Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Yetişkin Zebra balığı Kan Testleri için Tekrarlanan Kan Alma

doi: 10.3791/53272 Published: August 30, 2015

Abstract

Tekrarlanan kan toplama laboratuvar hayvanları üzerinde yapılan en yaygın tekniklerden biridir. Ancak, Zebra balığı kan toplama için bir öldürücü olmayan protokol kurulmamıştır. Zebra balığı kan toplama için önceki metotlar, lateral insizyon, dekapitasyon ve kuyruk ablasyon gibi öldürücü bulunmaktadır. Böylece biz burada bu yordamı özetleyen ayrıntılı bir protokol, bir roman "tekrarlanan" kan toplama yöntemi geliştirdi ve mevcut var. Bu yöntem, minimal invaziv ve bu nedenle, aynı bireyden elde tekrarlanan kan örnekleme sağlayan zebrabalıkları için çok düşük bir ölüm oranına (% 2.3) elde edilir. Kan örneği maksimum hacim balık vücut ağırlığına bağlıdır. Aralıklarla tekrarlanan kan örneklemesi için hacim kan hemoglobin ölçümleri ile değerlendirildi vücut ağırlığının her hafta ya da ≤1% 2 haftada, bir ≤0.4% olmalıdır. Ayrıca, hemoglobin, açlık kan şekeri, plazma triaçilgliserol (TG) ve toplam cerkek ve dişi yetişkin zebrafish holesterol düzeyleri ölçüldü. Ayrıca diyet indükte obeziteye glikoz metabolizmasının bozulmasına araştırmak için, bu yöntemi uygulanır. Bu kan toplama yöntemi glukoz ve lipit metabolizması ve bir insan hastalık model organizma olarak zebrafish kullanımını artıracak hematolojik çalışmalar da dahil olmak üzere birçok uygulama, sağlayacaktır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Organları ve genetik insanlarda 1,2 benzemektedir, çünkü balığı insan hastalıklarında değerli bir model olarak artan bir popülerlik kazanmaktadır. Gelişimsel biyoloji alanında birçok çalışma zebra balığı ve insan gösteri hematopoiesis 3, hemostaz 4,5 ve myelopoiesis 6 benzerliği işaretli olduğunu göstermiştir. Yetişkin Zebra balığı da bu model organizma hisseleri nedeniyle insan hastalıklarında bozulduğu olanlarla ortak yollar immünolojik 7, nörodejeneratif 8 ve obezite ile ilişkili hastalıkların 9 çalışmak için kullanılır. Obezite ve obezite ile ilişkili hastalıkların (diyabet, karaciğer yağlanması ve alkolsüz steatohepatit ve ateroskleroz) için zebrabalıkları kan şekeri ve lipidler düzeyleri iyice birçok transgenik ve diyete bağlı obezite modellerinde 10-13 araştırılmıştır.

Bireysel hayvanlardan Tekrarlanan kan örneklemesi hayvan kullanımı ve dec azaltacaktırbireyler farklılıkları artma. Ancak, tekrarlanan numune toplama nedeniyle nispeten küçük kan hacmi ve kolay erişilebilir damarların olmaması gibi zebrabalıkları gibi küçük hayvanlarda teknik olarak zordur. Bu yöntemler de dahil olmak üzere öldürücülüğü kendi dezavantajları, olmasına rağmen zebrafish bir defalık kan toplama için çeşitli yöntemler, ilişkili doku hasarı ve sınırlı kan hacmi geliştirilmiştir. Örneğin, 1-5 ul kan dorsal aorta 5 bölgesinde yaklaşık olarak boyuna 0.3 cm bir yanal kesi hasat edilebilir. Göğüs kuşak boyunca keserek makas ile Decapitation 5-10 ul kan 10 toplayabilir. Başka uygun kan örnekleme metodu kuyruk ablasyon 14'tür. Kardiyak delinme aynı balık tekrarlanan kan toplama için tek potansiyel alternatif bir yöntemdir, ancak çok küçük bir miktar bu prosedüre (yaklaşık 50 nl) elde perfor olabilir analizlerin sayısını sınırlar11 med. Bu duruma göre, yeni bir protokol bu organizma insan hastalıkları için standart model organizma için önemli bir ilerleme gerekli olacaktır tekrarlanan öldürücü olmayan kan örnekleme sağlamak için gereklidir. Bu teknik farmakolojik cevabı, moleküler tanı için biyobelirteçlerin, prognoz tayini keşif ve metabolik hastalıklar, dejeneratif hastalıklar ve maligniteler çeşitli türleri gibi çeşitli hastalıkların izlenmesi test etmek için izin verecek.

Bu nedenle Zebra balığı seri 15 kan elde etmek için minimal invaziv bir yöntem geliştirdi. Burada görsel prosedür göstermek ve bu teknik için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu yöntemi kullanarak, çeşitli hemoglobin içeren parametreler, açlık kan şekeri, sağlıklı erişkin zebrabalıkları kanında lipidler dayalı normal değer değerlendirildi. Ayrıca, aynı zamanda, bu yöntem, m seri örnekleri gerektiren çalışmalar için uygun olup olmadığını değerlendiriroverfeeding deneyler sırasında kan glukoz düzeylerinde geçici değişiklikler onitoring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bütün hayvan prosedürleri Mie Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmış ve uluslararası kurallara Japon hayvan refahı yönetmelik 'Refah ve Hayvanların Yönetimi Yasası' (Japonya Çevre Bakanlığı) göre gerçekleştirilmiştir ve uyulması bulundu.

Needle 1. Hazırlık

NOT: Bütün deneyler anestezi altında gerçekleştirildi ve tüm çabaları acıyı en aza indirmek için yapılmıştır. Ötenazi için, balık ≥20 dakika boyunca (≤4 ° C'de 5 parça buz / 1 kısım su), bir buz-su banyosu içine daldırıldı.

  1. Bir iğne çektirmesi (Şekil 1A) ile 1,0 mm dış çaplı cam kapiller çekerek cam iğneler microcapillary hazırlayın.
  2. Oblik ince makas (Şekil 1B) kullanarak iğne uçlarını kesin. 200 mikron (Şekil 1C) - İdeal uç çapı yaklaşık 100 olmalıdır. İpucu Diamete Eğerr çok dar, kan iğne girmeyecektir.
  3. 5 mg / ml 'lik bir konsantrasyona kadar tuzla içinde heparin çözülür.
  4. Bir aspiratör borusu düzeneğinin burunluk sonunda bir precut iğne yerleştirin ve ağız ağızlık tutun, ya da bir ampul dağıtıcı iğne bağlayın. Heparin çözeltisi içine iğne ucu daldırın ve emme ve çözelti (Şekil 1D ve 1E) ile üfleme iğnesi heparinize.
    Not: aspiratör boru montaj Zebra balığı sperm dondurulması 16 kullanılmıştır. Uzun kauçuk tüp ağzına uçan herhangi bir kan durdurabilirsiniz. Tüpün yarıda bir filtre ayarlama tehlikeleri önleyebilirsiniz.
  5. En az 1 saat süre ile 10 cm'lik bir Petri kabı ve hava-kuru heparinize iğneler saklayın. Iğneler çok sayıda önceden hazırlanabilir.

2. Anestezi

  1. (2-fenoksietanol, 100 ul balık 200 ml su karıştırılarak 2 küçük bir plastik durumda anestezi çözeltisi hazırlayın-PE). Anestezik nihai konsantrasyonu 500 ppm dir.
    DİKKAT! 2-PE hızlı bir etkiye sahiptir.
  2. Dolaşım sisteminden balık (AB zorlanma) istenen sayıda kaldırın.
  3. 2 dakika (Şekil 1F) - 1 Anesteziyoloji içine balık aktarmak için bir net kullanın. 1 dakika içinde hızlı operkulum hareketlerini yavaş yavaş, yüzmek, yatay gasp göğüs yüzgeçleri yayıldı ve sahip balık gözlemleyin.
  4. Zaman geçtikçe, balık kasanın altında yatıyordu gözlemlemek ve nihayet yüzme durdurun. Balık gasp durur ve operkulum hareketleri yavaş olduğunda anestezi cerrahi uçağı ulaşacak. Bu noktada, balık kan toplama için hazırdır.
  5. Bir skimmer hafifçe 2-PE anestezi balık kaldırın ve kullanma anestezik (Şekil 1G) ile ıslatılmış kağıt havlu üzerine yerleştirin. Göz kuruluğunu önlemek ve yavaşça başka bir kuru ve yumuşak doku kağıt kullanmak da 2-PE çözeltisi ile ıslatılmış yumuşak doku kağıt ile balığın baş örtüsüvücut yüzeyinden kurulayın.

3. Kan Toplama

  1. Aspiratör tüp montajı (ya da ampul dağıtıcı) burunluğu sonunda bir heparinize iğne yerleştirin ve ağızda aspiratör borusu düzeneğinin ağızlık ucunu tutun.
  2. Burunluk ucu bir arada iğne tutun ve dikkatlice iğne ucu ile müdahale ölçekleri kaldırın. Kan toplama sitesine 45 ° açı - 30 de iğne takın. Gastrointestinal sistem (Şekil 1H) bir patlağı kaçının. Yukarıda açıklandığı gibi ampul dağıtıcı kullanılması durumunda, başparmak ve orta parmak ile ampul basın ve ilk parmak ile ampulün ucundaki delik blok, sonra iğneyi.
    Not: Kan toplama sitesi dorsal aorta bölgesinde anüs vücut ekseni ve posterior boyunca olduğunu. Dorsal aorta (DA) ve posterior kardinal ven (PCV) omurga ventral sadece (Şekil 2).
  3. Emmek başlayıniğne omurgayı dokunmadan hissettim zaman aspirasyon borusu düzeneğinin sonuna ağızlık. Kan yükselecek etmezse, kan akışını teşvik etmek için elle kurnazca iğne ucu hareket ettirin. Kan iğne içine yükseliyor kez hemen sallayarak durdurun ve yavaşça (Şekil 1i) emmek unutmayın. Ampul dağıtıcı kullanılması durumunda, kan aspire ampul basıncı boşaltın.
  4. Kan yavaş nedeniyle arteriyel kan basıncının muhtemelen emme olmadan pulsatil bir tarzda iğne içine artacak gözlemleyin. Bu nedenle, iğne doğru arteri nüfuz halinde emmek için gerekli değildir.
  5. Kanın uygun hacmi toplanır sonra emme durdurun. Balık iğneyi çıkarın ve herhangi bir kanamayı durdurmak için yumuşak doku kağıdı kullanarak ponksiyon sitesine basın. Parmak basıncı 20 sn (Şekil 1J) - yaklaşık 10 sonrası kanama durdurma gözlemleyin.
  6. Kanama durdurulduktan sonra, derhal bir cle geri balık transferiBir sıcak su (~ 28 ° C) tankı. Yüzmek başlayana kadar yavaşça solungaçları doğru su dönen kurtarmak için balık yardımcı olur.
    Not: 2 L tankında 5 postsampling balık tutun ve balık oksijen sirkülasyon sistemine tankı bağlayın. Balık su antibiyotik ilave edilmesi gerekli değildir. Normal konut ve beslenme ile balık koruyun.
  7. Parafilm bir parça (Şekil 1K) temiz bir alan üzerine iğne kan kovmak.
  8. Herhangi bir ticari el glukometre (Şekil 1 L) kullanılarak kan şekeri ölçün.
    Not: Glucometer bir glikoz dehidrojenaz-flavin adenin dinükleotid elektrot kullanır ve 0,6 ul örnek bir hacimde kullanılmasını gerektirir.
    1. Metre içine tamamen bir test bandı takın ve doğrudan kan damlası dokunun. Otomatik olarak test şeridi içine kan beraberlik gözlemleyin ve görüntüleme alanında kan şekeri sonucu 5 sn edinin. Sonucu kaydedin ve test bandını atın. KullanınHer ölçüm için yeni bir test şeridi.
  9. (isteğe bağlı adım) bir pipetleme kanın doğru miktarda alın ve daha analizler (hemoglobin, triaçilgliserol (TG), total kolesterol, vs.) bir mikrosantrifüj tüp kan transferi. Gerekirse, tuzlu su ile bir balık tam kan seyreltin. RT'de 680 x g'de 3 dakika boyunca kan örnekleri santrifüj ve plazma hasat. Yeni bir tüp içine plazma aktarın. Bu noktada, bu biyokimyasal analizlerde kullanılmak üzere hazırdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

(Şekil 1J <1 mm delinmesi) ve% 2.3 gibi çok düşük bir mortalite oranı veren bu kan toplama yöntemi zebrabalıkları minimal hasara neden olmaktadır. Tek bir balık toplanan ve vücut ağırlığı (Şekil 3) bir ilişki değerlendirilebilir kan maksimum ses incelenmiştir. Biz toplanan maksimum kan hacmi doğrusal vücut ağırlığının (R = 0,813) ile ilişkili olduğunu bulduk. Tek bir balık (vücut ağırlığı = 1,071 g) toplanan kanın en büyük hacmi 25 ul oldu ve en küçük hacmi 0.115 g ağırlığında bir balık 1.3 ul oldu. Bu toplanan kan, maksimum ses zebrabalıkları vücut ağırlığına bağlı olduğunu göstermektedir.

Hemoglobin, kan glikoz, TG ve total kolesterol biyokimyasal analizi, kan toplama (Tablo 1) gerçekleştirilmiştir. Erkek ve kadın sağlıklı yetişkin zebrabalıkları (4-6 aylık), kan collecti önce 18 saat aç bırakıldıüzerinde. Biyokimyasal analizler hemoglobin normal değer (erkek 9.91 ± 0.49 g / dl ve dişi 10.02 ± 0.48 g / dl) ve TG (erkek 417 ± 45 mg / dl ve kadın 404 ± 35 mg / dl) anlamlı farklılık ortaya İki grup arasında. Ancak, açlık kan şekeri ve erkek grubunun total kolesterol düzeyleri (44 ± 3 mg / dl ve sırasıyla 365 ± 18 mg / dl), kadın grubunda (69 ± 3 mg / dl göre anlamlı derecede düşük bulundu (p <0.05) ve 511 ± 52 mg / dl, sırasıyla).

Minimal travma, aynı kişiden kan örneklemesi tekrarlandı sağlayan mevcut yöntem kullanılarak zebrafish ederken, tekrarlanan kan çizim etkileri değerlendirilmemiştir. Biz kan hemoglobin düzeyinde (Şekil 4) ölçümleri kullanılarak bu etkileri araştırıldı. Daha önceki yayında 15'te gösterildiği gibi, yetişkin erkek balıklar yaklaşık 0.5 g her dört gruba ayrıldı ağırlığında. Tekrarlanan kan örneklemesi(2 ul her zaman) (yedi kan örneklerinde toplam) günde bir kez 7 gün boyunca aynı bireysel balık 2.38 ile 10.82 ± 0.78 g / dl hemoglobin düzeylerinde anlamlı azalma (p <0.01) sonuçlandı ± 0.8 g / dl. 2 kan ul her 2 gün ya da haftada 5 ul tek bir koleksiyon çıkarılması da hemoglobin düzeylerinde önemli bir azalma (p <0.05) bulunmuştur. Buna ek olarak, bir hafta, 2 ul kan örneği tek toplandıktan sonra, hemoglobin miktar normalin altına (/ dl 8.11 ± 1.15 g 7.15 ± 1.17 g / dl) idi. Hemoglobin düzeyleri 2 haftalık iyileşme dönemi için 2 veya 5 ul kan numunesinin tek toplandıktan sonra hiçbir etkisi yoktu. Böylece, kan kaybı anemi önlemek kan 2 ul (vücut ağırlığının% 0,4), haftada ya da tek tek balık 2 haftada bir 2-5 ul (vücut ağırlığının 0,4-1%) toplama tekrar sonucuna varılmıştır.

Biz daha gluc çalışma için bu yöntemi uygulananose metabolizması. Normal diyet grubunda (günde bir kez yemleme) ve fazla besleme grubunun (beş günlük besleme) her bireyin kan şekeri düzeylerindeki değişiklikler, 5 haftalık bir süre boyunca takip edildi. Normal diyet ile beslenen Zebra balığı (Balık A, B, C) overfed zebrabalıkları (Balık D, E, F) kadar erken haftada 1 gibi yüksek kan şekeri düzeylerini yaşanırken, kararlı kan şekeri seviyeleri her zaman sergiledi ve bu hiperglisemi durumu muhafaza 5 haftalık çalışma süresi (Şekil 5) boyunca.

Figür 1
Şekil 1:. Yetişkin Zebra balığı Gönderen Kan Toplama Prosedürü (A) Cam iğneler iğne çektirmenin kullanarak hazırladı. Eğik ince bir makas kullanarak iğne ucu Kesme (B). (C), yaklaşık 135 mikron bir ucu çapı olan bir hazır kesilmiş iğne. Ölçek çubuğu = 1 mm. (D) Kan toplama cihazları: bir aspiratör borusumontaj (solda) ve bir ampul dağıtıcı (sağda). Oklar microcapillary İğneyi tutmak için burun göstermektedir. Ok aspiratör borusu düzeneğinin ağızlığı gösterir. İğne numune toplama öncesi burunluğun ucuna konumlandırılır. (E) iğne Heparinizing. (F) Bir balık anestezi. (G) anestezikler ile ıslatılmış kağıt havlu üzerine balık yerleştirin. (H) kan toplama sitesine 30-45 ° 'lik açıyla iğne takın. (I) Kan iğne içine yükseliyor. (J) Kanama durdu ve bir <650 mikron delinme çember ve yüksek büyütme gösterilir. Parafilm bir parça üzerine iğne kan kovma (K). (L), bir glikoz metre kullanılarak kan şekerinin ölçülmesi.

Şekil 2,
(A) Anatomik noktalar şematik Temsilciliği beyaz çizgi dorsal bölgedeki anüs vücut ekseni ve posterior boyunca kan koleksiyonu için ponksiyon sitesine gösterir Aorta. (B) Birincil gemiler dorsal aorta ve posterior kardinal ven vardır; Bu omurga ventral yer almaktadır. S, omurga; DA, dorsal aort; PCV, posterior kardinal ven.

Şekil 3,
Şekil 3:. Kan Örnekleme ve Vücut Ağırlığı Maksimum Hacim İlişkisi (2-6 aylık, 42 erkek ve 41 kadın) 83 Zebra balığı toplam maksimal kan toplama uygulandı.

Şekil 4,
Şekil 4:. Tekrarlayan kan Örnekleme ile 1 haftalık Dönemine Göre Hemoglobin Düzeyleri değişiklikler A 2kan ul numune haftada bir kez 2 gün, haftada bir kez ya da 5 ul bir kez, günlük olarak, aynı bireysel balık toplanmıştır (n = 5). Hemoglobin kan toplama öncesinde her grubun düzeyleri (gün 0, beyaz çubuk) ve tekrarlanan kan örneklemesi sonra (gün 7, gri bar) gösterilir. Değerler ortalama (SEM) ± standart hata araçlardır. * P <0.05, ** p <ref uyarlanmıştır günde 0.. 15 vs 0.01.

Şekil 5,
Şekil 5:. 5 haftalık Dönemi boyunca altı Bireysel Erkek Balık Açlık Kan Şekeri Konsantrasyonlarda değişiklikler Balık A, B ve C normal diyet grup vardı. Balık D, E ve F overfed grup vardı.

Tablo 1
Tablo 1: Erkek Hemoglobin, kan şekeri, TG ve Total Kolesterol Düzeyleri veKadın Zebra balığı 4 - Çağın 6 Ay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biz seri erişkin zebrabalıkları kan elde etmek için burada ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu yöntem gerçekleştirmek için basittir ve günlük olarak laboratuvarda kullanın. Bu kan toplama yöntemi Zebra balığı en dorsal aort içine bir cam kılcal iğne takmadan dayanmaktadır. Bu işlem sırasında, o dorsal aorta arıyor için kriter olduğu için omurgayı baskılamak için dikkatli olmak önemlidir. Omurga yaralanması azaltılması hayatta kalma oranını artıracaktır. Bu teknik, basit ve usta kolay olmasına rağmen, yüksek başarı ve hayatta kalma oranlarını sağlayabilirsiniz en iyi uygulamalar vardır. Bir usta araştırmacı (balık suyun dışında olduğu zaman, hangi 3.6 Protokolü 2.3) kan alma prosedürünü yürütmek için 1-2 dakika sürer. Büyük ölçekli deneylerde zamandan tasarruf etmek için, bir çift takım yaklaşımı kan toplama gerçekleştirmek için tavsiye edilir. İkinci ele verebilir Örneğin, bir araştırmacı, kan örneklemesi gerçekleştirebilirbalık, anestezi uygulamasında ve toplanan kan (vb, kan şekeri ölçüm kayıt veya mikrosantrifüj tüp kan hareketli) analiz.

Bu yöntemi kullanarak, her balık toplanabilir maksimum kan numune hacmi zebrabalıkları toplam dolaşımdaki kan hacmi vücut ağırlığının% 2'sinden fazla olduğuna işaret ne olursa olsun, cinsiyet 15, vücut ağırlığının yaklaşık olarak% 2 olduğunu göstermiştir. Önceki çalışmalar bu teleost balık (Osteichthyes spp. Ve Salmo gairdneri gairdneri) gösterdi ve böylece biz 2-3,8% olması Zebra balığı toplam dolaşımdaki kan hacmini tahmin, vücut ağırlığının 17,18 1,8-3,8% arasında değişen toplam kan hacmi sahip zebrabalıkları vücut ağırlığıdır. Tek bir kan toplanması için, şiddetle, kan örneklemesi kan ≥5 ul elde etmek için 3 aylık ya da> 0.3 g vücut ağırlığı zebrafish yapılmalıdır öneririz. O değilyaklaşık zebrabalıkları yarısı kan vücut ağırlığının% 2 uzaklaştırılmış halde hayatta eworthy olan zebra balığı, kan kaybı ile iyi başa olabileceğini ortaya koymuştur.

Bu yöntemin en önemli avantajı, aynı bireyden elde tekrarlanan kan örnekleme mümkün kılmasıdır. Biz hemoglobin düzeylerinde değişiklikler (Şekil 4) ölçerek en uygun hacim ve kan örneği sıklığını belirledi. Bu tekrar kan örneği almak için ses ve aralık kan kaybı anemi ve hemorajik ölüm önlemek için hafta başına vücut ağırlığının ≤0.4 ve% 2 hafta başına vücut ağırlığının ≤1% olması önerilir. Bu sonuç, kemirgen hayvanların modeli 19,20 tekrarlanan kan örneklemesi için uygulama kılavuzları ile uyumludur.

Deney zebrabalıkları kurban sağlar, iğne, bir troubl olarak dorsal aorta bölgesinde solungaç bir vücut ekseni boyunca konuma, arka içine sokulabilireshooting ya da alternatif bir metot. Bu site kalbe yakın olduğu ve aort kan toplama işlemi daha kolay yapabilirsiniz, hangi nispeten büyük.

Zebra balığı başarıyla diyabet 21,22, obezite 23,24, yağlı karaciğer hastalığı ve ateroskleroz 25 26 olmak üzere metabolik sendromların, birbiriyle koşulları modelleme kullanılmıştır. Biz daha diyete bağlı şişmanlık, glukoz metabolizmasını (Şekil 5) gözlemlemek için bu tekniği. Yüksek yağlı diyetle beslenen zaman memelilere benzer, zebra balığı da anormal glikolipid metabolizması geliştirdi. Her bireyin açlık kan şekeri değişiklikleri insanlarda 15,27 yılında benzer overfeeding yanıt bireysel farklılıklar gösterdi. Bu sonuç, bireysel balık biyokimyasal kan parametreleri zamansal değişikliklerin bir soruşturma metabolik bozukluklar su bireysel farklılıkları belirlemek için iyi bir fırsat sağlayacaktır belirtirobezite ve tip 2 diabetes mellitus gibi ch, böylece daha fazla insan hastalığı için bir hayvan modeli olarak değerini teyit etmektedir.

Genel olarak, biz yetişkin zebrafish tekrarlanan kan toplama için yeni bir yöntem geliştirdi. Bu yöntem, böyle toksikokinetik, farmakokinetik ve hematoloji çalışmaları gibi, tekrarlanan kan örnekleri gerektiren zebra balığı araştırma için gereklidir. Bundan başka, bu tekrarlanan kan numune alma yöntemi aynı zamanda, örneğin, biyomedikal araştırmalar diğer küçük akvaryum balıkları uygulanabilir Medaka (Oryzias latipes) ya da Xiphophorus (Xiphophorus helleri).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillaries with filament Narishige GD-1 1.0 mm outer diameter.
Needle puller Narishige PC-10 To produce the needles
Heparin Wako Pure Chemical Industries 081-00136 For heparinization
Aspirator tube assembly Drummond 2-040-000 For blood collection
Bulb dispenser Drummond 1-000-9000 For blood collection
2-phenoxyethanol Wako Pure Chemical Industries 163-12075 For anesthetizing the fish
DRI-CHEM3500V Fujifilm - For hemoglobin measurement
DRI-CHEM Slides Fujifilm Hb-WII For hemoglobin measurement
Glutest Neo Super Sanwa Kagaku Kenkyusho - For bood glucose measurement
Wako L-type TG kit Wako Pure Chemical Industries 464-44201 For TG measurement
Wako L-type CHO kit Wako Pure Chemical Industries 460-44301 For total cholesterol measurement
Parafilm M Alcan Packaging PM996 To expel the blood on

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, (5), 353-367 (2007).
  2. Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
  3. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
  4. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25, (3-4), 239-249 (1999).
  5. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107, (4), 731-738 (1999).
  6. Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98, (10), 3087-3096 (2001).
  7. Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42, (8), 697-706 (2014).
  8. Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
  9. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6, (5), 1080-1088 (2013).
  10. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, (2), 205-213 (2010).
  11. Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58, (8), 1844-1851 (2009).
  12. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, (21), (2010).
  13. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7, (5), e36474 (2012).
  14. Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105, (1-2), 107-118 (2011).
  15. Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10, (3), 425-432 (2013).
  16. Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
  17. Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
  18. Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
  19. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21, (1), 15-23 (2001).
  20. Nahas, K., Provost, J. -P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34, (4), 362-371 (2000).
  21. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236, (4), 1025-1035 (2007).
  22. Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15, (6), 885-894 (2012).
  23. Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).
  24. Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
  25. Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69, (23), 3953-3961 (2012).
  26. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104, (8), 952-960 (2009).
  27. Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55, (5), 934-942 (1992).
Yetişkin Zebra balığı Kan Testleri için Tekrarlanan Kan Alma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).More

Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter