Summary
Dette manuskriptet beskriver en modelleringsteknikk av kapsel infarkt. Her benyttet vi en modifisert photothrombotic teknikk med lav intensitet av lys etter pre-kirurgi mål kartlegging. Ved hjelp av denne teknikken, har vi opprettet en omskrevet kapsel infarktet modell med vedvarende motor verdifall.
Introduction
Inntil nylig har den "grå materie slag (GMS) modeller" er utelukkende brukt til å forstå patofysiologien for slag og for å lede utviklingen av nye behandlingsmetoder. Imidlertid har det vært en økende forekomst av hjerneslag som rammer subcortikal hvit substans hos eldre personer, som utgjør 15-25% av alle slag 1,2. Tallrike studier har blitt utført av hjerneslag ved hjelp av GMS-modeller, mens det er få studier som har brukt hvit substans slag (WMS) modeller. Hvit substans i gnagere er vesentlig mindre enn den hvite substansen i mennesker eller primater. Følgelig, er det vanskeligere for selektivt å åpne og ødelegge målregioner i hvit substans 3. I tillegg har noen effektive verktøy er utviklet for å date for å selektivt ødelegge den planlagte omfanget av målrettet hvit substans. Derfor har det vært mangel på egnede modeller for studier av hvit substans slag.
Animal stRoke modeller blir ofte brukt til å overvåke utviklingen av motor utvinning for utvikling av ny rehabiliterende og terapeutiske metoder. Det er ideelt å benytte en dyremodell som viser en langsiktig nevrologiske utfall konkordant med anatomiske forandringer påvist i menneskelig hjerneslag 4,5. I denne forbindelse, kan rask gjenoppretting av motorisk svikt og bred involvering av hjernen etter infarktet lesioning ikke være realistisk i jakten på hjerneslag forskning. Tidligere kapselinfarkt modeller har blitt gjort av okklusjon av carotis interna eller anterior koroidal arterier og spredning av endotelin-1 (ET-1) i den indre kapselen 6-9. Likevel krever arterie okklusjon forsiktig disseksjon av blodårene, men den produserer et bredt spekter av infarkt lesjon, herunder den interne kapsel, uten vedvarende atferds underskudd. Videre ET-en var ikke diffust å fullstendig ødelegge den bakre lem av den interne kapselen, og dermed mindre markert eller vedvarende behavioral underskudd.
En photothrombotic infarkt modell har blitt mye brukt for å generere ulike typer av infarkt lesjoner i cortex og subkortikale strukturer 10. Teknikken inkluderer intravenøs administrering etterfulgt av fokal belysning, noe som fører til blodplateaggregasjon i de små fartøyer og generering av infarkt lesjoner 10. Photothrombotic teknikken har blitt mye brukt til å lage GMS lesjoner, mens det har sjelden blitt brukt til å generere WMS lesjoner 5,11. For denne teknikken, har en kombinasjon av Rose Bengal fargestoff og lysbestråling blitt vist å være anvendbare i ødeleggelse av målstrukturen, forårsaker tilsvarende funksjonsproblemer. Hovedelementet i photothrombotic teknikken er lys bestråling, fordi den bestemmer størrelsen på infarkt lesjoner. Lys bestråling gir ulike effekter på små grå og hvit substans, fordi spredning av lyset er mer enn 4 ganger høyere i hvitt matter sammenlignet med grå materie 12; Følgelig, hvis lysintensiteten har en tilstrekkelig lav irradians (<1,140 mW / mm 2), kan man begrense utvidelsen til hvilken photothrombotic lesjon påvirke graden til hvit substans (f.eks., Intern kapsel). For eksempel kan lys av høyere energi indusere infarkter i både grå og hvit substans, men likevel lavere energilampen kan indusere photothrombosis bare i hvit substans. Videre penetrasjon av lysenergien var svært begrenset. Omtrent 99% av lysenergien som gikk tapt utover 1 mm fra lyskilden 13. Derfor er det forventet at nøyaktig målrettet, induserer lavere energilampen photothrombosis bare i hvit substans med en minimal inngrep av nabo grå materie.
Her beskriver vi en ny fremgangsmåte for å skape infarkt lesjoner i forbena område av den indre kapsel i gnagere. Vi beskriver metoden for identifisering av forbena område i det indre ca.psule, teknologien for lysbestråling, herunder justering og levering av lys, og generering av en infarkt lesjon. Vi beskriver også atferdstesting for å vurdere fullstendigheten av kapsel modellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer i Gwangju Institute of Science and Technology (GIST), og alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved GIST.
1. Pre-lesioning Steps
- Identifikasjon av forbena området i det indre Capsule med AAV-GFP
- Hus og håndtere Sprague Dawley rotter (~ 400 g, 11 - 13 uker) i samsvar med institusjonelle og nasjonale retningslinjer.
- Steriliser alle kirurgiske verktøy og elektroder ved hjelp av en passende sterilisator (Steam eller plasma-sterilisator). Bruk dampsterilisator ved 121 ° C som innstilling på 30 min for sterilisering og 30 min for tørr.
- Bedøve dyret med en blanding av ketamin-hydroklorid (100 mg / kg) og xylazin (7 mg / kg) via en intramuskulær injeksjon. Sjekk anestesidybden ved pote knipe. Opprettholde kroppstemperatur på 37,5 ± 0,5 ° C via en varmematte underkroppen til dyret.
- Plasser dyret i en stereotaktisk ramme ved hjelp av et øre bar og munnen holder.
- Rengjør og desinfiser kirurgiske området med 70% alkohol og povidonjodid løsning. Infiltrere 2% lidokain hydroklorid under hodebunnen i den hensikt å skalle snittområdet for å redusere den intraoperativ smerte.
- Påfør veterinær oftalmisk salve for å hindre uttørking av øynene. Plasser en steril drapere over dyret til de operative områder. Opprettholde alle prosedyrer i sterile forhold.
- Utfør en midtlinjen hodeskalle snitt på 2 cm ved hjelp av en skalpell og trekke huden bilateralt med trådstrammere. Tørk skallen med bomullspinner og 30% hydrogenperoksid.
- Lag et hull med en hånd stykke drill over forbena område av motor cortex (AP: 2,5 fra bregma, ML: ± 2,5 fra midtlinjen) og tømme kanalen med micro-currette for virus-injeksjon.
- Tine AAV-GFP (2 x 10 12 virus molekyler / ml) på is og last 1 mL avvirus i en 10 mL sprøyte. Plasser sprøyten på stereotaktisk ramme.
- Flytt nålen til pre-laget hull og senke nålen 1 mm dypt inn i dura.
- Injisere virus langsomt (0,1 mL / min) ved anvendelse av en høy presisjon mikropumpe og la nålen på plass i ytterligere 10 min for å la viruset for å diffundere ut.
- Etter rengjøring av operasjonsstedet med saltvann vanning, sikre såret med 3-0 nylon sutur; frigjøre rotte fra stereotaktisk ramme og overføre den til en utvinning kammer. Administrere ketoprofen (2 mg / kg) via en intramuskulær injeksjon for postoperative smertekontroll.
- Å opprettholde kroppstemperatur (37 ° C) med varmeputen og administrere andre generasjons cefemer klasse antibiotika (0,1%, 1 ml) via en intramuskulær injeksjon og 2% lidokain-hydroklorid via subkutan injeksjon etter behov. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholdesternal recumbency. Enebolig dyret før full gjenoppretting.
- Etter 2 - 3 ukers bedring, dypt bedøve rotte med en overdose av ketamin-hydroklorid (300 mg / kg) via en intramuskulær injeksjon i hetten. Bekreft død av animalske mangel på tå knipe respons, puls og pust. Plasser rotte liggende i panseret.
- Åpne bukhulen via en 'Y'-formet snitt til å åpne brysthulen. Tett klemme synkende aorta med pinsetten og brudd i høyre atrium av rotte hjerte for blod drenering. Initiere perfusjon inn i den venstre ventrikkel av hjertet med kald 1% paraformaldehyd i 5 minutter (10 ml / min), fulgt av 4% paraformaldehyd i 30 minutter (10 ml / min).
- Ta rotta hodet fra kadaveret ved hjelp av en saks. Lag en midtlinjen snitt fra nakken til nesen og fjerne nakkemusklene ved hjelp av saks eller rongeur slik at skallen er utsatt. Forsiktig dissekere kraniet og Duras ut fra hjernen.
- Pakk hjernen og plassere rottehjernen i en 50 ml konisk rør fylt med 4% paraformaldehyde natten. Den neste dagen, vaske hjernen med 1x PBS 3 ganger og legg den i en 30% sukrose løsning.
- Etter hjernen helt synker til bunnen av den 30% sukroseløsning, plasserer hjernen i cryomold med oktober forbindelsen ved -20 ° C i cryotome. Skjær hjernen i koronale plan i en tykkelse på 40 um og et intervall på 200 um.
- Utfør GFP immunhistokjemi flekker bruker lysbilde metode 14. Anvende primære antistoff (1: 200 av anti-grønt fluorescerende protein, Kanin IgG-fraksjonen) til hjerneskiver over natten ved 4 ° C. På 2. dag, vask med 1% fosfatbuffret saltvann med Tween-20 (PBST) løsning 3 ganger, og anvende det sekundære antistoff (1: 500 av geit-anti-kanin IgG (H + L)) i 1 time. Skyll lysbildet med en% PBST 3 ganger. Sett glasset på hjernen skive.
- Ved hjelp av en fluorescerende mikroskop (eksitasjon bølgelengde470 nm, emisjon bølgelengde 525 nm, forstørrelse 5X), observere AAV-GFP omsatte axoner i indre kapselen. Sammenlign plassering av transduserte axoner med rottehjerne Atlas 15 for å bestemme de stereotaktiske koordinatene til de transduserte axoner
- Pre-lesioning Justering av lysintensiteten Passer for Capsular Infarktmodeling
- Byggingen av den optiske Neural Interface
- Skjær en passende lengde (4 cm) av en 27 gauge spinal nål med en stylet innsiden med en skjæring drill.
MERK: Skjæring kan komprimere og knuse rygg nålespissen; fjerne sonden og polere rygg nålespissen for å fjerne den knuste del av rygg nålen og opprettholde den indre kaliber av rygg nålen. - Strippe en passende lengde (10 cm) av kappen til den optiske fiberen (125 um med en 62,5 um kjerne) av en side patch ledningen.
- Sett unjacked optisk fiber inn i metallrøret (ytre diameter: 3,8 mm, indre diameter: 3,3 mm og lengde: 17 mm), som deretter klemmes fast rundt fiberen. Metallrøret er nyttig for å fylle rommet mellom den optiske fiber og navet av rygg nålen. Klem nedre 1/2 av metallrøret med en trykk to ganger.
- Påfør varmeherdbar epoksy på den optiske fiber og sette inn den optiske fiberen inn i rygg nålen. Påfør et ekstra epoxy til den tomme plassen i navet. Herde epoksyen i 20 minutter ved 100 ° C i stabil fiksering.
- Spalter den optiske fiber som stikker ut fra rygg nål og polere den optiske fiber på spissen av den spinalnål ved hjelp av diamant lapping (polering) ark.
- Koble FC / PC-kontaktdelen av patch ledningen til kopleren på grønne lasersystemet og måle lysintensiteten fra spissen av den optiske fiber ved hjelp av digital optisk kraft og energimåleren.
- Skjær en passende lengde (4 cm) av en 27 gauge spinal nål med en stylet innsiden med en skjæring drill.
- Byggingen av den optiske Neural Interface
2. PhotothromBotic Infarkt Lesioning i det indre Capsule
- Steriliser alle kirurgiske verktøy og elektroder ved hjelp av en passende sterilisator (Steam eller plasma-sterilisator). Bruk dampsterilisator ved 121 ° C som innstilling på 30 min for sterilisering og 30 min for tørr.
- Bedøve dyret (~ 400 g, 11 - 13 uker) med en blanding av ketamin-hydroklorid (100 mg / kg) og xylazin (7 mg / kg) via en intramuskulær injeksjon. Sjekk anestesidybden ved pote knipe. Opprettholde kroppstemperatur ved 37,5 ± 0,5 ° C ved hjelp av en varmepute under kroppen til dyret.
- Plasser dyret i en stereotaktisk ramme ved hjelp av et øre bar og munnen holder.
- Rengjør og desinfiser kirurgiske området med 70% alkohol og povidonjodid løsning. Infiltrere 2% lidokain hydroklorid under hodebunnen i den hensikt å skalle snittområdet for å redusere den intraoperativ smerte. Påfør veterinær oftalmisk salve for å hindre uttørking av øynene.
- Påfør en steril drapere over enimal og avsløre de operative områder. Opprettholde alle prosedyrer i sterile forhold.
- Utfør en midtlinjen hodeskalle snitt på 2 cm og trekke huden bilateralt med trådstrammere. Tørk skallen med bomulls swapper og hydrogenperoksid.
- Justere høyden på neseklemmen til bregma, og lambda er innrettet på samme nivå. Kritisk trinn: Denne justeringen er kritisk for korrekt nærme seg en dypere struktur, slik som i å utføre en infarkt lesjon i den interne kapselen i hovedforsøket.
- Lag et hull (diameter: 2 mm, AP: -2,04 fra bregma, ML: ± 3,0 fra midtlinjen) ved hjelp av en drill for å indusere photothrombosis.
- Polish og rengjør den optiske fiber spissen av det optiske grensesnittet. Fest ONI til stereotaxic rammen uten å bøye. Sjekk tuppen av ONI og tørke den ut klart før og etter innsetting av optisk grensesnitt.
- Mål laserintensiteten fra spissen av den optiske fiber før innføringen av optical grensesnitt til målstedet av rottehjernen. Juster laserintensiteten til 3,5 mW, noe som bekreftes av pre-kirurgi trinn, på spissen av den optiske fiber.
- Sett ONI inn i målområdet av den indre kapsel (-7.8 mm bekreftet fra pre-kirurgi trinn) gjennom borehullet.
- Opprettholde kroppstemperatur på 37,5 ± 0,5 ° C under photothrombosis. En lavere kroppstemperatur kan ikke produsere den forventede omfanget av infarkt. Injisere Rose Bengal (2 ml / kg) via halevenen.
- Slå på 532 nm grønn laser i 90 sek 1 min etter at Rose Bengal injeksjon. Etter bestråling fjern forsiktig ONI fra hjernen. Etter rengjøring av operasjonsstedet, sikre såret sikre såret med 3-0 nylon sutur; frigjøre rotte fra stereotaktisk ramme og overføre den til en utvinning kammer.
- For sham-opererte gruppen (SOG), utføre en identisk lesjon lage prosedyre, med unntak for injeksjon av saltvann (0,2 ml / 100 g) i stedet for Rose-Bengal.
- Å opprettholde kroppstemperatur (37 ° C) med varmeputen etter kirurgi og administrere antibiotika (andre generasjons cefalosporin, 0,1%, 1 ml) via en intramuskulær injeksjon. Ikke la dyret uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Ikke returner post-kirurgiske dyr til buret okkupert av andre dyr før fullt restituert.
MERK: Innledende forsøk ble utført i de samme prosedyrer for å finne den optimale lysstyrken fra en mW til 5 mW og prosedyren kan være nødvendig for å skaffe tilfredsstillende grad av lesjon i annen tilstand.
3. Evaluering av Capsular Infarkt Lesioning
- Behavioral Testing og Animal gruppering
- Utfør enkelt pellet nå oppgaver som beskrevet av Whishaw et al. 14 for å evaluere motor underskudd på forbena hver dag i en uke etter slaget modellering. Utfør en enkelt pellet nå oppgaven(Sprt) i næringsbegrenset dyr (90% av kontroll kroppsvekt) ved bruk av store pleksiglass (30 x 15 x 35 cm høyde) med en 1 cm bred sliss og et mat hylle i fronten på midten av frontveggen.
- Plasser en pellet på mat hylle skrått kontralateral til den foretrukne forbena. Administrere 20 pellets per økt i 3 uker.
MERK: En vellykket rekke sprts er definert som en rekkevidde der dyret griper en mat pellet og setter den inn i munnen uten å miste den. - Beregn at resultatet i prosent av vellykkede delene, som er definert ved den følgende formel:
MERK: Vi deler dyrene inn i 3 grupper: sham-opererte gruppen (SOG), moderat bedring gruppe (MRG), og dårlig recovery gruppe (PRG). Hvis en etter slag Sprt poengsum> 50%, klassifisere vi rottene som MRG, noe som indikerer tilstedeværelse av en vesentlig lesjon, men ikke fullstendig ødeleggelse av TA-rFå. Hvis post-takts Sprt score er <50% sammenlignet med pre-takts Sprt score, klassifiserer vi gruppen som PRG, noe som indikerer fullstendig lesioning i målet.
- Neurohistological Bekreftelse på Infarkt Lesioning
- Utføre hjerte perfusjon med 4% paraformaldehyd som tidligere beskrevet. Etter hjernen fullstendig synker i 30% sukroseløsning, utføre koronal snitting i en tykkelse på 10 um og et intervall på 200 um ved anvendelse av en mikrotom eller cryotome 4.
- Flekken med H & E, Nissl, Luxol rask blå-PAS, neurofilament protein-L eller Glial fibrillary syre protein flekker og observere histologiske funn for å fastslå den optimale lysstyrken som kan dekke hele bredden av den interne kapselen i målområdet for å observere flekker 4,17.
- Ved hjelp av ImageJ programvare, måle volumet av den photothrombotic infarktområdet av den indre kapsel på hjernen lysbildene.
- For å måle volumet av infarktet området, lansere 'ImageJ' programvare. For å åpne filene som skal stables, velger du "på bildet for å Stacks '(' Bilde '→' Stacks '→' på bildet for å Stacks"). Rediger filnavnet og velg "Sett Scale" ( "Analyze" → "Sett Scale") til å redigere skala.
- I 'Plugins', velg 'Mål Stacks "for å beregne volum eller område av bilder. Sett avstanden intervall på 2 bilder til "Slice Spacing". Lag en tegning av ROI (Region Of Interest) av alle bildene og klikk "Mål".
MERK: Programvaren 'ImageJ' beregner automatisk areal og volum av hvert bilde og totalvolumet av dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden som presenteres her er ment å skape en omskrevet kapsel infarkt med en vedvarende motor underskudd. Derfor er det viktig å bestemme korrekt målet innen den interne kapselen i pre-kirurgi trinn. Den somatotopic kartlegging av pyramidale fibrene i indre kapselen er ikke avgjort ennå. For å identifisere målet korrekt i det indre kapselen, må forbena område være avgrenset. En injeksjon av AAV-GFP til forbena område av motor cortex kan spore aksoner i de pyramidale fibrene i den indre kapselen (figur 1). Andre neurale markører, såsom biotinylert dekstran amin (BDA), kan anvendes for det samme hensikt. De stereotaktiske koordinatene for målet innenfor den interne kapselen kan belyses ved å trekke de aksonale projeksjoner som stammer fra forbena området av motor cortex til den interne kapselen.
Figur 1. Identifisering av forbena området i den interne kapselen 2 uker etter injeksjonen av AAV-GFP. GFP-transduserte aksonal fibre som stammer fra forbena området av motor cortex er vist i ventrolateral kjernen i thalamus (piler) og haleparti av den indre kapsel (pilspiss). Den stiplede linjen viser konturen av den interne kapselen, og tallene viser til avstander fra bregma. Hippo, hippocampus; CPU, caudatus putamen; VL, ventrolateral kjernen; IC, intern kapsel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Den optimale lysintensitet kan være forskjellig avhengig av belastningen og kroppsvekt av dyret og typer og diametre optiske fibre. Derfor bør den optimale lysintensiteten bestemmes hver for seg før de viktigste infarkt lesioning eksperiment. Ved hjelp av photothrombotic prosedyren, kan lysintensiteten økes gradvis inntil graden av lesjon dekker hele bredden av den interne kapselen uten å ødelegge de nærliggende grå substans strukturer (figur 2). Det optimale lysintensitet kan verifiseres ved å sammenligne den histologiske grad infarktet lesjon og steder.
Figur 2. Omfanget av Infarkt Lesjoner tvers av varierende intensitet av laserlys fra to mW til 5 mW 2 uker etter Photothrombotic Lesioning. Den optimale lysintensiteten er ansett å være mellom 3 mW og 4 mW i denne eksperimentelle omgivelser. Pilene viser infarkt lesjon./53281/53281fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Vi foretrekker å bruke ONI i hvilken den optiske fiber er inneholdt i et tynt metallrør (spinalnål). Den optiske fiber kan gi minimal lysspredning fra siden av fiberen, som er egnet til å generere ytterligere neural skade langs den optiske fiber kanalen. Innstøping av den optiske fiberen er også fordelaktig for å hindre bøyning av den optiske fiber i dypere mål, så vel som for å feste ONI til den stereotaktisk ramme (figur 3).
Figur 3. Byggingen av den optiske nevrale Interface (ONI). (A) Skjæring av spinal nål. (B) Stripping av den optiske fiber. (C og d) å feste metallrøret er satt inn overstrippet optisk fiber og trangt som fester den optiske fiber til navet i rygg nål. (E) epoksy-tilsatte optiske fiber er innført i spinalnål. (F) epoksy er herdet ved 100 ° C i 20 min. (G) Den optiske fiberen blir spaltet ved spissen av rygg nålen. (H) Den optiske fiberen er polert. (i) lysintensiteten måles fra spissen av den optiske fiber. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Den photothrombotic prosedyre vil produsere reproduserbare lesjoner og steder med ~ 70% suksess i motorsvikt. Typisk kapsel infarkt lesjon omfatter ventrodorsal dimensjonen av kapsulære fibre (Figur 4A). Videre utvider infarkt lesjon langs anteroposterior aksen av den indre kapsel på grunn av økt lysspredning inne i kapsel fiberen. (Figur 4B) Den optiske kanalen som befinner seg under den indre kapselen består av hvit substans fibre; Således er det ofte skadet ved bestråling av en økt lysintensitet. Seriesnitt og flekker er nødvendig for å bekrefte hele volumet og omfanget av infarkt. Den infarktvolum var 0,63 ± 0,37 mm 3. For å vurdere ødeleggelsen av kapsel fiber, neurofilament og Luxol rask blå-PAS flekker er nyttig.
Figur 4. Mikroskopisk Utseende av Capsular Infarkt 3 uker etter Photothrombosis. Mikroskopisk utseendet kapselinfarkt 3 uker etter photothrombosis. A) Brain skive koronale delen i rottehjerne. Pilhode angir kanalen hos nålen inneholdende optisk fiber i thalamus og opp til interne kapselen. B) Serie Nissl farging av koronale hjernen skiver showi ng hele omfanget av infarkt lesjon i den indre kapsel. Pilspisser indikerer infarkt lesjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Suksessen til modellering kan evalueres ved atferdsmessige testing ved bruk av en enkelt pellet nå oppgaven. Den atferdsmessige resultater etter en uke etter infarktet lesioning er en god guide for å bekrefte nøyaktig lesioning, som følger med vedvarende og markert svekkelse av Sprt til tross for daglige eneste pellet nå opplæring (figur 5). Når motoren underskuddet er vist i PRG, nevrologiske underskudd vedvarte under tre måneders periode med observasjon. Sham-opererte gruppen ikke viser betydelig reduksjon av Sprt ytelse etter operasjonen.
laste opp / 53281 / 53281fig5.jpg "/>
Figur 5. Endringer i enkelt Pellet Reaching Poeng etter Capsular Infart 4,20. De eksperimentelle grupper (PRG og MRG) viste signifikant redusert score rett etter infarktet lesioning sammenlignet med sham-opererte gruppen (SOG). Den MRG viser en gradvis bedring av Sprt forestillinger, mens PRG viser vedvarende motor verdifall over tid. Op, photothrombotic infarkt lesioning; PRG, dårlig utvinning gruppe; MRG, moderat bedring gruppe. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av gjentatt måling analyse av avvik. + SOG versus MRG; * SOG versus PRG. Dataene er midler ± sem. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kapsel infarktet modellen presenteres her demonstrerer en målrettet lesjon med markert og vedvarende motor svekkelse i forbena funksjon. Tidligere modeller av subcortikal kapsel slag har vist en utilstrekkelig grad av motorfunksjon og en rask utvinning prosessen 6,8,9. I denne forstand, ligner denne modellen de kliniske kapselinfarkt tilfeller som viser langsiktig funksjonstap.
De mest kritiske trinn i utviklingen av en omskrevet kapsel infarkt modellen er: 1) for å korrekt identifisere somatotopic representasjon av hoveddelen beregnet for å deaktivere funksjonen i det indre kapsel; 2) å identifisere den optimale intensiteten av grønn laser, noe som kan ødelegge hele bredden av den interne kapsel med minimalt inngrep i nabo grå materie strukturer; og 3) for nøyaktig å plassere den optiske fiber i målstrukturen. Selv om de presenterte teknikkene kan indusere omskrived kapsel infarktet modell med høy replikering rate (> 70%), kan små forskjeller i målretting og graden av fullstendighet av ødeleggelse som dekker hele bredden av den interne kapselen rede for ulike motoriske underskudd.
Den corticospinal tarmkanalen ligger i fremre halvdel av bakre lem i den interne kapselen hos mennesker til tross for kontroversen av somatotopic organisasjon 15. I motsetning til dette, har det ikke vært tilsvarende klassifisering eller detaljert belysning av den somatotopic organiseringen av den interne kapselen hos gnagere. Mangelen på kunnskap om somatotopic organisasjonen fører ofte til feil mål av infarktet lesioning i det indre kapsel med ulike motoriske utfall blant kapselinfarkt modeller. Imidlertid har vi identifisert GFP-transdusert axoner i halepartiet av den indre kapsel, som sannsynligvis representerer banen til forbena motoriske fibrene. Videre lesioning av dette området demonstrated en markert og vedvarende underskudd på forbena nå dyktighet. Derfor anbefaler vi hale del av den interne kapselen for stereo lesioning å forbedre gyldigheten av kapselinfarkt modell.
Forhåndsjustering av lysintensiteten er obligatorisk for å fremstille en ensartet grad av infarkt lesjon hos slag modeller fordi dyret stamme, kroppsvekt, lyskilde og typer av ONI kan generere forskjellige størrelser av infarkt. Derfor bør preliminære forsøk under anvendelse av forskjellige lysintensiteter i forsøksdyr med den samme stamme og kroppsvekt gjennomføres inntil tilfredsstillende infarkt lesjon oppnås med minimal lysintensitet.
Sterkt lys intensitet som kan ødelegge hele bredden av det kapsulære fiber (anterior-posterior og dorsoventral utstrekning) som svarer til forbena område med minimal skade på de nærliggende strukturer er ansett for å være den optimale lysintensitet. den forelimb område av den indre kapselen er avgrenset av thalamus overlegent og den optiske kanalen inferiorly. Derfor bør dybden av ONI innsetting være nøyaktig for å ødelegge hele utstrekningen av IC i dorsoventral retning, med samtidig bevaring av de øvre og nedre nærliggende strukturer. Unøyaktig plassering av ONI resulterer i en ufullstendig ødeleggelse av IC, noe som fører til rask bedring av motorisk svikt som følge av synaptisk plastisitet av de gjenværende pyramidale fibrene i den indre kapsel. I serie histologiske undersøkelser, de mest problemfaktor i induksjon av en vedvarende motor underskudd var uriktig posisjonering av ONI, noe som fører til svikt for å ødelegge hele bredden av PLIC 4,16. Derfor bør forsiktig oppmerksomhet rettes for å nå riktig mål. Nylig, Blasi et al., Rapporterte at varig-ren motorisk svikt kan fremstilles ved å lage en infarkt lesjon i bakre indre kapselved hjelp av endotelin-1 (ET-1) 17. Men ET-en kan ødelegge nabo grå struktur ved diffusjon av ET-1.
Behavioral testing er en umiddelbart tilgjengelig målestokk i laboratoriet for å vurdere dannelse av infarkt lesjon i den indre kapsel. Men anbefales evaluering av motorytelse en uke etter infarktet lesioning å dele dyrene inn i moderate og dårlig utvinning grupper. Moderat gjenvinning ble definert som en økning i fremføringspartituret med> 50% sammenlignet med resultatet før lesioning, mens dårlig gjenvinning ble definert som utvinning av <50%. Blant de forbena motoriske atferdstester, den eneste pellet nå oppgaven er en av de mest følsomme tester for både kvantitative og kvalitative målinger av hjerneslag-indusert motor forestillinger 14. Oppgaven måler kvantitativt nå suksess samtidig gir en analyse av forbena bruk, slik som å gripe og å hente en matpellet. Den kvalitativ analyse av den nå bevegelsen er også nyttig til å skille kvaliteten for slag bedring ved å skille ekte funksjonell bedring eller kompensasjon 20. Her beskrives kort vi kvantitativ måling av Sprt; Men anbefales kvalitativ analyse ved hjelp av filming og scoring basert på en bilde-for-bilde-analyse for ytterligere detaljert analyse.
Teknikkene er presentert her behøver ikke være begrenset til induksjon av omskrevet capsular infarkt modellering. Teknikken kan anvendes for induksjon av en infarkt lesjon i andre områder av hvit substans, slik som corpus callosum, fremre commissures og forbindelses fibre blant nevrale strukturer. Kombinasjonen av den lille ONI og photothrombotic teknikk basert på de optiske egenskapene til hvit substans er egnet til å ødelegge den målrettede konstruksjoner med minimal skade på de nærliggende strukturer. For eksempel kan lakunære infarkter kan enkelt produsered ved å målrette de subkortikale strukturer knyttet til motor, kognitive og minnefunksjoner. Når målstrukturen er stor, kan flere innsetting av den ONI og forskjellige målretting og skråstilte baner være nødvendig for å gi den ønskede graden av lesjoner.
Det er flere begrensninger i denne teknikk. Teknikken er tilstrekkelig for å demonstrere den konsekvensen av infarkt lesioning i PLIC og etterfølgende gjenvinning. Men denne modellen ikke gjenspeiler hele spekteret av menneskelige WMS fordi photothrombotic ødeleggelse av hvit substans litt forskjellig fra menneske WMS. Følgelig kan nevrobiologiske eller MR-bilde funn viser ulike funksjoner i den tidlige fasen av photothrombotic lesioning. Derfor bør denne modellen være hensiktsmessig brukes til å handle av modellens fordeler og ulemper. Teknisk sett ikke alle operasjoner kan produsere merket og permanent motor underskudd i denne modellen fordi den krever svært nøyaktige prosedyrer. Specifically, trente og erfarne hender som kreves for å produsere høy reproduserbarhet i produksjon av denne modellen.
I konklusjonen, er en nyttig teknikk for å produsere en omskrevet kapsel infarktet modell kombinert bruk av en photothrombotic teknikk, optimalisering av lysintensiteten, og riktig målgruppe. Denne modellen vil være nyttig ikke bare å studere WMS på atferds, krets, og cellulære nivåer, men også å vurdere nytten av nye terapeutiske og rehabiliterende tiltak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Institute of Medical System Engineering (Imse) og GIST-Caltech Collaborative Fund (K04592) fra GIST og i grunn Science Research Program gjennom NRF Korea finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtidig planlegging (NRF-2013R1A2A2A01067890).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
| Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
| Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
| Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
| Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
| Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m |
|
| Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
| Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS |
|
| Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
| Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
| Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
| Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
| Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
| Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
| Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
| AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
| Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
| Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
| Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
| Hand Piece Drill | Seshin | ||
| Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
| Ketoprofen | UNIBIOTech |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2012 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 125, 2-220 (2012).
- Debette, S., Markus, H. S. The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging: systematic review and meta-analysis. Bmj. 341, 3666 (2010).
- Zhang, K., Sejnowski, T. A universal scaling law between gray matter and white matter of cerebral cortex. PNAS. 97 (10), 5621-5626 (2000).
- Kim, H. S., et al. A rat model of photothrombotic capsular infarct with a marked motor deficit: a behavioral, histologic, and microPET study. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 683-689 (2014).
- Kleim, J. A., Boychuk, J. A., Adkins, D. L. Rat models of upper extremity impairment in stroke. ILAR J. 48 (4), 374-384 (2007).
- Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat. Behav Brain Res. 169 (2), 206-211 (2006).
- He, Z., et al. Definition of the anterior choroidal artery territory in rats using intraluminal occluding technique. J Neurol Sci. 182 (1), 16-28 (2000).
- Tanaka, Y., et al. Experimental model of lacunar infarction in the gyrencephalic brain of the miniature pig: neurological assessment and histological, immunohistochemical, and physiological evaluation of dynamic corticospinal tract deformation. Stroke. 39 (1), 205-212 (2008).
- Shibata, M., Ohtani, R., Ihara, M., Tomimoto, H. White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion. Stroke. 35 (11), 2598-2603 (2004).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann Neurol. 17 (5), 497-504 (1985).
- Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40 (1), 248-253 (2009).
- Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Handbook of biomedical optics. 83, CRC Press. Boca Raton, Fl. (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Whishaw, I. Q., Whishaw, P., Gorny, B. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a movement rating scale. J Vis Exp. (18), e816 (2008).
- Jang, S. H. A review of corticospinal tract location at corona radiata and posterior limb of the internal capsule in human brain. NeuroRehabilitation. 24 (3), 279-283 (2009).
- Kim, D., et al. Longitudinal changes in resting-state brain activity in a capsular infarct model. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (1), 11-119 (2014).
- Blasi, F., Whalen, M. J., Ayata, C. Lasting pure-motor deficits after focal posterior internal capsule white-matter infarcts in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (6), 977-984 (2015).
- Metz, G. A., Antonow-Schlorke, I., Witte, O. W. Motor improvements after focal cortical ischemia in adult rats are mediated by compensatory mechanisms. Behavioural brain research. 162 (1), 71-82 (2005).
