från reservoaren och pipetten i 50 ml DMEM / F12-medium kompletterat med 10% FBS och 1% Pen-Strep. Stäng skruvlocket, och överföra bioreaktorn med bifogade perfusionskretsen till en stor kapacitet inkubator som hölls vid 37 ° C och 5% CO2.
  10. Om det är nödvändigt, överföra pumpdrivningen till inkubatorn. Anslut bioreaktor perfusionskretsen till pumpen, och BEGJUTA njurarna vid 4 ml / min under minst 1 h före sådd.

3. Njure Recellularization med Renal kortikala tubulära epitelceller

  1. Varma tillräckliga volymer av DMEM / F12 (kompletterat med 10% FBS och 1% Pen-Strep) och cell dissociera enzym för cell lyft till 37 ° C. Föreslagna volymer är listade nedan:
    1. Förbered 10 ml cell dissociation enzym och 10 ml DMEM / F12 per 175 cm2 odlingskolv för lyft.
    2. Förbered 5-10 ml DMEM / F12 per njuren för att seedas.
  2. Samla tillräckligt många odlingskolvar för den önskade sådd koncentration (4 x 10 7 förevigat mänskliga RCTE celler 18 per njurresulterar i maximal ympning av RCTE celler använder denna sådd strategi).
  3. Hiss celler från flaskorna med hjälp av cell dissocierande enzym. Sug mediet från kolven, sedan pipett 10 ml cell dissociation enzym i kolven. Placera kolven i 37 ° C inkubator för att påskynda dissociation.
  4. Kontrollera kolven på ett faskontrastmikroskop varje 2 min tills fullständig dissociation av cellerna från kolvytan observeras. Obs: Inkubationstiden varierar beroende på graden av sammanflödet av celler, men RCTE celler rEquire ca 15 min till fullo dissociera.
  5. Ta ett prov av dissocierad cellsuspensionen för att räkna innan pelletering. Späd cellsuspensionen med en lika stor volym av förvärmda DMEM / F12-medium, och centrifugera vid 232 x g relativ centrifugalkraft (RCF) under 5 min.
  6. Räkna celler under centrifugering. Späd det erhållna provet med en lika stor volym av trypanblått, och pipettera 10 pl i varje ände av en hemacytometer för räkning. Beräkna nödvändig pellets vid utspädning för att erhålla den önskade sådd koncentration (2 x 10 7 celler / ml).
  7. Efter centrifugering, späd pelleten med en lämplig volym av odlingsmedium för erhållande av en slutkoncentration av 2 x 10 7 celler / ml. Upprätta 2 ml av sådd suspensionen i en steril 5 ml spruta.
  8. Överför perfusionsbioreaktor till en biologisk säkerhet skåp. Vrid kranen ventilen att stänga flödet till sådd porten. Ta bort Luer slip kontakten urkranen, och anslut sprutan laddad med sådd fjädring.
  9. Snabbt överföra perfusionskretsen tillbaka till inkubatorn, och använda den stora pumpkassetten för att säkra den peristaltiska pumpen slangsegmentet till pumphuvudet.
  10. Cell sådd: Stäng kranen ventilporten pekar mot pumpen. Långsamt injicera cellsuspensionen i njuren, se till att hela suspensionen överförs från sprutan i kranen och perfusion linje. Vrid kranen ventilen att stänga flödet från sprutan, och starta pumpen vid 25 ml / min under 15 minuter.
  11. Efter 15 minuter, sänka pumpflödeshastigheten till 4 ml / min. Växlingsmediet (100 ml volym för efterföljande ändringar) följande dag och därefter varannan dag.

4. Utvärdering av cellviabilitet och spridning med hjälp av Resazurin Perfusion analys

  1. Förbered resazurin reagens. Lös 110,5 mg resazurin natriumsalt i 100 ml PBS under omrörning, och utspädd 1:10 genom tillsättning av 5 ml av denresulterande lösningen till 45 ml färsk PBS för att skapa en 440 iM resazurin stamlösning. Filter-sterilisera (under användning av en 0,2 | j, m sprutfilter), och lagra förrådslösningen i en ljus-skyddad 50 ml koniskt rör vid 4 ° C.
  2. Förbered resazurin-kompletteras media kontroller. Bered en 10% lösning av resazurin reagens i odlingsmedium (t ex. 5 ml resazurin stamlösning + 45 ml odlingsmedium) för att skapa resazurin arbetslösning. Autoklav en 10 ml volym av resazurin arbetslösning i en ljus-skyddad behållare. Obs: Detta kommer helt att minska resazurin föreningen att resorufin, och kommer att fungera som en positiv kontroll för att beräkna procent resazurin minskning.
  3. Alikvotera 1 ml vardera av resazurin arbetslösning (oxiderad), autoklav resazurin arbetslösning (reducerat) och odlingsmedium enbart (tom) i separata 1,5 ml uppsamlingsrör. Placera de öppna rören i samma inkubator som perfusion bioreaktorer.
  4. Överför njur perfusionkrets från inkubatorn till ett biologiskt säkerhetsskåp. Avlägsna skruvlocket från bioreaktorn huvudet, och aspirera odlingsmedium från bioreaktorn reservoaren med användning av en pasteurpipett.
  5. Pipettera 10 ml av resazurin arbetslösning i reservoaren, nära skruvlock, och överföra njuren perfusionskretsen tillbaka till inkubatorn.
  6. Starta pumpen vid 4 ml / min och tillåta reagens att perfundera genom njurarna för exakt en timme.
  7. Efter 1 timme, stoppa pumpen och överföra njuren perfusionskretsen till biologisk säkerhet skåp.
  8. Samla rade (delvis reducerat) resazurin lösning och tillsätt 100 ml odlingsmedium till bioreaktorn behållaren. Överföring perfusionskretsen till inkubatorn, och återuppta flödet (4 ml / min).
  9. Tillsätt 100 pl (x 3 replikat) rade resazurin lösning, resazurin arbetslösning, autoklaveras arbetslösning, och odlingsmedia ämnet till en svart (opakt) 96 brunnar analysplatta. Läs fluorescensintensitet (excitation: 540/35; emission: 590/20) med användning av en spektrofotometer.
  10. Beräkna procentuell reduktion som ett förhållande mellan fluorescensintensiteterna normaliseras genom fluorescensintensiteten (Fl) som uppstår genom den oxiderade resazurin mediet (ORM, eller resazurin arbetslösning inte exponeras för celler) eller den reducerade resazurin mediet (RRM, eller autoklaveras arbetslösning):% minskning = 100 x {[FI (rade resazurin lösning) - FI (ORM)] / [FI (RRM) - FI (ORM)]}. För att normalisera resultaten multipliceras% minskning av cirkulerande blodvolym (10 ml) och dividera med inkubationstiden (1 h).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Njurar sekventiellt perfusion med vatten och utspädd detergentlösningar (1% Triton X-100, 0,1% SDS) enligt en tidigare fastställda, optimala decellularisering protokollet (se figur 1A, B) 7, blivit allt öppnare under en 26 timmarsperiod, som visas i figur 2A. Den resulterande acellulära njur ställningen saknar celler och behåller en sammanhängande njur ECM stöds av en intakt njurkapseln, vilket är oskadad efter perfusion protokoll. Genom den slutliga tvättmedels perfusionen (SDS), njurens vaskulära nätverket, och i synnerhet de interlobar kärlen, visas tydligt i den decellulariserade byggnadsställningar, på grund av den större tjockleken hos dessa blodkärl i förhållande till den förhållandevis tunna basalmembranet av nefronet tubuli ( se fig 2A, B). Hela organ rensas av inhemska celler, lämnar bakom intakt basalmembranet nätverk av glomeruli, tubuli och collecting kanaler och ECM av decellulariserade blodkärl, inklusive intern och extern elastisk lameller av kortikala interlobulära artärer (se figur 2B, C). Förutom de större fartygen, de mikrovaskulära basalmembraner inom glomeruli behåller också strukturell integritet (se figur 2B, C).

Decellulariserad njurar lagras i PBS vid 4 ° C för att begränsa den naturliga hydrolytisk försämring av njur ECM, och bör användas inom 2 veckor decellularisering. Vi har tidigare beskrivit i detalj utformningen av en anpassad perfusion baserad njure bioreaktor som används för både sådd decellulariseras gnagare njur ställningar, och långsiktig kultur recellularized organ i flödet 17. För recellularization, en perfusionskretsen sammansatt av liten diameter silikongummi och utmattningsbeständiga PharMed pumpslangen används för att dirigera odlingsmedium från bioreaktorn reservoaren, till en peristaltisk pump, ochtillbaka till inloppet Luer acceptorn till vilken kateter njurartären är förbunden vid den inre ytan av bioreaktorn huvudet (se figur 1C). Efter sterilisering av decellulariserade njure genom perfusion med ett perättiksyra / etanol-blandning, är perfusionssystemet prepped för sådd genom att cirkulera standardodlingsmedium (innehållande 10% FBS för att förbättra cell ECM vidhäftning) genom ställningen inne i inkubatom.

De decellulariserade njurar kan nu tjäna som acellulära ECM mallar för recellularization, som vi tidigare har utfört med hjälp av inducerade pluripotenta stamceller som härrör från endotelceller för revaskularisering 7. Här visar vi nyttan av denna byggnadsställning och perfusionsbioreaktor system för tubulogenesis med användning av humana härledda renala kortikala tubulära epitelceller (RCTE) celler. RCTE celler ympas in i njur byggnadsställningar genom njurartären under ett högt tryck perfusion protokoll som har beskrivits tidigare 7, 17 .RCTE celler infunderas på detta sätt hem i första hand till de kortikala regionerna i njuren, där de företrädesvis återbefolka de periglomerular tubuli (se figur 3A). Några celler bädda inom glomeruli vid dag 1 efter sådd och dag 7, glomeruli är praktiskt taget saknar celler. Under perfusionsodling är mediet byts var 2 dagar, vid vilken punkt resazurin perfusion analysen samtidigt utförs för att ge jämförande bedömningar av cellviabilitet över tiden (se figur 3B). Som stöds av resazurin minskning resultaten RCTE celler förökar inom 3D ECM, bildar tätt organiserad, patent rörkonstruktioner från dag 7. Medan majoriteten av dessa celler upptar kortikala regioner i njur ECM, efter 7 dagar av antegrad perfusion kultur många RCTE kantade tubuli är närvarande i den yttre medullär och papillära tubuli och samla kanaler (se Figur 4). Efter återplantering med RCTE celler och en vecka perfusion kultur, öppenhet observerades efter decellularisering förloras, och recellularized njuren visas ogenomskinlig och närmare utseendemässigt till dess naturliga tillstånd (se figur 4).

Figur 1
Figur 1:. Njure decellularisering System och protokoll och Recellularization perfusionskretsen (A) Perfusion schema av reagens för decellularisering av gnagare njurar. De reagens som används för decellularisering, volumetriska flödeshastigheten, och varaktigheten för varje steg visas. (B) Perfusion decellularisering set-up. Lösningar pumpas en riktning från en reagensbehållare till en perfusatet uppsamlingsbehållare genom individuella flödeslinjer för varje njure genomgår decellularisering. Upp till fyra njurar kan decellulariseras per peristaltisk pump. (C) perfusionskretsen for sådd och kultur recellularized njur ställningar. Cellerna laddas via en spruta ansluten direkt uppströms om inloppsmottagare Luer. Valfria in-line-sensorer för övervakning av tryck, upplöst syre (DO 2), och pH-värdet kan placeras uppströms bioreaktor. Den digitala peristaltiska pumpen kan styras av datorn, och undertryck (undertryck) kan användas för att underlätta ureteral sådd. (D) Komponenter som används för att skapa perfusion linjer för decellularisering (B) och recellularization (C). (A) Luer plug, (b) Luer lock, (c) Luer lås till 1/8 "hullingförsedda adapter, (d) Luer till hona Luer adapter, (e) ¼" ID silikonslang, (f) slangpumpar, g: tjockväggiga 1/16 "ID-silikongummislang, (h) 1/16" id silikongummislang, (i) trevägskran, (j) kopplare som används för att förbinda segment av slangen genom att kombinera två 1/8 "hulling till hanluer adaptrar (c) med enLuer till hona Luer kopplare (d). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2:. Representativa resultat av Kidney decellularisering representant brutto och mikroskopiska bilder visas av njurar före och efter decellularisering. (A) Tidsförlopp serie av en njure som genomgår decellularisering. Bilderna visas omedelbart efter perfusion med varje reagens anges. Efter perfusion av 0,1% SDS (natriumdodecylsulfat), är bevarat vaskulära nätverket synlig. (B) Representativa bilder av nativa eller decellulariserade njurar snittades och färgades med hematoxylin och eosin (H & E). ECM arkitektur mikro funktioner, inklusive glomeruli, samla kanaler, Och blodkärl är välbevarad efter decellularisering. (C) svepelektronmikro jämföra glomeruli och tubuli i infödda (översta raden) och decellulariserad (nedersta raden) njurar. Efter avlägsnande cell, öppna tubuli är utbredda i hela njuren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. Representativa resultat från humana renala kortikala Tubular Epithelial Recellularization av decellulariserade råttnjurar njurar recellularized genom en högtrycksantegrad arteriell perfusion teknik som resulterar i RCTE celladhesion främst njurtubuli av hjärnbarken. (A) företrädare på hög förstoring bilder (20X) av hematoxylin och eosin-färgade histologiska sektioner av recellularized ställningar 1, 3 eller 7 dagar efter sådd. Övre raden visar att cellerna upptar periglomerular rörformiga utrymme trots att injiceras genom den arteriella kärl, vilket tyder på att de föredrar den tidigare njur ECM nisch. Gula pilspets pekar på en afferent arteriol med en lumen som saknar celler. Nedre raden visar kortikala tubuli där RCTE celler förökar sig, med ökande celltätheten över en vecka, och bildar tätt packade rörformiga epitelceller strukturer. (B) En liten (10 ml) volym av resazurin-kompletterat odlingsmedium återcirkuleras genom njurarna vid tidpunkten för byte av medium. Under 60 min av perfusion, celler reducerar oxiderade resazurin föreningen (blå) till resorufin (röd), som alstrar en höggradigt fluorescerande signal i proportion till antalet celler i njuren. I överensstämmelse med den observerade ökningen av celltäthet sett inom de histologiska bilder, procent resazurin minskning ökar över kultur time med celltillväxt, vilket ger en icke-invasiv indikation på både cellviabilitet och proliferation vid underhållskultur. Resultaten presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (n = 4 recellularized njurar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
. Figur 4: representativa resultat: Jämförelse av Native, decellulariserade och Recellularized Njurar låg förstoring histologiska bilder visar njurbarken, övergångszon mellan hjärnbarken och yttre märgen, och märg papillceller regioner inhemska njurar (övre raden), decellulariseras (Decell; mellersta raden), och 7-dagars RCTE-recellularized (7 Dag Recell, nedersta raden) ställningar. Den streckade linjen visar den ungefärliga gränsen mellan njurbarken (C) och den yttre märgen (M). Brutto bilder visar en njure i sitt naturliga tillstånd efter tillvaratagandet, efter decellularisering och 7 dagar efter sådd av RCTE celler genom njurartären. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrivna decellularisering protokollet konsekvent ger en helt acellulärt njure ECM som fungerar som en 3D-mall för odling av humana njur kortikala tubulära epitelceller (både proximala och distala tubuli härrörande), förutom vaskulära endotelceller 7,17. Den kanyl njurkärl fungerar som det viktigaste inslaget för jämn tillförsel av reagenser och celler i hela ställningen inom en bioreaktor set-up, vilket gör det möjligt för perfusion decellularisering, cellsådd, långsiktig perfusion kultur och resazurin perfusion protokoll. Som sådan, korrekt kanylering av njurartären före organperfusion är kritisk, och särskild försiktighet måste vidtas för att se till att njurartären inte hindras eller skadad, och att katetern är säkrad. Sprague Dawley som njurarna återvinns måste system hepariniseras att undvika koagulering inom kärlsystemet under tillvaratagande av organ, som intravaskulära blodproppar inte kan be bort, och kan hämma fullständig decellularisering av njuren.

Den perfusionsbioreaktor används för sådd och perfusionsodling av recellularized njurar är utformad så att flera sådd metoder in situ 17. Förutom den arteriella injektionsteknik som beskrivs här, kan celler injiceras retrograd genom den kateteriserad urinledaren eller njurvenen. Vidare är bioreaktorn kroppen försedd med en ventil som medger applicering av negativt tryck (partiellt vakuum; se figur 1C), för uretär sådd. Oavsett vilken sådd strategi utnyttjas, är perfusion odlingsmedium antegrad genom njurartären avgörande för adekvat näringsämne (t.ex. syre, glukos) leverans till sådda celler.

Den beskrivna recellularization protokoll visar vår användning av decellulariserade njur matriser för att tjäna som mallar specifikt för epitel tubulogenesis. Vi har dock tidigare shegna som njur matris stöder också återendotelisation av den kvarhållna vaskulära nätverket och kan vara fodrade med mänskliga inducerade pluripotenta stamceller som härrör från endotelceller, vilket är en viktig observation för eventuella långsiktiga transplantation av recellularized njurar i djurmodeller genom att förhindra trombotiska ocklusion av njurkärl 7. En aktuell hinder för eventuella uppskalning av njur recellularization protokoll till stora djurnjur byggnadsställningar är det betydligt större antalet celler som krävs för att återbefolka människa stora njur ställningar. Effektiva seedning strategier, såsom högtrycks arteriell injektionsteknik som beskrivits ovan, är kritiskt behövs för att maximera antalet celler som ympas inom den decellulariserade ECM. Med tanke på den heterogena cellulära sammansättningen av den nativa njuren, kan flera sådd metoder i slutändan att krävas för att på ett effektivt sätt återbefolka de olika extracellulära njur nischer med olika celltyper som Collectivt utföra många funktioner i njurarna, inklusive filtrering, resorption, koncentration av urin, och hormonsyntesen.

Slutligen resazurin perfusion analysen visade i denna artikel ger en icke-invasiv, giftfri bedömning av cellviabilitet och spridning under långtidsodling 7,17,18. Analysen ger omedelbar feedback på det metabola tillståndet av celler som växer inom njur ställningar, och när regelbundet utförs i mellan regelbundna medel börser, kan användas för att karakterisera celltillväxt över tiden. Den resazurin reagenset är billigt, analysen kräver lite tid för att utföra (1 timme), och det är en mer konservativ analysmetod för att karakterisera cellproliferation eller metaboliska trender jämfört med histologisk utvärdering, som kräver avlivning av recellularized ställningen. Den resazurin perfusion analysen kan också anpassas för utvärdering av cellpopulationer under tillväxt inom andra recellularized organ eller vävnader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO VWR M143-4L
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O Sigma-Aldrich 05030
Peracetic acid solution, purum, ~ 39% in acetic acid (RT) Sigma-Aldrich 77240 Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles).
200 proof ethanol VWR V1001TP
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces Sigma-Aldrich SL2 For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent.
DMEM/F12 media Life Technologies 11320-033
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech Corning 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin Corning 30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol Red Life Technologies 12605-028 Referred to in text as cell dissociating enzyme.
Trypan Blue Stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Resazurin sodium salt Sigma-Aldrich R7017
Equipment:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC Cole-Parmer EW-07522-20
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. Cole-Parmer EW-07519-70 Referred to in text as large pump cartridge.
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. Cole-Parmer EW-07519-06
Straight 6" specimen forceps, serrated VWR 82027-438
*Kidney perfusion bioreactor WilMad Labglass *Custom designs Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication.
Perfusion Circuit Components
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) BD Biosciences 381412 Referred to in text as 24 gauge catheter.
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' Cole-Parmer HV-06508-14 Referred to in text as peristaltic pump tubing.
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/pack Cole-Parmer HV-06411-62 Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. Cole-Parmer HV-96410-14 Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing.
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD VWR 89068-484
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences VWR 28143-558 Referred to in text as 0.2 micron vent filter.
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/pk Cole-Parmer T-45505-11 Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-58
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-22 Referred to in text as female Luer x female Luer adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs Careforde Healthcare 10254821 Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L.
Other Components
5 ml BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. BD Biosciences 309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish BD Biosciences 353001 Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
  2. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  3. Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
  4. Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
  5. Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
  6. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
  7. Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
  8. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
  9. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
  10. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  11. Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
  12. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  13. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
  14. Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
  15. Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
  16. Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
  17. Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
  18. Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
  19. Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).

Tags

Bioteknik Bioreactor cellsådd decellularisering extracellulärmatrix epitel njure perfusion recellularization njur- resazurin byggnadsställning tissue engineering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 03/03/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

Epitelceller Återplantering och framställning av gnagare Extracellular Matrix Byggnadsställningar för njurvävnad utveckling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y.,… More

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y., Zhang, Z. J., Ward, H. H., Wandinger-Ness, A., Miller, W. M., Wertheim, J. A. Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development. J. Vis. Exp. (102), e53271, doi:10.3791/53271 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter