Summary
Questo manoscritto descrive una tecnica di modellazione di capsulare infarto. Qui abbiamo utilizzato una tecnica photothrombotic modificato con bassa intensità della luce dopo la mappatura di destinazione pre-intervento chirurgico. Utilizzando questa tecnica, abbiamo creato un modello circoscritto infarto capsulare con disabilità motoria persistente.
Introduction
Fino a poco tempo, il "colpo materia grigia (GMS) modelli" sono stati utilizzati esclusivamente per capire la fisiopatologia di ictus e per guidare lo sviluppo di nuovi trattamenti. Tuttavia, vi è stato un aumento della prevalenza di ictus che colpisce la sostanza bianca sottocorticale in individui anziani, che costituisce 15 - 25% di tutti gli ictus 1,2. Numerosi studi sono stati condotti per quanto riguarda corsa utilizzando modelli GMS, mentre ci sono pochi studi che hanno utilizzato sostanza bianca ictus modelli (WMS). La sostanza bianca nei roditori è sostanzialmente inferiore della sostanza bianca in esseri umani o primati. Di conseguenza, è più difficile accedere selettivamente e distruggere le regioni bersaglio nella materia bianca 3. Inoltre, non strumenti efficaci sono stati sviluppati fino ad oggi per distruggere selettivamente nella misura prevista della sostanza bianca mirato. Pertanto, vi è stata mancanza di modelli appropriati per lo studio di colpi materia bianca.
st Animalmodelli Roke sono spesso utilizzati per monitorare l'andamento della ripresa motore per lo sviluppo di nuovi metodi terapeutici e riabilitativi. E 'ideale per utilizzare un modello animale che presenta un deficit neurologico a lungo termine concorde con le alterazioni anatomiche dimostrato in corsa umana 4,5. A questo proposito, il rapido recupero del deficit motorio e in largo coinvolgimento del cervello seguente lesione infartuale non può essere realistico nel perseguimento della ricerca ictus. Precedenti modelli capsulare infarto sono state fatte da occlusione della carotide interna o arterie coroide anteriori e diffusione di endotelina-1 (ET-1) nella capsula interna 6-9. Tuttavia, occlusione dell'arteria richiede un'attenta dissezione delle arterie, ma produce una vasta area di infarto lesioni, compresa la capsula interna, senza deficit comportamentali persistenti. Inoltre, ET-1 non era diffusa distruggere completamente la parte posteriore della capsula interna, e quindi meno marcato o persistente behdeficit avioral.
Un modello infarto photothrombotic è stato ampiamente utilizzato per generare vari tipi di lesioni infarto nella corteccia e strutture sottocorticali 10. La tecnica comprende la somministrazione endovenosa seguita da illuminazione focale, che conduce all'aggregazione piastrinica nei piccoli vasi e la generazione delle lesioni infarto 10. Tecnica Photothrombotic è stato ampiamente utilizzato per creare lesioni GMS, mentre è stato raramente utilizzato per generare WMS lesioni 5,11. Per questa tecnica, una combinazione di Rosa Bengala tintura e irradiazione di luce è stata dimostrata per essere utile nella distruzione della struttura bersaglio, causando corrispondente deficit funzionali. L'elemento chiave della tecnica photothrombotic è irradiazione di luce, perché determina la dimensione delle lesioni infarto. risultati irradiazione di luce in effetti diversi sulla materia grigia e materia bianca, perché la diffusione della luce è superiore a 4 volte superiore a ma biancotter rispetto a materia grigia 12; Di conseguenza, se l'intensità della luce ha un sufficientemente basso irraggiamento (<1.140 mW / mm 2), si può limitare l'estensione a cui lesione photothrombotic influenza il grado di sostanza bianca (es., Capsula interna). Ad esempio, la luce di energia più elevata può indurre infarti sia in materia grigia e bianca, ma più bassa di luce di energia può indurre photothrombosis solo in materia bianca. Inoltre, la penetrazione di energia luminosa era molto limitata. Circa il 99% di energia luminosa è stato perso oltre 1 mm dalla sorgente di luce 13. Pertanto, si prevede che accuratamente mirata, minore energia luce induce photothrombosis solo nella materia bianca con una limitazione minima della sostanza grigia vicina.
Qui, descriviamo un nuovo metodo per creare lesioni infarto nell'area forelimb della capsula interna nei roditori. Descriviamo il metodo di identificazione della zona forelimb in ca internapsule, la tecnologia di irradiazione di luce, compresa la regolazione e la consegna di luce, e la generazione di una lesione infarto. Abbiamo anche descrivere test comportamentali utilizzati per valutare la completezza della modellazione capsulare.
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Protocol
Tutte le procedure sono state condotte secondo le linee guida istituzionali di Gwangju Institute of Science and Technology (GIST), e tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa a GIST.
1. Passi pre-lesione
- Identificazione della zona zampa anteriore nella capsula interna con AAV-GFP
- Casa e maniglia ratti Sprague Dawley (~ 400 g, 11 - 13 settimane) in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e gli elettrodi utilizzando uno sterilizzatore adeguato (a vapore o sterilizzazione al plasma). Utilizzare sterilizzatore a vapore a 121 ° C come impostazione di 30 minuti per la sterilizzazione e 30 min per secca.
- Anestetizzare l'animale con una miscela di ketamina cloridrato (100 mg / kg) e xilazina (7 mg / kg) con una iniezione intramuscolare. Controllare la profondità dell'anestesia con la zampa pizzicare. Mantenere la temperatura corporea a 37,5 ± 0,5 ° C tramite una piastra elettrica sottoil corpo dell'animale.
- Posto l'animale in un frame stereotassico utilizzando una barra orecchio e titolare bocca.
- Pulire e disinfettare il sito chirurgico con il 70% di alcol e la soluzione di iodio povidone. Infiltrati 2% lidocaina cloridrato sotto il cuoio capelluto nella zona del cranio di incisione destinati a ridurre il dolore intraoperatorio.
- Applicare veterinario pomata oftalmica per evitare l'essiccazione degli occhi. Posizionare un telino sterile sopra l'animale ai siti operativi. Mantenere tutte le procedure in condizioni sterili.
- Eseguire un'incisione mediana del cranio di 2 cm con un bisturi e ritrarre la pelle bilateralmente con divaricatori filo. Asciugare il cranio con tamponi di cotone e acqua ossigenata al 30%.
- Fare un foro con un trapano a mano pezzo sopra la zona degli arti anteriori di corteccia motoria (AP: +2,5 dal bregma, ML: ± 2,5 dalla linea mediana) e cancellare il tratto con micro-currette per il virus-iniezione.
- Scongelare la AAV-GFP (2 x 10 12 molecole di virus / ml) sul ghiaccio e di carico 1 ml divirus in una siringa da 10 microlitri. Posizionare la siringa sul telaio stereotassico.
- Spostare l'ago al foro pre-made e abbassare l'ago 1 mm di profondità nella dura.
- Iniettare il virus lentamente (0,1 ml / min) con una elevata precisione micropompa e lasciare l'ago in posizione per altri 10 minuti per consentire al virus di diffondere fuori.
- Dopo la pulizia del sito operatorio con irrigazione salina, fissare la ferita con 3-0 sutura in nylon; rilasciare il ratto dal telaio stereotassico e trasferirlo ad una camera di recupero. Somministrare ketoprofene (2 mg / kg) tramite un'iniezione intramuscolare per il controllo del dolore post-operatorio.
- Mantenere la temperatura corporea (37 ° C) con il rilievo di riscaldamento e somministrare antibiotici cefemi classe di seconda generazione (0,1%, 1 ml) mediante una iniezione intramuscolare e 2% lidocaina cloridrato per via sottocutanea come necessario. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a manteneredecubito sternale. Casa singola l'animale fino al completo recupero.
- Dopo 2 - 3 settimana di recupero, profondamente anestetizzare il ratto con una overdose di ketamina cloridrato (300 mg / kg) tramite un'iniezione intramuscolare nel cappuccio. Confermare la morte di animali per mancanza di punta pizzicare risposta, il polso e la respirazione. Posizionare la supina topo nella cappa.
- Aprire la cavità addominale attraverso un 'incisione a forma Y'per aprire la cavità toracica. Fissare di aorta discendente con una pinza emostatica e rottura nell'atrio destro del cuore di ratto per il drenaggio del sangue. Avviare perfusione nel ventricolo sinistro del cuore con fredda 1% paraformaldeide per 5 min (10 ml / min) seguito da 4% paraformaldeide per 30 min (10 ml / min).
- Togliere la testa topo da carcasse con un paio di forbici. Effettuare una incisione mediana dal collo al naso e rimuovere i muscoli del collo con forbice o rongeur in modo che il cranio è esposto. sezionare delicatamente le ossa del cranio e Duras fuori dal cervello.
- Estrarre il cervello e posizionare il cervello di ratto in una provetta conica da 50 ml riempito con 4% paraformaldeide overnight. Il giorno dopo, lavare il cervello con PBS 1X 3 volte e posizionarlo in una soluzione di saccarosio al 30%.
- Dopo il cervello affonda completamente al fondo della soluzione di saccarosio al 30%, posizionare il cervello in cryomold con OCT a -20 ° C in cryotome. Tagliare il cervello in piano coronale per uno spessore di 40 micron e un intervallo di 200 micron.
- Eseguire GFP colorazione immunoistochimica utilizzando il metodo di scorrimento 14. Applicare l'anticorpo primario (1: 200 di proteina anti-verde fluorescente, frazione IgG di coniglio) a fettine di cervello notte a 4 ° C. Il 2 ° giorno, lavare con 1% Phosphate Buffered Saline con (PBST) soluzione Tween-20 per 3 volte e applicare l'anticorpo secondario (1: 500 di capra anti-coniglio IgG (H + L)) per 1 ora. Sciacquare il vetrino con 1% PBST 3 volte. Posizionare il vetro di copertura sulla fetta cervello.
- Utilizzando un microscopio a fluorescenza (lunghezza d'onda di eccitazione470 nm, lunghezza d'onda di emissione di 525 nm, ingrandimento 5X), osservare la AAV-GFP assoni trasdotte nella capsula interna. Confrontare le posizioni di assoni trasdotti con il cervello di ratto Atlas 15 per determinare le coordinate stereotassica degli assoni trasdotte
- Regolazione dell'intensità luminosa appropriata per capsulare Infarct Modeling Pre-la lesione
- Costruzione della Optical Neural Interface
- Tagliare una lunghezza appropriata (4 cm) di un ago spinale calibro 27 con un mandrino all'interno utilizzando un trapano taglio.
NOTA: taglio può comprimere e schiacciare la punta dell'ago spinale; rimuovere il mandrino e lucidare la punta dell'ago spinale per rimuovere la porzione schiacciata dell'ago spinale e mantenere il calibro interno dell'ago spinale. - Striscia di lunghezza appropriata (10 cm) della guaina della fibra ottica (125 micron con un nucleo 62,5 micron) del cavo di zona un lato.
- Inserire il fi ottica unjackedber nel tubo di metallo (diametro esterno 3,8 mm, diametro interno 3,3 mm e lunghezza 17 mm), che viene poi serrato intorno alla fibra. Il tubo di metallo è utile per riempire lo spazio tra la fibra ottica e il mozzo dell'ago spinale. Bloccare minore di 1/2 del tubo metallico con un pressore due volte.
- Applicare la resina epossidica induribile a caldo sulla fibra ottica e inserire la fibra ottica nel ago spinale. Applicare una resina epossidica aggiuntivo allo spazio vuoto nel mozzo. Cura il epossidica per 20 min a 100 ° C per il fissaggio stabile.
- Cleave la fibra ottica che sporge fuori l'ago spinale e lucidare la fibra ottica sulla punta dell'ago spinale mediante lappatura diamante (lucidatura) fogli.
- Collegare la parte del connettore FC / PC del cavo di zona per l'accoppiatore del sistema laser verde e misurare l'intensità della luce dalla punta della fibra ottica utilizzando potere ottico digitale e contatore di energia.
- Tagliare una lunghezza appropriata (4 cm) di un ago spinale calibro 27 con un mandrino all'interno utilizzando un trapano taglio.
- Costruzione della Optical Neural Interface
2. PhotothromBotic Infarct lesione nella capsula interna
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e gli elettrodi utilizzando uno sterilizzatore adeguato (a vapore o sterilizzazione al plasma). Utilizzare sterilizzatore a vapore a 121 ° C come impostazione di 30 minuti per la sterilizzazione e 30 min per secca.
- Anestetizzare l'animale (~ 400 g, 11 - 13 settimane) con una miscela di ketamina cloridrato (100 mg / kg) e xilazina (7 mg / kg) con una iniezione intramuscolare. Controllare la profondità dell'anestesia con la zampa pizzicare. Mantenere la temperatura corporea a 37,5 ± 0,5 ° C tramite una piastra elettrica sotto il corpo dell'animale.
- Posto l'animale in un frame stereotassico utilizzando una barra orecchio e titolare bocca.
- Pulire e disinfettare il sito chirurgico con il 70% di alcol e la soluzione di iodio povidone. Infiltrati 2% lidocaina cloridrato sotto il cuoio capelluto nella zona del cranio di incisione destinati a ridurre il dolore intraoperatorio. Applicare veterinario pomata oftalmica per evitare l'essiccazione degli occhi.
- Applicare una garza sterile sopra il unIMAL ed esporre i siti operativi. Mantenere tutte le procedure in condizioni sterili.
- Eseguire un'incisione mediana del cranio di 2 cm e ritrarre la pelle bilateralmente con divaricatori filo. Asciugare il cranio con swap di cotone e perossido di idrogeno.
- Regolare l'altezza del morsetto naso fino al bregma e lambda sono allineate allo stesso livello. PUNTO CRITICO: Questo allineamento è fondamentale per avvicinarsi correttamente una struttura più profonda, come nell'eseguire una lesione infarto nella capsula interna nell'esperimento principale.
- Fare un foro (diametro: 2 mm; AP: -2,04 da bregma; ML: ± 3.0 dalla linea mediana) utilizzando un trapano per indurre photothrombosis.
- Polacco e pulire la punta della fibra ottica dell'interfaccia ottica. Fissare la ONI al telaio stereotassico senza piegarsi. Controllare la punta del ONI e pulirla chiaramente prima e dopo l'inserimento dell'interfaccia ottica.
- Misurare l'intensità del laser dalla punta della fibra ottica prima dell'inserimento del Optical interfaccia al sito di destinazione del cervello di ratto. Regolare l'intensità del laser di 3,5 mW, come confermato dalle fasi pre-operatorie, sulla punta della fibra ottica.
- Inserire la ONI nella zona di destinazione della capsula interna (-7,8 mm confermati dalla fase di pre-chirurgia) attraverso il foro.
- Mantenere la temperatura corporea a 37,5 ± 0,5 ° C durante photothrombosis. Una temperatura corporea inferiore non può produrre la misura attesa di infarto. Iniettare Rosa Bengala (2 ml / kg) attraverso la vena della coda.
- Accendere il 532 nm laser verde per 90 sec 1 min dopo l'iniezione Rosa Bengala. Dopo l'irradiazione, rimuovere delicatamente la ONI dal cervello. Dopo aver pulito la sede operativa, fissare la ferita fissare la ferita con 3-0 sutura in nylon; rilasciare il ratto dal telaio stereotassico e trasferirlo ad una camera di recupero.
- Per il gruppo sham-operated (SOG), eseguire una procedura di lesione fabbricazione identici, tranne per l'iniezione di soluzione fisiologica (0,2 ml / 100 g) invece di Rose-Bengala.
- Mantenere la temperatura corporea (37 ° C) con il rilievo di riscaldamento dopo l'intervento chirurgico e somministrare antibiotici (cefalosporine di seconda generazione, 0,1%, 1 ml) mediante una iniezione intramuscolare. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire animali post-chirurgica alla gabbia occupata da altri animali fino alla completa guarigione.
NOTA: esperimento preliminare è stata eseguita nelle stesse procedure per trovare l'intensità della luce ottimale da 1 mW a 5 mW e la procedura può essere richiesto di acquisire la misura soddisfacente di lesione in condizione diversa.
3. Valutazione di capsulare Infarct lesione
- Behavioral Test e raggruppamento degli animali
- Eseguire singolo pellet raggiungendo compiti come descritto da Whishaw et al. 14 per valutare il deficit motorio dell'arto anteriore ogni giorno per 1 settimana dopo la modellazione ictus. Eseguire una singola attività pellet raggiungere(SPRT) in animali da limitato (90% del controllo del peso corporeo) usando plexiglass trasparente (30 x 15 x 35 cm di altezza) ad un'ampia feritoia 1 cm e una mensola cibo nel fronte al centro della parete anteriore.
- Mettere una pallina sullo scaffale cibo obliquamente controlaterale alla zampa anteriore preferito. Somministrare 20 pellet per sessione per 3 settimane.
NOTA: Un numero di successo di termometri campioni a resistenza è definita come una portata in cui l'animale afferra un pellet cibo e la mette in bocca senza farla cadere. - Calcolare il punteggio come percentuale raggiunge successo, che è definito dalla seguente formula:
NOTA: Dividiamo gli animali in 3 gruppi: il gruppo sham-operated (SOG), gruppo di recupero moderato (MRG), e poveri gruppo di recupero (PRG). Se il punteggio SPRT post-stroke> 50%, classifichiamo i ratti come MRG, che indica la presenza di una lesione sostanziale, ma distruzione non completa della target. Se il punteggio SPRT post-ictus è <50% rispetto al punteggio SPRT pre-corsa, classifichiamo il gruppo come PRG, che indica la lesione completa nel target.
- Conferma neuroistologici di Infarct lesione
- Eseguire perfusione cardiaca con 4% paraformaldeide come precedentemente descritto. Dopo il cervello affonda completamente nella soluzione di saccarosio al 30%, eseguire sezionamento coronale per uno spessore di 10 um e un intervallo di 200 micron utilizzando un microtomo o cryotome 4.
- Stain con H & E, Nissl, Luxol veloce blu-PAS, Neurofilament proteina-L o gliali colorazione della proteina acida fibrillare e osservare i reperti istologici per determinare l'intensità della luce ottimale in grado di coprire l'intera larghezza della capsula interna nella zona di destinazione di osservare colorazione 4,17.
- Utilizzando il software ImageJ, misurare il volume della zona infartuata photothrombotic della capsula interna sugli scivoli cerebrali.
- Per misurare il volume della zona dell'infarto, avviare il software 'ImageJ'. Per aprire i file da essere impilati, selezionare 'immagine per Stacks' ( 'Immagine' → 'pile' → 'immagine per pile'). Modificare il nome del file e selezionare 'impostare la scala' ( 'Analisi' → 'Impostazione della scala') per modificare in scala.
- In 'Plugin', selezionare 'Misura pile' per calcolare il volume o la zona di immagini. Inserire l'intervallo di distanza di 2 immagini in 'Fetta spacing'. Fare un disegno del ROI (regione di interesse) di tutte le immagini e cliccare su 'misura'.
NOTA: Il software 'ImageJ' calcola automaticamente la superficie e il volume di ciascuna immagine e il volume totale di essi.
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Representative Results
Il metodo presentato qui è destinata a creare un infarto capsulare circoscritta con un deficit motorio persistente. Pertanto, è fondamentale per determinare correttamente il bersaglio all'interno della capsula interna nella fase pre-operatoria. La mappatura somatotopica di fibre piramidali nella capsula interna non è stata risolta fino ad oggi. Per identificare correttamente il bersaglio all'interno della capsula interna, l'area zampa anteriore deve essere delineata. Un'iniezione di AAV-GFP nell'area forelimb della corteccia motoria può tracciare gli assoni delle fibre piramidali nella capsula interna (figura 1). Altri rivelatori neurali, come biotinilato destrano ammina (BDA), può essere utilizzato per lo stesso scopo. Le coordinate stereotassica del bersaglio all'interno della capsula interna possono essere chiariti tracciando le proiezioni assoni che provengono dalla zona zampa anteriore della corteccia motoria alla capsula interna.
Figura 1. Identificazione della zona zampa anteriore nella capsula interna 2 settimane dopo l'iniezione di fibre assonali AAV-GFP. GFP-trasdotte che ha avuto origine dalla zona zampa anteriore della corteccia motoria sono mostrati nel nucleo ventrolaterale del talamo (frecce) e la porzione caudale della capsula interna (freccia). La linea tratteggiata indica il contorno della capsula interna, ed i numeri si riferiscono alle distanze da bregma. Hippo, ippocampo; CPU, putamen caudato; VL, nucleo ventrolaterale; IC, capsula interna. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
L'intensità della luce ottimale può essere diverso a seconda del ceppo e peso corporeo dell'animale ei tipi e diametri di fibre ottiche. Pertanto, l'intensità della luce ottimale dovrebbe essere determinato separatamente prima del principale dell'infarto la lesione esperimento. Utilizzando la procedura photothrombotic, l'intensità della luce può essere gradualmente aumentata fino alla estensione della lesione copre l'intera larghezza della capsula interna senza distruggere le vicine strutture sostanza grigia (Figura 2). L'intensità della luce ottimale può essere verificato confrontando la misura istologica della lesione dell'infarto e posizioni.
Figura 2. Estensione della dell'infarto lesioni Attraverso diversa intensità della luce laser da 2 mW a 5 mW 2 settimane dopo la lesione Photothrombotic. L'intensità della luce ottimale è considerato tra i 3 MW e 4 MW in questo contesto sperimentale. Le frecce indicano la lesione infartuale./53281/53281fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Noi preferiamo utilizzare il ONI in cui la fibra ottica è contenuto in un tubo metallico sottile (ago spinale). La fibra ottica può produrre dispersione della luce minima dal lato della fibra, che è in grado di generare ulteriori danni neurali lungo il tratto di fibra ottica. Encasement della fibra ottica è anche vantaggioso per impedire la flessione della fibra ottica in obiettivi più profondi, nonché per fissare la ONI al telaio stereotassico (Figura 3).
Figura 3. Costruzione della interfaccia ottico-neurale (ONI). (A) Taglio di ago spinale. (B) spelatura della fibra ottica. (C & d) Il tubo metallico di ancoraggio è inserita nelfibra ottica spogliato e stretta per fissare la fibra ottica al mozzo dell'ago spinale. (E) La fibra ottica epossidica aggiunto viene inserito l'ago spinale. (F) La resina epossidica è indurito a 100 ° C per 20 min. (G) La fibra ottica viene scisso sulla punta dell'ago spinale. (H) La fibra ottica è lucidato. (i) L'intensità della luce è misurata dalla punta della fibra ottica. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
La procedura photothrombotic produrrà lesioni riproducibili e le posizioni con ~ 70% di successo in caso di insufficienza del motore. Tipica capsulare infarto lesione comprende la dimensione ventrodorsale di fibre capsulari (Figura 4A). Inoltre, la lesione infartuale estende lungo l'asse antero-posteriore della capsula interna a causa di una maggiore diffusione della luce all'interno della fibra capsulare. (Figura 4B) Il tratto ottico situato sotto la capsula interna è costituita da fibre di sostanza bianca; pertanto, è spesso danneggiato da irradiazione di una maggiore intensità luminosa. Sezioni seriali e colorazione sono necessari per confermare tutto il volume e l'estensione dell'infarto. Il volume dell'infarto era 0,63 ± 0,37 millimetri 3. Per valutare la distruzione della capsula fibra, neurofilamenti e Luxol macchie veloce blu-PAS sono utili.
Figura 4. aspetto microscopico di capsulare infarto 3 settimane dopo Photothrombosis. Aspetto microscopico di capsulare infarto 3 settimane dopo photothrombosis. A) fetta di cervello di sezione coronale nel cervello di ratto. Arrowhead indica il tratto dell'ago contenente fibra ottica nel talamo e fino a capsula interna. B) Serial colorazione Nissl del coronale fette di cervello showi ng tutta l'estensione dell'infarto lesione nella capsula interna. Punte di freccia indica la lesione infartuale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Il successo della modellazione può essere valutata mediante test comportamentali utilizzando un singolo pellet raggiungendo compito. Le prestazioni comportamentali dopo 1 settimana a seguito della lesione infartuale è una buona guida per confermare la lesione accurata, che accompagna la perdita di valore persistente e marcata di SPRT nonostante l'allenamento quotidiano singolo pellet raggiungere (Figura 5). Una volta che il deficit motorio è mostrato nella PRG, il deficit neurologico persistente durante 3 mesi di osservazione. gruppo sham non ha mostrato la significativa diminuzione delle prestazioni SPRT dopo l'operazione.
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Figura 5. Variazione singolo pellet che raggiungono punteggi dopo capsulare Infart 4,20. I gruppi sperimentali (PRG e MRG) esposti significativamente diminuito immediatamente i punteggi dopo la lesione infartuale rispetto al gruppo sham-operated (SOG). Il MRG mostra una graduale ripresa di spettacoli sPRT, mentre il PRG esibisce danno motorio persistente nel tempo. Op, photothrombotic infarto lesione; PRG, povero gruppo di recupero; MRG, gruppo di recupero moderato. La significatività statistica è stata determinata con l'analisi misura ripetuta degli scostamenti. + SOG contro MRG; * SOG contro PRG. I dati sono media ± SEM. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il modello di infarto capsulare presentato qui dimostra una lesione mirata con disabilità motoria marcata e persistente della funzione degli arti anteriori. Modelli precedenti di ictus capsulare sottocorticale hanno dimostrato un insufficiente grado di compromissione motoria e un rapido 6,8,9 processo di recupero. In questo senso, questo modello assomiglia casi capsulare infarto clinici che presentano compromissione funzionale a lungo termine.
Le fasi più critiche nello sviluppo di un modello capsulare infarto circoscritto sono: 1) identificare correttamente la rappresentazione somatotopic della parte del corpo destinata per disabilitare la funzione all'interno della capsula interna; 2) identificare l'intensità ottimale del laser verde, che può distruggere l'intera larghezza della capsula interna con minima invasione della vicina strutture sostanza grigia; e 3) per posizionare con precisione la fibra ottica nella struttura finale. Anche se le tecniche presentate possono indurre circoscrivered modello infarto capsulare con un tasso di replicazione elevata (> 70%), piccole differenze nel targeting e grado di completezza di distruzione coprono l'intera larghezza della capsula interna può rappresentare differenti deficit motori.
Il tratto corticospinale si trova nella metà anteriore dell'arto posteriore nella capsula interna nell'uomo nonostante la controversia dell'organizzazione somatotopica 15. Al contrario, non vi è stata alcuna classificazione equivalente o spiegazione dettagliata dell'organizzazione somatotopica della capsula interna nei roditori. La mancanza di conoscenza per quanto riguarda l'organizzazione somatotopica spesso porta a obiettivi errate di infarto lesione all'interno della capsula interna con diversi esiti motori tra modelli capsulare infarto. Tuttavia, abbiamo identificato gli assoni GFP-trasdotte nella porzione caudale della capsula interna, che probabilmente rappresentano il percorso delle fibre motorie degli arti anteriori. Inoltre, la lesione di questa zona dimostrativecato un deficit marcata e persistente di raggiungere abilità degli arti anteriori. Pertanto, si consiglia la porzione caudale della capsula interna per lesione stereotassica per migliorare la validità del modello di capsula infarto.
Pre-regolazione dell'intensità luminosa è obbligatoria per produrre una misura uniforme infarto lesione modelli ictus perché il ceppo animale, il peso corporeo, la sorgente luminosa e tipi di ONI possono generare diverse dimensioni di infarto. Pertanto, esperimenti preliminari con diverse intensità di luce negli animali da esperimento con lo stesso ceppo e peso corporeo dovrebbero essere condotte fino a quando la lesione infartuale soddisfacente si ottiene con l'intensità della luce minima.
Forte intensità della luce che possono distruggere l'intera larghezza della fibra capsulare (anteriore-posteriore e misura dorsoventrale) che corrisponde alla zona forelimb con il minimo danno alle strutture adiacenti è considerato l'intensità della luce ottimale. il forelimb zona della capsula interna è delimitata dal talamo superiormente e inferiormente tratto ottico. Pertanto, la profondità di inserimento ONI deve essere accurata per distruggere l'intera estensione della IC in direzione dorsoventrale, con la conservazione simultanea delle strutture adiacenti superiori e inferiori. posizionamento impreciso della ONI provoca una distruzione incompleta di IC, che porta ad un rapido recupero del deficit motorio a seguito della plasticità sinaptica dei rimanenti fibre piramidali nella capsula interna. In esami istologici seriali, il fattore più confusione nell'induzione di un deficit motorio persistente era il posizionamento non corretto del ONI, che porta al fallimento di distruggere l'intera larghezza del PLIC 4,16. Pertanto, particolare attenzione dovrebbe essere prestata per raggiungere l'obiettivo corretto. Recentemente, Blasi et al. Riportato che duratura deficit puro-motore può essere prodotto facendo una lesione infarto in capsula posteriore internautilizzando endotelina-1 (ET-1) 17. Tuttavia, ET-1 può distruggere la struttura della materia grigia vicina dalla diffusione di ET-1.
test comportamentale è un riferimento immediatamente disponibile nel laboratorio di valutare la formazione di infarto lesione capsula interna. Tuttavia, si raccomanda la valutazione delle prestazioni del motore una settimana dopo infarto lesione di dividere gli animali in gruppi ripresa moderata e poveri. ripresa moderata stata definita come un aumento del punteggio prestazioni> 50% rispetto al punteggio prima lesione, mentre scarso recupero è stata definita come recupero <50%. Tra i test comportamentali motore zampa anteriore, il singolo pellet raggiungimento compito è uno dei test più sensibili per entrambe le misurazioni quantitative e qualitative delle prestazioni motorie ictus indotta 14. Il compito misura quantitativamente il successo raggiungendo contemporaneamente fornire un'analisi dell'uso forelimb, come afferrare e recuperare un alimentopellet. L'analisi qualitativa del movimento di raggiungere è anche utile per differenziare la qualità del recupero ictus distinguendo genuino recupero funzionale o di compensazione 20. Qui, abbiamo descritto brevemente la misurazione quantitativa della SPRT; Tuttavia, l'analisi qualitativa con le riprese e il punteggio sulla base di un'analisi fotogramma per fotogramma è consigliato per ulteriori analisi dettagliata.
Le tecniche qui presentate non devono essere limitate alla induzione di modellazione circoscritto capsulare infarto. La tecnica può essere applicata alla induzione di una lesione infarto in altri settori della materia bianca, come il corpo calloso, commissure anteriori e fibre di collegamento tra strutture neurali. La combinazione del minuscolo ONI e photothrombotic tecnica basata sulle proprietà ottiche della materia bianca è probabile distruggere le strutture target con il minimo danno alle strutture adiacenti. Ad esempio, infarti lacunari possono produrre facilmented di mira le strutture sottocorticali relativi alle funzioni motorie, cognitive e di memoria. Quando la struttura di destinazione è grande, più inserimenti della ONI e diverse di targeting e angolati traiettorie possono essere necessari per produrre la misura desiderata delle lesioni.
Esistono diverse limitazioni di questa tecnica. La tecnica è sufficiente per dimostrare la conseguenza di infarto lesione nel PLIC e il successivo recupero. Tuttavia, questo modello non rispecchia l'intera gamma di WMS umani, perché la distruzione photothrombotic della sostanza bianca differisce leggermente da WMS umani. Di conseguenza, i risultati di imaging neurobiologici o MRI possono presentare caratteristiche diverse nella fase iniziale della lesione photothrombotic. Pertanto, questo modello dovrebbe essere opportunamente utilizzato per il commercio fuori vantaggi e gli svantaggi del modello. Tecnicamente, non tutti gli interventi chirurgici in grado di produrre il deficit motorio marcata e permanente in questo modello perché richiede procedure molto precise. Specifically, mani esperte ed esperti sono necessari per produrre l'alta riproducibilità nella generazione di questo modello.
In conclusione, l'uso combinato di una tecnica photothrombotic, ottimizzazione dell'intensità luminosa, e correggere il targeting è una tecnica utile per produrre un modello capsulare infarto circoscritto. Questo modello sarà utile non solo per studiare WMS alla comportamentale, il circuito, e livelli cellulari, ma anche per valutare l'utilità di nuovi interventi terapeutici e riabilitativi.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte dell'Istituto di Medical System Engineering (IMSE) e Gist-Caltech Fondo Collaborative (K04592) da GIST e dal Programma di ricerca di scienza di base attraverso la NRF della Corea finanziato dal Ministero della Scienza, ICT e la pianificazione futura (NRF-2013R1A2A2A01067890).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
| Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
| Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
| Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
| Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
| Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m |
|
| Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
| Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS |
|
| Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
| Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
| Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
| Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
| Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
| Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
| Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
| AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
| Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
| Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
| Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
| Hand Piece Drill | Seshin | ||
| Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
| Ketoprofen | UNIBIOTech |
References
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