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Bioengineering

Ripopolamento cellule epiteliali e preparazione di roditori matrice extracellulare Ponteggi per lo sviluppo del tessuto renale

doi: 10.3791/53271 Published: August 10, 2015

ERRATUM NOTICE

Abstract

Dettagli Questo protocollo la generazione di acellulare, ancora biofunzionali, renali matrice extracellulare (ECM) ponteggi che sono utili come piccoli substrati del modello di sviluppo tessuto dell'organo scala. Sprague Dawley reni di ratto sono cannulati inserendo un catetere nell'arteria renale e perfusi con una serie di detergenti bassa concentrazione (Triton X-100 e sodio dodecil solfato (SDS)) su 26 hr derivare intatte, impalcature intero renali con intatta vascolarizzazione perfusable, glomeruli e tubuli renali. Dopo decellularization, l'impalcatura renale si deposita in un recipiente perfusione bioreattore progettati su misura, e l'arteria renale cateterizzato è collegato ad un circuito di perfusione costituito da: una pompa peristaltica; tubi; e sonde opzionali per pH, ossigeno disciolto, e la pressione. Dopo la sterilizzazione il ponteggio con acido peracetico ed etanolo, e del bilanciamento del pH (7,4), il ponteggio rene viene preparato per la semina tramite perfusione di terreno di coltura in un large capacità incubatore mantenuto a 37 ° C e 5% CO 2. Quaranta milioni corticale epiteliali tubolari (RCTE) cellule renali vengono iniettate attraverso l'arteria renale e rapidamente perfusi attraverso scaffold sotto alto flusso (25 ml / min) e pressione (~ 230 mmHg) per 15 min prima di ridurre la portata ad una frequenza fisiologica (4 ml / min). Cellule RCTE popolano soprattutto la ECM nicchia tubolare all'interno della corteccia renale, proliferano e formano strutture epiteliali tubulari oltre sette giorni di coltura perfusione. Una soluzione resazurina 44 micron in terreno di coltura è perfuso attraverso il rene per 1 ora durante gli scambi medi per fornire un fluorimetrico, basato redox-valutazione metabolica di vitalità e proliferazione cellulare durante tubulogenesi. Il bioreattore perfusione renale consente campionamento non invasivo di media per la valutazione biochimica, e molteplici luci di immissione permettono semina retrograda alternativo attraverso la vena renale o dell'uretere. Questi protocolli possono essere usati per recellularize scaffold renali convarietà di tipi cellulari, tra cui cellule endoteliali vascolari, epiteliale tubulare, e fibroblasti stromali, per la valutazione rapida all'interno di questo sistema.

Introduction

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Poiché il numero di pazienti affetti da insufficienza renale all'ultimo stadio continua ad aumentare, vi è una carenza grave e crescente nel numero di donatori reni disponibili per il trapianto. L'incapacità di soddisfare la richiesta di un numero sempre crescente di candidati wait-vendita per il trapianto di rene ha spinto la ricerca in ingegneria organo rene con l'obiettivo finale di sviluppare su misura, innesti renali impiantabili su richiesta 1,2. Costruire funzionante tessuto renale dalle stesse cellule del paziente eliminerebbe la necessità di immunosoppressione per tutta la vita, diminuire la quantità di tempo che i pazienti trascorrono in dialisi in attesa di un trapianto di rene, ed estendere il trapianto salvavita a più pazienti con malattia renale cronica.

Il primo passo verso bioingegneria un tessuto renale utilizzando cellule derivate da pazienti è quello di sviluppare un patibolo che funge da substrato di supporto per parenchima renale (ad es epithe tubolareLIAL), stroma fibroblasti, e la crescita delle cellule vascolari. Ponteggi biomateriale derivati ​​da organi naturali matrici extracellulari (ECM) hanno diverse caratteristiche che li rendono auspicabile per l'uso in ingegneria dei tessuti, compresa la loro composizione naturale biologico; macro e microstruttura opportuno dotare funzione fisiologica; e biocompatibilità cellulare, promuovendo l'adesione cellulare, la migrazione e il tessuto costruttivo rimodellamento 3. Un metodo promettente per la produzione di scaffold per la rigenerazione dei tessuti renali è attraverso decellularization di allogenici o xenogenici reni che conserva gran parte della complessa composizione proteina naturale della ECM rene 4, conservano la complessità architettonica intrinseca dell'organo, e superare le difficoltà associate con bottom up ingegneria dei tessuti cellularized spessore, fornendo un apporto vascolare alle cellule in via di sviluppo dopo patibolo Recellularization 5.

Perfusione decellularization è un processo inquali detergenti, enzimi, o altre soluzioni cellule interrompendo sono uniformemente forniti tramite la rete vascolare dell'organo 6. Questa strategia è stata stabilita come un processo efficiente per ricavare acellulare ponteggi ECM organo-based come tridimensionale (3D), modelli biologici per l'ingegneria intero organo 6-8, come dimostra lo sviluppo di modelli renali acellulari da scartati reni umani 9 e reni xenogeniche ottenuti da grande animale (ad esempio maiale 10, capra 11) e le fonti roditori 12. In particolare, l'uso di piccoli modelli animali come roditori richiede meno cellule e terreni di coltura, che è particolarmente utile per gli studi di organo Recellularization in cui i numeri di cellule sono in genere limitate, come è il caso con i tessuti derivati ​​dalle cellule staminali. L'obiettivo del protocollo decellularization descritto è quello di produrre un ECM renale acellulare che può essere utilizzato come sistema di ponteggio 3D per la rigenerazione di structur renees, tra cui tubuli nefrone che si ripopolò nel presente esempio con renale corticale epiteliali tubulare umano (RCTE), le cellule. Abbiamo precedentemente descritto la nostra rigorosa valutazione di un ottimale, basato detergente protocollo ratto decellularization rene 7, che è più rapida (circa un giorno) rispetto ad altri metodi in precedenza segnalati (Ross et al .- 5 giorni 12: Song et al .- 4,5 giorni 13), ed espone l'organo ad una concentrazione notevolmente inferiore (0,1%) del solfato di sodio dodecil denaturante (SDS) durante decellularization di relazioni precedenti 12-15.

Un numero limitato di studi hanno descritto l'uso di reni roditori per decellularization e il successivo utilizzo come impalcatura 3D per il ripopolamento cellulare (recensione altrove 1) 12-16. In questo protocollo, forniamo una descrizione dettagliata della nostra precedentemente stabilito, la strategia ottimale per la produzione di ponteggi decellularization renali acellularida Sprague Dawley reni di ratto 7. Utilizzando bioreattori a perfusione progettati su misura in grado di doppia semina e manutenzione perfusione cultura 17, abbiamo recellularize i ponteggi renali acellulari con le cellule umane RCTE, che, sistematicamente, ripopolare il tubolare in queste matrici decellularized, proliferano, e sopravvivono nella cultura perfusione per oltre una settimana. Si dimostra ulteriormente il nostro uso del test resazurina perfusione - un poco costoso, non citotossica e valutazione metabolica non invasivo precedentemente utilizzato per studi citotossicità 17 - fornire un'indicazione della vitalità cellulare e la proliferazione nei reni recellularized nel tempo 7.

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Protocol

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ETICA DICHIARAZIONE: Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida approvate dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale della Northwestern University.

1. Rene Decellularization

  1. Preparare soluzioni decellularization. Preparare i seguenti volumi di reagenti per ciascun rene da decellularized, più un volume aggiuntivo (ad esempio, per 4 reni, preparare 5.000 ml Triton X-100 per passo 1.1.3.):
    1. Preparare 500 ml di acqua di osmosi inversa (ROH 2 O). Nota: In alternativa, l'acqua deionizzata può essere utilizzato in fasi in cui è indicato ROH 2 O.
    2. Preparare 1.000 ml Triton X-100, 1% (v / v) in ROH 2 O. Aggiungere lentamente 10 ml di Triton X-100-990 ml di acqua in un grande bicchiere sotto rapida agitazione su un piatto mescolare. Lasciare che il reagente per sciogliere completamente prima dell'uso (almeno 10 minuti).
    3. Preparare 1.000 ml Triton X-100, 1% (v / v) in ROH 2 O (SEPVolume arate).
    4. Preparare 1.000 ml di sodio dodecil solfato (SDS), 0,1% (v / v) in ROH 2 O. Lentamente aggiungere 5 ml SDS (20% soluzione di riserva) per 995 ml di acqua in un grande bicchiere sotto agitazione veloce su un piatto mescolare. Lasciare che il reagente di mescolare in modo uniforme prima dell'uso (almeno 10 minuti).
    5. Preparare 500 ml ROH 2 O (volume separato).
  2. Preparare reni per decellularization.
    1. Recuperare un rene da un maschio ratti Sprague Dawley (250-300 g) come descritto in precedenza 7.
      1. Anestetizzare ratto mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital (50 mg / kg di peso corporeo). Esaminare Spesso la profondità dell'anestesia (ogni 10-15 minuti) per il monitoraggio della funzione respiratoria, frequenza cardiaca, e la risposta pizzico piedi durante l'intervento chirurgico. Se l'animale ha una frequenza respiratoria elevata o pedale positiva reflex, somministrare una dose supplementare (con 1/3 a 1/4 della dose iniziale) di pentobarbital.
      2. Eseguire una linea mediana abdomina longitudinalel 'incisione per esporre i reni, aorta addominale, e la vena cava inferiore.
      3. Iniettare 2.000 USP di eparina Unità / kg di peso corporeo nella vena del pene.
      4. Mobilitare entrambi i reni per gentile dissezione. Separare con cura il rene dal grasso perirenale, pur mantenendo la capsula renale, che circonda il rene intatto. Perfusione reni con soluzione salina fredda (10 ml) attraverso infra-renale aorta addominale.
    2. Inserire un catetere calibro 24 nella arteria renale, strettamente legare il catetere per l'arteria, e (usando una siringa) profumato delicatamente il rene con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) per cancellare completamente l'organo di sangue.
    3. Immergere rene in 25 ml di PBS all'interno di una capsula di Petri e posto in una -20 ° C freezer a congelare gradualmente l'organo (in modo da indurre la lisi cellulare) per la memorizzazione fino decellularization.
      Nota: se desiderato, l'uretere e / o renale vena può anche essere cannulata per la semina retrograda, anche se non descritti in thiprotocollo s.
    4. Completamente scongelare il rene congelato (equilibriate a temperatura ambiente (RT)), e profumato delicatamente con 10 ml di PBS per controllare la legatura dell'arteria renale non vi siano perdite. Se si osservano perdite o resistenza significativa, ri-cateterizzare dell'arteria renale.
  3. Preparare attrezzature per decellularization. Assemblare il sistema di perfusione decellularization come illustrato nella Figura 1B.
    1. Collegare un 8 "lunghezza del tubo della pompa peristaltica (Figura 1D, f) a due lunghezze sufficienti (> 36" raccomandati) di 1/16 "di diametro (ID) tubi in gomma di silicone interno (Figura 1D, h). Utilizzare due maschi Luer lock per 1/8 "adattatori spinato uniti da una femmina Luer x adattatore Luer femmina per unire i segmenti di tubo (Figura 1D, j). Inserire un ulteriore blocco Luer maschio a 1/8 "adattatore spinato (Figura 1D, c) nella estremità a valle della linea di perfusione per il fissaggio al renalecatetere in arteria.
    2. Collegare ogni segmento tubo della pompa peristaltica alla testa della pompa a 4 rulli con una grande cartuccia pompa.
    3. Dopo aver posizionato l'estremità a monte del tubo di gomma al silicone nel primo serbatoio di soluzione (ROH 2 O), tenere premuto il tasto "Prime" pienamente primo ogni circuito di perfusione con soluzione. CRITICO: Verificare che nessuna bolla rimane intrappolata nel tubo, e che l'estremità a monte (sinistra aperta per disegnare liquido) del tubo di gomma di silicone è fissato sotto dell'interfaccia liquido-aria del serbatoio del reagente, come illustrato nella Figura 1B.
  4. Eseguire il protocollo decellularization a RT 7.
    1. Collegare il catetere dell'arteria renale di ciascun rene scongelato alla fine del tubo del circuito di perfusione a valle della pompa, in modo che le bolle d'aria sono intrappolate nel catetere. Consentire il rene da sospendere lungo la parete interna di un 5 L beaker (serbatoio di raccolta perfusato vuoto, vedere Figure 1B) in modo che l'arteria renale non è piegato o attorcigliato.
    2. Regolare l'unità pompa di 5 ml / min, e premere il pulsante "Start". Verificare che ciascun rene è perfusione osservando soluzioni gocciolamento dalla parte inferiore dell'organo.
    3. Profumato ciascun rene con i seguenti reagenti come descritto nella Figura 1A
      1. Profumato con 500 ml ROH 2 O a 5 ml / min per 1 ora, 40 min.
      2. Profumato con 1000 ml 1% Triton X-100 a 5 ml / min per 3 ore, 20 min.
      3. Profumato con 1000 ml 1% Triton X-100 a 1 ml / min per 16 ore, 40 min.
      4. Profumato con 1.000 ml 0,1% SDS a 5 ml / min per 3 ore, 20 min.
      5. Profumato con 500 ml ROH 2 O a 5 ml / min per 1 ora, 40 min.
        Nota: Ogni rene decellularized può essere conservato in PBS (senza additivi) in una provetta conica da 50 ml a 4 ° C per un massimo di due settimane prima dell'uso.

2. Perfusion bioreattore dell'Assemblea, Rene sterilizzazione, e preparazione per Recellularization

  1. Preparare i vasi bioreattori.
    1. Lavare i serbatoi bioreattori vetro (componente del corpo) e teste bioreattori con il caldo, soluzioni diluite detersivo per piatti (ad es. 1% soluzione detersivo per piatti in acqua di rubinetto) e risciacquare abbondantemente con acqua corrente e poi ROH 2 O. Lasciare componenti asciugare completamente.
    2. Applicare un piccolo volume (~ 5 ml) siliconatura reagente al fondo di ogni serbatoio. Assicurarsi che il reagente bagna l'intera superficie di fondo per alcuni secondi, poi scolare il liquido in eccesso.
    3. Lasciare i serbatoi ad asciugare in una cappa aspirante a RT O / N. In alternativa, i serbatoi possono essere essiccati in stufa a 100 ° C per 30 min per accelerare l'essiccazione e migliorare la durevolezza del rivestimento, che è destinato a prevenire la fissazione di cellule al fondo del serbatoio bioreattore vetro.
  2. Preparare componenti del circuito di perfusione per la sterilizzazione (Figura1D).
    1. Tagliare le seguenti lunghezze di tubi (per ciascun bioreattore):
      1. Tagliate due 25 "lunghezze di 1/16" tubo di gomma di silicone ID (Figura 1D, h).
      2. Tagliare una lunghezza 8 "tubo pompa peristaltica (Figura 1D, f).
      3. Tagliare una "lunghezza del 1/16" 4.25 tubi in gomma di silicone ID.
      4. Tagliate due 1 "lunghezze di 1/16 a parete spessa" tubi in gomma di silicone ID (Figura 1D, g).
      5. Tagliare una lunghezza di 2 "di 1/4 'ID x 0.5' diametro (OD) tubo di gomma di silicone esterno (Figura 1D, e).
    2. Preparare i seguenti adattatori Luer (per ogni bioreattore):
      1. Preparare 10 maschio Luer lock per 1/8 'adattatori spinato (Figura 1D, c)
      2. Preparare 2 maschio Luer spine (figura 1D, a)
      3. Preparare 2 tappi Luer femmina (figura 1D, b)
      4. Preparare 5 Luer femminax adattatori Luer femmina (x5; la figura 1D, d)
    3. Lavare tutte le schede tubi e Luer con caldo, soluzioni diluite detersivo per piatti, sciacquare abbondantemente con acqua corrente e poi ROH 2 O, e lasciarli asciugare.
  3. Montare circuiti perfusione.
    1. Passare 1 "tratto di tubo in gomma siliconica 1/16 'ID parete spessa sopra l'entrata accettore Luer attaccato alla testa del bioreattore. Posizionare Luer Lock Maschio a 1/8 "adattatore sbavatura ID in estremità aperta del tubo. Ripetere l'operazione per l'altro ingresso Luer accettore, e collegare un tappo Luer femmina a sigillare la porta (destinati ad ureterali o venose tecniche di semina non descritte in questo protocollo).
    2. Collegare ogni 25 "segmento di 1/16" tubo di gomma di silicone ID per il "segmento di tubo pompa peristaltica con maschio Luer lock 8 1/8 'sbavatura ID e femmina Luer x femminili adattatori Luer (Figura 1D, j).
    3. Collegare una estremità aperta del silicone Tubin di gommag alla presa mezzi perfusato all'esterno della testa bioreattore. Collegare la "lunghezza di 1/16" tubo ID 4.25 alla opposta (interna) della presa perfusato supporto all'interno della testa bioreattore.
    4. Collegare un blocco Luer maschio a 1/8 'adattatore spinato ID all'estremità aperta rimanente del tubo del circuito di perfusione. Collegare una femmina Luer x adattatore Luer femmina al lock maschio Luer. Collegare la femmina Luer x adattatore Luer femmina all'aperto maschio Luer lock che conduce nella presa Luer accettore sul bioreattore. Questo servirà come il perfusato ingresso dei media che porta direttamente nell'arteria renale cateterizzato.
    5. Accertarsi che nessuna porta sul coperchio bioreattore sono lasciati aperti o esposti. Strettamente chiudere la valvola del vuoto sul corpo bioreattore.
    6. Montare la testa bioreattore sul corpo del serbatoio, con un O-ring inserita tra le scanalature identiche costeggiano ogni componente. Inserire un morsetto metallico tramite l'interfaccia di tenere i due componenti.
    7. Montare la porta di sfiato sulla testa bioreattore con un filtro di sfiato 0,2 micron, che collega i due componenti usando una "lunghezza 1/4 'ID x 0,5' tubazione di gomma siliconica OD (Figura 1D, e) 2. Aprire la valvola di sfiato.
    8. Allentare leggermente il tappo a vite rossa sulla testa bioreattore.
    9. Posizionare i restanti adattatori Luer e 6 "seghettate campione pinze in un sacchetto e sigillo autoclavabile.
  4. Autoclave bioreattori assemblati e tappi Luer maschio.
  5. Preparare i seguenti reagenti per ponteggio sterilizzazione e mezzo di perfusione prima della semina (i volumi sono elencati per rene decellularized):
    1. All'interno di una cappa aspirante, preparare un acido peracetico da 50 ml allo 0,1%, soluzione di etanolo al 4% con l'aggiunta di 2,56 ml di soluzione di acido peracetico (39% di concentrazione magazzino) e 40 ml di etanolo 200 prova a ~ 957 ml ROH 2 O in una bottiglia 1 L. Mescolare accuratamente bottiglia ripetutamente invertendo, e metterli in cabina di sicurezza biologica.
    2. Prepararea 150 ml di soluzione di PBS 1x, pre-sterilizzati in autoclave.
    3. Preparare 50 ml DMEM / F12 supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (Pen-Strep).
  6. Raccogliere i restanti elementi per il montaggio perfusione bioreattore. Mettere tutti gli elementi in una cappa di sicurezza biologica. CRITICO: Assicurarsi che la cappa di sicurezza biologica è dotato di lavoro prese elettriche per alimentare l'unità pompa digitale. In alternativa, utilizzare una prolunga per collegare l'unità pompa a prese elettriche esterne al di fuori dell'armadio.
    1. Raccogliere reni decellularized.
    2. Raccogliere bioreattori in autoclave con circuiti perfusione allegati.
    3. Raccogliere sacchetto autoclavato contenente adattatori Luer e pinze.
    4. Raccogliere azionamento della pompa digitale con annesso testa a 4 rulli, e grandi cartucce pompa (1 per circuito di perfusione).
  7. Completare il circuito di perfusione, come descritto nella Figura 1C sotto sterile condizioni all'interno di una cappa di sicurezza biologica.
    1. Collegare un rubinetto a 3 vie (Figura 1D, i) tra il maschio Luer lock a 1/8 'adattatore sbavatura ID in prossimità dell'ingresso dei media perfusato e l'adattatore Luer femmina femmina Luer x. Lasciare tutti tre porte sulla aperta rubinetto.
    2. Rimuovere il tappo a vite rossa sulla testa bioreattore e pipettare 50 ml di acido peracetico 0,1%, soluzione di etanolo al 4% nel serbatoio mezzo attraverso l'apertura.
    3. Collegare il segmento tubo della pompa peristaltica alla testa della pompa con una grande cartuccia pompa. Regolare il flusso di 5 ml / min, premere il tasto "Start", e permettere il circuito per adescare.
      1. Quando il liquido riempie la linea di perfusione e raggiunge il restante porta aperta del rubinetto a tre vie, collegare la porta, utilizzando un Luer maschio spina (Figura 1D, a).
      2. Lasciare il circuito pienamente prime fino aria è osservata nel tubo del circuito di perfusione o all'interno della bocca Luer accettore. Se necessary, aumentare la portata temporaneamente per espellere le bolle dalla linea di perfusione. Quando è completamente innescato, fermare l'azionamento della pompa.
    4. Inserire delicatamente l'estremità femmina Luer del catetere dell'arteria renale in ingresso maschio accettore Luer sulla superficie interna della testa bioreattore utilizzando i sterilizzati 6 "pinze. Assicurarsi che il collegamento sia stretto e che non ci sia aria nel catetere. Lasciare che il rene da appendere delicatamente dal catetere dell'arteria renale, in modo che l'arteria renale non torcere o piegare.
    5. Stringere la fascetta metallica che tiene insieme la testa bioreattore e il corpo in modo che il serbatoio bioreattore è ermeticamente chiusi. Chiudere il tappo a vite rossa sulla testa bioreattore.
  8. Sterilizzare reni a RT mediante perfusione con 0,1% peracetico, soluzione di etanolo 4% a 5 ml / min per 1 ora, poi tre sequenziali perfusioni 1 ora a RT con 50 ml di PBS a 5 ml / min.
    1. Cambiare soluzioni:
      1. Dopo 1 ora, arrestare la pompa e aprire tappo a vite rosso. Utilizzando un sterile (autoclave) pipetta Pasteur, aspirare con attenzione tutta la soluzione dal serbatoio bioreattore. Lasciare il circuito di perfusione completamente innescato.
      2. Pipettare 50 ml di soluzione fresca nel serbatoio bioreattore, chiudere il tappo a vite, e avviare la pompa.
  9. Dopo il risciacquo finale PBS, aspirare PBS dal serbatoio e pipetta in 50 ml di DMEM / F12 supplementato con 10% FBS e 1% Pen-Strep. Chiudere il tappo a vite, e trasferire il bioreattore con il circuito di perfusione collegato a un incubatore grande capacità mantenuta a 37 ° C e 5% CO 2.
  10. Se necessario, trasferire la trasmissione della pompa per l'incubatore. Collegare circuito di perfusione bioreattore alla pompa, e perfusione reni a 4 ml / min per almeno 1 ora prima della semina.

3. Rene Recellularization con cellule renali corticale tubolare epiteliali

  1. Warm volumi sufficienti di DMEM / F12 (integrato con il 10% FBS e 1% Pen-Strep) ecell dissociare enzima per il sollevamento delle cellule a 37 ° C. I volumi consigliati sono elencati di seguito:
    1. Preparare 10 ml di cellule dissociazione enzimatica e 10 ml DMEM / F12 per 175 centimetri 2 pallone di coltura per il sollevamento.
    2. Preparare 5-10 ml DMEM / F12 per rene per essere seminati.
  2. Raccogliere un numero sufficiente di cultura palloni per la concentrazione semina desiderata (4 x 10 7 cellule immortalizzate RCTE umane 18 per i risultati di rene in attecchimento massimo cellule RCTE che utilizzano questa strategia semina).
  3. Cellule ascensore dal palloni con dissociante cellule enzima. Medio Aspirare dalla boccetta, poi pipetta da 10 ml cellula dissociazione enzimatica nel pallone. Luogo pallone in 37 ° C incubatore per accelerare la dissociazione.
  4. Controllare pallone su un microscopio a contrasto di fase ogni 2 minuti fino a quando si osserva pieno dissociazione delle cellule dalla superficie pallone. Nota: Il tempo di incubazione può variare a seconda del livello di confluenza delle cellule, ma le cellule RCTE volontà require circa 15 minuti per dissociarsi completamente.
  5. Prelevare un campione di sospensione cellulare dissociata per il conteggio prima di pellet. Diluire la sospensione cellulare con un volume uguale di mezzo DMEM / F12 pre-riscaldato, e centrifugare a 232 xg relativa forza centrifuga (RCF) per 5 min.
  6. Contare le cellule durante la centrifugazione. Diluire il campione ottenuto con un volume uguale di Trypan Blue, e pipettare 10 microlitri in ogni estremità di un emocitometro per il conteggio. Calcolare necessario volume della diluizione pellet per ottenere la concentrazione desiderata di semina (2 x 10 7 cellule / ml).
  7. Dopo centrifugazione, il pellet diluite con un volume adeguato di terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale di 2 x 10 7 cellule / ml. Aspirare 2 ml della sospensione semina in una siringa sterile da 5 ml.
  8. Trasferire il bioreattore perfusione di una cappa di sicurezza biologica. Girate la valvola di rubinetto per chiudere il flusso al porto semina. Togliere il tappo slittamento Luer maschio dail rubinetto, e collegare la siringa caricata con la sospensione semina.
  9. Trasferire rapidamente il circuito di perfusione tornare a incubatore, e utilizzare il grande cartuccia pompa per fissare il segmento tubo della pompa peristaltica alla testa della pompa.
  10. Semina Cell: Chiudere la porta di valvola di rubinetto sia rivolta verso la pompa. Iniettare lentamente la sospensione cellulare in rene, assicurando che l'intera sospensione viene trasferita dalla siringa nella linea rubinetto e perfusione. Girate la valvola di rubinetto per chiudere il flusso dalla siringa, e avviare la pompa a 25 ml / min per 15 min.
  11. Dopo 15 minuti, ridurre la portata della pompa a 4 ml / min. Mezzo di scambio (volume 100 ml per le modifiche successive) il giorno successivo e successivamente ogni due giorni.

4. Valutazione della vitalità cellulare e la proliferazione utilizzando resazurina perfusione Assay

  1. Preparare il reagente resazurina. Sciogliere 110,5 mg di sale resazurina sodico in 100 ml di PBS sotto agitazione, e diluire 1:10 aggiungendo 5 ml dicon conseguente soluzione a 45 ml PBS fresco per creare una resazurina soluzione stock 440 micron. Filtro-sterilizzare (utilizzando un filtro 0,2 micron siringa), e memorizzare la soluzione di riserva in un tubo da 50 ml luce protetta a 4 ° C.
  2. Preparare controlli multimediali resazurina-integrato. Preparare una soluzione al 10% di reagente resazurina in terreno di coltura (per es. 5 ml resazurina soluzione madre + 45 ml terreno di coltura) per creare resazurin soluzione di lavoro. Autoclavare un volume di 10 ml della soluzione di lavoro resazurina in un contenitore protetto dalla luce. Nota: Questo ridurrà completamente il composto resazurina a resorufina, e servirà come controllo positivo per il calcolo di riduzione resazurina cento.
  3. Aliquota 1 ml di soluzione di lavoro resazurina (ossidato), autoclave resazurina soluzione (ridotto), e terreno di coltura di lavoro da solo (in bianco) in tubi separati 1,5 ml di raccolta. Posizionare i tubi aperti nello stesso incubatore come bioreattori a perfusione.
  4. Trasferire la perfusione del renecircuito dal incubatrice di una cappa di sicurezza biologica. Togliere il tappo a vite dalla testa bioreattore, e terreno di coltura aspirato dal serbatoio bioreattore con una pipetta Pasteur.
  5. Pipettare 10 ml di resazurina soluzione nel serbatoio, chiudere il tappo a vite di lavoro, e trasferire il circuito di perfusione renale indietro per l'incubatore.
  6. Avviare la pompa a 4 ml / min e lasciare defluire in reagente attraverso i reni esattamente 1 ora.
  7. Dopo 1 ora, arrestare la pompa, e trasferire il circuito di perfusione rene alla cappa di sicurezza biologica.
  8. Raccogliere la soluzione resazurina condizionata (parzialmente ridotto), e aggiungere 100 ml di terreno di coltura al serbatoio bioreattore. Circuito di perfusione Trasferimento a incubatrice, e riprendere il flusso (4 ml / min).
  9. Dispensare 100 microlitri (x 3 repliche) condizionato resazurina soluzione, resazurina soluzione di lavoro, in autoclave soluzione di lavoro, e la cultura supporti vergini in un nero (opaco) 96 pozzetti test. Leggi intensità di fluorescenza (excitation: 540/35; Emissione: 590/20) utilizzando uno spettrofotometro.
  10. Calcolare riduzione percentuale come rapporto di intensità di fluorescenza normalizzato mediante l'intensità di fluorescenza (FI) generati dal mezzo resazurina ossidato (ORM o resazurina lavorare soluzione non esposto a cellule) o diminuito resazurina medio (RRM, o autoclavata soluzione di lavoro):% riduzione = 100 x {[FI (soluzione resazurina condizionata) - FI (ORM)] / [FI (RRM) - FI (ORM)]}. Per normalizzare risultati, moltiplicare riduzione% in volume circolante (10 ml) e dividere per tempo di incubazione (1 ora).

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Representative Results

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I reni sequenzialmente perfusi con acqua e diluire soluzioni detergenti (1% Triton X-100, 0,1% SDS) secondo una precedentemente stabilito, protocollo ottimale decellularization (vedere Figura 1A, B) 7, diventa progressivamente più trasparente su un periodo di 26 ore, come mostrato nella Figura 2A. La risultante impalcatura rene acellulare è privo di cellule e mantiene un ECM renale coesa supportato da una capsula renale intatta, che è intatto seguendo il protocollo di perfusione. Con la perfusione detergente finale (SDS), rete vascolare del rene, e in particolare le navi interlobari, sono ben visibile nella scaffold decellularized, per la maggiore spessore di questi vasi sanguigni rispetto alla membrana basale comparativamente sottile dei tubuli nefrone ( Figura 2A, B). L'intero organo espunti cellule native, lasciandosi alle spalle la rete membrana basale intatta glomeruli, tubuli, e colnando condotti, e l'ECM dei vasi sanguigni decellularized, tra lamine elastiche interna ed esterna delle arterie interlobulari corticali (Figura 2B, C). Oltre ai vasi più grandi, le membrane basali microvascolare all'interno glomeruli inoltre mantengono l'integrità strutturale (vedere la Figura 2B, C).

Reni decellularized sono memorizzati in PBS a 4 ° C per limitare il deterioramento naturale idrolitica della ECM renale e deve essere usato entro 2 settimane di decellularization. Abbiamo precedentemente descritto in dettaglio la progettazione di un bioreattore a base di perfusione personalizzato rene che viene utilizzato sia per ponteggi roditore renali semina decellularized e lungo termine cultura degli organi recellularized sotto flusso 17. Per Recellularization, un circuito di perfusione composto di piccolo diametro silicone gomma e tubi della pompa PharMed resistenti alla fatica è usato per coltura percorso medio dal serbatoio bioreattore, ad una pompa peristaltica, etorna all'ingresso Luer accettore a cui l'arteria renale cateterismo è collegato in corrispondenza della faccia interna della testa bioreattore (vedere Figura 1C). Dopo la sterilizzazione il rene decellularized mediante perfusione con una miscela di acido / etanolo peracetico, il sistema di perfusione è preparata per la semina facendo circolare terreno di coltura standard (contenente 10% FBS per migliorare cellula-ECM adesione) attraverso l'impalcatura nell'incubatore.

I reni decellularized ora possono servire modelli ECM come acellulare per Recellularization, che abbiamo precedentemente eseguiti utilizzando cellule derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte endoteliali per rivascolarizzazione 7. Qui, dimostriamo l'utilità di questo sistema di bioreattore impalcatura e perfusione per tubulogenesi utilizzo epiteliali tubolari (RCTE), le cellule corticali renali di derivazione umana. Cellule RCTE vengono seminate in ponteggi renali attraverso l'arteria renale in un protocollo di perfusione ad alta pressione che è stata descritta in precedenza 7, 17 .RCTE cellule infuse in questa casa maniera principalmente alle regioni corticali del rene, dove sono preferenzialmente ripopolare tubuli periglomerular (vedi Figura 3A). Poche cellule incorporare all'interno glomeruli al giorno 1 post-semina, e di giorno 7, glomeruli sono praticamente privi di cellule. Durante la cultura perfusione, medium viene cambiato ogni 2 giorni, a quel punto il test di perfusione resazurina viene eseguita contemporaneamente per fornire valutazioni comparative di vitalità cellulare nel tempo (vedi Figura 3B). Come sostenuto dai risultati di riduzione resazurina, cellule RCTE proliferano all'interno della ECM 3d, la formazione strettamente organizzato, strutture tubolari brevetto di giorno 7. Mentre la maggior parte di queste cellule occupano le regioni corticali del ECM renali, dopo 7 giorni di coltura anterograda perfusione molti tubuli RCTE alberati sono presenti nella midollare esterna e tubuli papillari e dotti collettori (vedi Figura 4). Dopo ripopolamento con le cellule RCTE e una settimana di ognicultura fusione, la trasparenza osservati dopo decellularization è perso, e il rene recellularized appare opaca e più vicina nell'aspetto al suo stato nativo (vedere Figura 4).

Figura 1
Figura 1:. Rene Decellularization sistema e il protocollo e Recellularization perfusione Circuit (A) Perfusione programma di reagenti per decellularization di reni roditori. I reagenti utilizzati per decellularization, portata volumetrica, e la durata di ogni fase sono mostrati. (B) Perfusione decellularization set-up. Le soluzioni sono pompati unidirezionalmente da un serbatoio di reagente ad un contenitore di raccolta perfusato mediante linee di flusso individuali per ciascun rene in fase decellularization. Fino a quattro reni possono essere decellularized per pompa peristaltica. Circuito (C) Perfusione for semina e la cultura di ponteggi renali recellularized. Le cellule vengono caricati tramite una siringa collegata direttamente a monte del accettore ingresso Luer. Opzionali sensori in linea per la pressione di monitoraggio, ossigeno disciolto (DO 2), e pH possono essere collocati a monte del bioreattore. La pompa peristaltica digitale può essere controllato dal calcolatore, e la pressione negativa (vuoto parziale) può essere applicato per aiutare ureterale semina. (D) Componenti utilizzati per creare linee di perfusione per decellularization (B) e Recellularization (C). (A) connettore Luer maschio, (b) tappo Luer femmina, (c) maschio Luer lock a 1/8 "adattatore spinato, (d) Luer femmina all'adattatore Luer femmina, (e) da ¼" tubo ID silicone, (f) tubo della pompa peristaltica, g: a parete spessa 1/16 "tubo di gomma di silicone ID, (h) 1/16" tubo di gomma di silicone ID, (i) a tre vie rubinetto, (j) accoppiatore usato per collegare i segmenti di tubo combinando due 1/8 "sbavatura di adattatori Luer maschili (c) con unaLuer femmina a femmina accoppiatore Luer (d). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2:. Rappresentante Risultati di rene Decellularization lordo rappresentante e immagini microscopiche sono mostrati di reni prima e dopo decellularization. (A) Serie temporale decorso di un decellularization rene in fase. Le immagini vengono mostrate immediatamente dopo perfusione con ogni reagente specificato. Dopo perfusione del 0,1% SDS (sodio dodecil solfato), rete vascolare conservata è visibile. (B) Immagini rappresentative della reni nativi o decellularized sezionati e colorati con ematossilina eosina (H & E). L'architettura ECM di caratteristiche microstrutturali, compresi glomeruli, dotti collettori, E vasi sanguigni, è ben conservato dopo decellularization. Microscopio (C) Scanning Electron confrontando glomeruli e tubuli in nativo (riga in alto) e decellularized (fila in basso) reni. Dopo la rimozione delle cellule, tubuli aperti sono diffusi in tutto il rene. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Risultati Rappresentante di umano renale corticale tubulare epiteliale Recellularization di decellularized Rat Reni Reni sono recellularized attraverso un anterograda arteriosa tecnica della perfusione ad alta pressione che si traduce nell'adesione cellulare RCTE principalmente ai tubuli renali della corteccia. (A) le immagini ad alto ingrandimento rappresentativi (20x) di ematossilina e histolo eosina macchiatosezioni gici di ponteggi recellularized 1, 3 o 7 giorni dopo la semina. Top riga mostra che le cellule occupano lo spazio tubolare periglomerular nonostante sia iniettato attraverso il sistema vascolare arterioso, indicando la loro preferenza per l'ex ECM nicchia renale. Giallo freccia di ad un afferente con un lume che è privo di cellule. Riga inferiore mostra i tubuli corticali in cui le cellule RCTE proliferano, con l'aumento della densità delle cellule più di una settimana, e formano strutture epiteliali tubulari fitto. (B) Un piccolo (10 ml) del volume del terreno di coltura resazurina supplementato viene ricircolata attraverso reni al momento modifiche di supporto. Durante 60 min di perfusione, cellule riducono il composto ossidato resazurina (blu) resorufina (rosso), che produce un segnale altamente fluorescente in proporzione al numero di cellule all'interno del rene. In linea con l'aumento osservato nella densità delle cellule visto nelle immagini istologiche, aumenti di riduzione resazurina per cento oltre la cultura time con la crescita cellulare, fornendo un'indicazione non invasiva sia la vitalità e la proliferazione delle cellule durante la coltura manutenzione. I risultati sono presentati come media ± deviazione standard (n = 4 reni recellularized). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
. Figura 4: Rappresentante dei risultati: Confronto di Native, decellularized e Recellularized Reni basso ingrandimento immagini istologiche mostrano la corteccia renale, zona di transizione tra la corteccia e midollo esterno, e le regioni della papilla midollari nei reni nativi (riga in alto), decellularized (Decell; riga centrale), e 7 giorni RCTE-recellularized (7 giorni Recell; riga inferiore) ponteggi. La linea tratteggiata indica il confine approssimativa tra la corteccia renale (C) e midollare esterna (M). Immagini lordo mostrano un rene nel suo stato nativo dopo l'approvvigionamento, seguito decellularization, e 7 giorni dopo la semina di cellule RCTE attraverso l'arteria renale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Il protocollo descritto decellularization produce costantemente una ECM rene completamente acellulare che serve da modello 3D per coltura di cellule umane renali corticali tubulari epiteliali (sia prossimale e distale del tubulo-derivato), in aggiunta a cellule endoteliali vascolari 7,17. Il sistema vascolare renale cannulata serve come elemento chiave per la consegna uniforme dei reagenti e cellule in tutto il ponteggio all'interno di un bioreattore set-up, permettendo così la perfusione decellularization, semina delle cellule, colture di perfusione a lungo termine, e la resazurina protocolli di perfusione. Come tale, corretta cannulazione dell'arteria renale prima perfusione degli organi è critica, e particolare cura deve essere presa per assicurare che l'arteria renale non è ostruito o danneggiato, e che il catetere è fissato. I ratti Sprague Dawley da cui i reni sono recuperati devono essere sistematicamente eparinizzato per evitare la coagulazione all'interno del sistema vascolare durante reperimento di organi, come coaguli intravascolari non possono be rimosso, e può inibire completa decellularization del rene.

Il bioreattore perfusione utilizzato per la semina e la perfusione cultura reni recellularized è stato progettato per consentire a più metodi di semina in situ 17. Oltre alla tecnica di iniezione arteriosa qui descritto, le cellule possono essere iniettati retrograda attraverso l'uretere cateterismo o vena renale. Inoltre, il corpo bioreattore è dotato di una valvola che consente l'applicazione di pressione negativa (vuoto parziale; vedere Figura 1C), per ureterale semina. Indipendentemente dalla strategia utilizzata semina, perfusione di terreno di coltura anterogrado attraverso l'arteria renale è fondamentale per un'adeguata nutrienti (ad esempio ossigeno, glucosio) consegna da cellule seminate.

Il protocollo Recellularization descritto dimostra il nostro uso di matrici renali decellularized per servire come modelli specificamente per tubulogenesi epiteliale. Tuttavia, abbiamo già shproprio che la matrice renale supporta anche ri-endotelizzazione della rete vascolare trattenuto e può essere ricoperto da cellule derivate dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane endoteliali, che è una osservazione importante per eventuale trapianto a lungo termine dei reni recellularized in modelli animali impedendo trombotico occlusione del sistema vascolare renale 7. Un ostacolo corrente alla eventuale scale-up di protocolli Recellularization rene per ponteggi renali grandi animali è il sostanziale maggior numero di cellule necessarie per ripopolare ponteggi rene umano dimensioni. Strategie semina efficienti, come la tecnica di iniezione arteriosa alta pressione sopra descritta, sono indispensabili per massimizzare il numero di cellule che innestare nel ECM decellularized. Data la composizione cellulare eterogenea del rene nativo, diversi metodi di semina possono in definitiva essere necessarie per ripopolare efficacemente le varie nicchie renali extracellulari con diversi tipi di cellule che Raccolterelativamente svolgere le numerose funzioni del rene, tra cui filtrazione, riassorbimento, la concentrazione di urina, e la sintesi degli ormoni.

Infine, il test resazurina perfusione dimostrato in questo articolo fornisce una valutazione non invasiva, non tossico della vitalità e la proliferazione delle cellule in coltura a lungo termine 7,17,18. Il saggio fornisce feedback istantaneo sullo stato metabolico delle cellule che crescono all'interno scaffold renali, e quando regolarmente eseguito tra scambi medie periodiche, può essere utilizzato per caratterizzare la proliferazione cellulare nel tempo. Il reagente resazurina è poco costoso, il test richiede poco tempo per eseguire (1 ora), ed è un metodo analitico più conservativa per caratterizzare la proliferazione cellulare o tendenze metaboliche rispetto alla valutazione istologica, che richiede sacrificio terminale del ponteggio recellularized. Il test resazurina perfusione può essere adattato anche per la valutazione delle popolazioni di cellule durante la crescita in altre receorgani o tessuti llularized.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO VWR M143-4L
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O Sigma-Aldrich 05030
Peracetic acid solution, purum, ~ 39% in acetic acid (RT) Sigma-Aldrich 77240 Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles).
200 proof ethanol VWR V1001TP
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces Sigma-Aldrich SL2 For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent.
DMEM/F12 media Life Technologies 11320-033
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech Corning 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin Corning 30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol Red Life Technologies 12605-028 Referred to in text as cell dissociating enzyme.
Trypan Blue Stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Resazurin sodium salt Sigma-Aldrich R7017
Equipment:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC Cole-Parmer EW-07522-20
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. Cole-Parmer EW-07519-70 Referred to in text as large pump cartridge.
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. Cole-Parmer EW-07519-06
Straight 6" specimen forceps, serrated VWR 82027-438
*Kidney perfusion bioreactor WilMad Labglass *Custom designs Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication.
Perfusion Circuit Components
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) BD Biosciences 381412 Referred to in text as 24 gauge catheter.
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' Cole-Parmer HV-06508-14 Referred to in text as peristaltic pump tubing.
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/pack Cole-Parmer HV-06411-62 Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. Cole-Parmer HV-96410-14 Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing.
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD VWR 89068-484
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences VWR 28143-558 Referred to in text as 0.2 micron vent filter.
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/pk Cole-Parmer T-45505-11 Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-58
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-22 Referred to in text as female Luer x female Luer adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs Careforde Healthcare 10254821 Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L.
Other Components
5 ml BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. BD Biosciences 309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish BD Biosciences 353001 Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding.

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 03/03/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

Ripopolamento cellule epiteliali e preparazione di roditori matrice extracellulare Ponteggi per lo sviluppo del tessuto renale
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Cite this Article

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y., Zhang, Z. J., Ward, H. H., Wandinger-Ness, A., Miller, W. M., Wertheim, J. A. Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development. J. Vis. Exp. (102), e53271, doi:10.3791/53271 (2015).More

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y., Zhang, Z. J., Ward, H. H., Wandinger-Ness, A., Miller, W. M., Wertheim, J. A. Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development. J. Vis. Exp. (102), e53271, doi:10.3791/53271 (2015).

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