Summary
Эта рукопись описывает технику моделирования капсулярной инфарктом. Здесь мы использовали модифицированный метод фототромботического с низкой интенсивностью света после предоперационного цель отображения. Используя эту технику, мы создали вписанного капсульный инфаркта модель с постоянной двигательными нарушениями.
Introduction
До недавнего времени "серого инсульта вещества (GMS) модели" не были использованы исключительно для понимания патофизиологии инсульта и направлять развитие новых методов лечения. Тем не менее, наблюдается увеличение распространенности инсульта , который влияет на подкорковые белого вещества у пожилых лиц, что составляет 15 - 25% всех инсультов 1,2. Многочисленные исследования были проведены в отношении инсульта с использованием модели GMS, в то время как есть несколько исследований, которые использовали белого вещества инсульт модели (WMS). Белое вещество на грызунах, существенно меньше, чем белого вещества в организме человека или приматы. Следовательно, более трудно селективно получать доступ и уничтожить целевых регионов в белом веществе 3. Кроме того, никакие эффективные инструменты не были разработаны на сегодняшний день, чтобы избирательно уничтожить запланированную степень целевого белого вещества. Таким образом, наблюдается отсутствие соответствующих моделей для изучения белого вещества штрихов.
ул животныхМодели Roke часто используются для контроля за ходом восстановления двигателя для разработки новых реабилитационных и терапевтических методов. Он идеально подходит для использования животной модели , которая демонстрирует долгосрочный неврологический дефицит , совпадающий с анатомическими изменениями в человеческом демонстрируемых инсульта 4,5. В связи с этим, быстрое восстановление дефицита моторного и широкого участия мозга следующих инфарктом lesioning не может быть реалистичным в погоне за исследования инсульта. Предыдущие модели капсульного инфаркта были сделаны окклюзии внутренней сонной артерии или передней хориоидеи артерий и диффузии эндотелина-1 (ET-1) во внутреннюю капсулу 6-9. Тем не менее, окклюзия артерии требует тщательного рассечение артерий, но он производит широкую область инфарктом поражения, в том числе внутренней капсулы, без стойких нарушений поведения. Кроме того, ET-1 не был рассеянным, чтобы полностью уничтожить заднюю конечность внутренней капсулы, и, следовательно, менее заметными или сохраняющихся Бехavioral дефицит.
Фототромботического модель миокарда широко используется для создания различных типов инфарктом поражений в коре и подкорковых структурах 10. Методика включает внутривенное введение с последующей фокальной освещения, что приводит к агрегации тромбоцитов в мелких сосудах и генерации инфарктом поражений 10. Фототромботического техника широко используется для создания GMS поражений, в то время как он редко используется для генерации WMS поражений 5,11. Для реализации этой технологии, сочетание красителя и облучения светом бенгалроза было продемонстрировано, чтобы быть полезным в разрушении структуры мишени, в результате чего соответствующие функционального дефицита. Ключевым элементом фототромботического метода является облучение светом, так как он определяет размер инфарктом поражений. Легкие облучение приводит к различным эффектам на сером веществе и белого вещества, так как рассеяние света более чем в 4 раза выше, в белом маолучатель по сравнению с серым веществом 12; Соответственно, если интенсивность света имеет достаточно низкую интенсивность излучения (<1,140 мВт / мм 2), можно ограничить расширение , к которому фототромботического поражения влияют на степень белого вещества (то есть., Внутренней капсулы). Например, свет более высокой энергии может вызывать инфаркты в сером и белом веществе, но более низкая энергия света может вызвать фототромбоза только в белом веществе. Кроме того, проникновение световой энергии было весьма ограниченным. Приблизительно 99% световой энергии было потеряно за 1 мм от источника света 13. Таким образом, ожидается, что точно ориентированы, более низкая энергия света вызывает фототромбоза только в белом веществе с минимальным вторжением соседнего серого вещества.
Здесь мы описываем новый метод для создания очагов инфаркта в области передней конечности внутренней капсулы у грызунов. Мы опишем метод идентификации области передних конечностей во внутреннем саpsule, технология светового облучения, в том числе корректировки и доставки света, и генерации поражения инфарктом. Мы также описывают поведенческие тестирование используется для оценки полноты моделирования капсульного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были проведены в соответствии с ведомственным руководящим принципам Кванджу института науки и технологии (GIST), и все процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета по GIST.
1. Предварительно lesioning шаги
- Идентификация передней конечности в зоне внутренней капсулы с использованием AAV-GFP
- Дом и обрабатывать Sprague Dawley крыс (~ 400 г, 11 - 13 недель) в соответствии с институциональными и национальными руководящими принципами.
- Стерилизовать всех хирургических инструментов и электродов с использованием соответствующего стерилизатор (паровой стерилизатор или плазма). Используйте паровой стерилизатор при 121 ° С в установке 30 мин для стерилизации и 30 мин для сухой.
- Обезболить животное смесью кетамина гидрохлорид (100 мг / кг) и ксилазина (7 мг / кг) с помощью внутримышечной инъекции. Проверьте глубину анестезии лапой щипать. Поддерживать температуру тела при температуре 37,5 ± 0,5 ° С с помощью грелки подтело животного.
- Поместите животное в стереотаксической раме с помощью панели уха и держатель рта.
- Вымыть и продезинфицировать хирургический участок с 70% -ным спиртом и раствором повидон йода. Проникнуть 2% лидокаина гидрохлорида под кожу головы в зоне предполагаемого черепа надрез, чтобы уменьшить интраоперационную боль.
- Применяют ветеринара глазной мази, чтобы предотвратить высыхание глаз. Поместите стерильную драпировка над животным до оперативных участков. Поддерживать все процедуры в стерильных условиях.
- Выполнение средней линии черепа разрез 2 см с помощью скальпеля и втягивания кожи на двусторонней основе с проволокой преднатяжителями. Сушат череп с ватным тампоном и 30% перекиси водорода.
- Сделайте отверстие, используя наконечник сверло над областью передней конечности моторной коры (AP: +2,5 от темени, ML: ± 2,5 от средней линии) и очистить тракт с микро-currette для вируса-инъекции.
- Разморозить AAV-GFP (2 × 10 12 молекул вируса / мл) на льду и нагрузки 1 мклВирус в 10 мкл шприца. Поместите шприц на стереотаксической рамы.
- Переместить иглу в предварительно сделанной отверстие и опустить глубоко в твердую мозговую оболочку иглы 1 мм.
- Вводят вирус медленно (0,1 мкл / мин) с использованием высокой точности предлагаемого микронасоса и оставить иглу на месте в течение еще 10 мин, чтобы дать вирусу диффундировать.
- После очистки оперативный участок с засоленной водой, обеспечить рану 3-0 нейлоновым швом; освободить крысу от стереотаксической рамы и передать его в камере регенерации. Администрирование кетопрофен (2 мг / кг) с помощью внутримышечной инъекции для послеоперационного контроля боли.
- Поддержание температуры тела (37 ° С) с грелку и администрировать антибиотики Cephems класса второго поколения (0,1%, 1 мл) с помощью внутримышечной инъекции и 2% лидокаина гидрохлорида через подкожную инъекцию в случае необходимости. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточного для поддержаниягрудины лежачее. Одноместный дом животное до полного выздоровления.
- После 2 - 3 недели восстановления, глубоко обезболить крыса с передозировкой гидрохлорида кетамина (300 мг / кг) с помощью внутримышечной инъекции в капюшоне. Подтвердить смерть животного отсутствием пальца щипать реакции, пульса и дыхания. Поместите лежачем крысы в капюшоне.
- Откройте брюшную полость через 'у'-образный разрез, чтобы открыть грудной полости. Плотно зажать нисходящей аорты с кровоостанавливающего и разрыв правое предсердие сердца крысы для дренажа крови. Инициирование перфузию в левый желудочек сердца с холодным 1% параформальдегидом в течение 5 мин (10 мл / мин), а затем 4% параформальдегидом в течение 30 мин (10 мл / мин).
- Снимите головку крысы из каркаса с помощью пары ножниц. Сделайте срединный разрез от шеи до носа и снять мышцы шеи с помощью ножниц или костными кусачками так, что череп подвергается. Осторожно рассекают кости черепа и Дюрас из головного мозга.
- Извлечь мозг и поместить головного мозга крыс в коническую пробирку емкостью 50 мл, заполненную 4% параформальдегид в течение ночи. На следующий день, мыть мозг с 1X PBS 3 раза и поместите его в 30% растворе сахарозы.
- После того, как мозг полностью опускается на дно 30% раствора сахарозы, поместить мозг в cryomold с ОКТ соединением при температуре от -20 & deg; С в замораживающий микротом. Нарезать мозг в корональной плоскости с толщиной 40 мкм и с интервалом 200 мкм.
- Выполните GFP иммуногистохимии окрашивания с использованием метода 14 слайдов. Применение первичных антител (1: 200 Анти-зеленого флуоресцентного белка, кролика IgG-фракции) в срезах мозга в течение ночи при температуре 4 ° С. На 2 - й день, моют с 1% фосфатно - солевом буферном с твин-20 раствором (PBST) 3 раза и применять вторичные антитела (1: 500 из козьих антител против кроличьего IgG (H + L)) в течение 1 часа. Промыть слайд с 1% PBST 3 раза. Поместите крышку стекла на срез мозга.
- С помощью флуоресцентного микроскопа (длина волны возбуждения470 нм, длина волны излучения 525 нм, увеличение 5X), наблюдать за AAV-GFP трансдуцированных аксоны во внутренней капсуле. Сравните расположение трансдуцированных аксонов с головной мозг крыс Atlas 15 для определения стереотаксической координаты преобразованных аксонов
- Pre-lesioning Регулировка интенсивности света Подходит для капсульного моделирования инфаркта
- Строительство оптического интерфейса Neural
- Отрежьте соответствующую длину (4 см) 27 калибра спинальной иглы с стилет внутрь используя режущую дрель.
Примечание: Резка может сжимать и сокрушить спинной кончик иглы; удалите стилет и отполировать спинной кончик иглы для удаления измельченную часть спинного иглы и поддерживать внутренний калибр спинного иглы. - Полоса соответствующую длину (10 см) куртки оптического волокна (125 мкм с ядром 62,5 мкм) с одной стороны соединительного шнура.
- Вставьте unjacked оптический FiBER в металлическую трубку (внешний диаметр: 3,8 мм, внутренний диаметр: 3,3 мм, длина: 17 мм), который затем зажимается вокруг волокна. Металлическая трубка полезно, чтобы заполнить пространство между оптическим волокном и ступицей спинного иглы. Зажать нижний 1/2 металлической трубки с прижимным устройством дважды.
- Нанести тепловым отверждением эпоксидной смолы на оптическое волокно, и вставить оптическое волокно в спинномозговой иглы. Нанесите дополнительный эпоксидную смолу на пустое место в ступице. Отверждения эпоксидной в течение 20 мин при 100 ° С для устойчивой фиксации.
- Сколите оптическое волокно, которое выступает из спинного иглы и полировать оптическое волокно на кончике спинного иглы с использованием алмазного доводочные (полировка) листов.
- Присоедините разъем FC / PC часть коммутационного шнура к ответвитель зеленой лазерной системы и измерения интенсивности света от кончика оптического волокна с использованием цифровой оптической мощности и счетчика энергии.
- Отрежьте соответствующую длину (4 см) 27 калибра спинальной иглы с стилет внутрь используя режущую дрель.
- Строительство оптического интерфейса Neural
2. PhotothromBotič Инфаркт Lesioning во внутренней капсуле
- Стерилизовать всех хирургических инструментов и электродов с использованием соответствующего стерилизатор (паровой стерилизатор или плазма). Используйте паровой стерилизатор при 121 ° С в установке 30 мин для стерилизации и 30 мин для сухой.
- Обезболить животное (~ 400 г, 11 - 13 недель) со смесью гидрохлорида кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (7 мг / кг) через внутримышечные инъекции. Проверьте глубину анестезии лапой щипать. Поддерживать температуру тела при температуре 37,5 ± 0,5 ° С с помощью грелки под тела животного.
- Поместите животное в стереотаксической раме с помощью панели уха и держатель рта.
- Вымыть и продезинфицировать хирургический участок с 70% -ным спиртом и раствором повидон йода. Проникнуть 2% лидокаина гидрохлорида под кожу головы в зоне предполагаемого черепа надрез, чтобы уменьшить интраоперационную боль. Применяют ветеринара глазной мази, чтобы предотвратить высыхание глаз.
- Нанесите стерильную драпировка над апIMAL и разоблачить оперативные сайты. Поддерживать все процедуры в стерильных условиях.
- Выполнение средней линии черепа разрез 2 см и убрать кожу на двусторонней основе с проволокой преднатяжителями. Сушат череп с хлопковых свопы и перекиси водорода.
- Высоту зажима носа до темени и лямбда не выровнены на том же уровне. Важным шагом: Это выравнивание очень важно правильно подойти к более глубокую, например, при выполнении поражения инфарктом в внутренней капсулы в основном эксперименте.
- Сделайте отверстие (диаметр: 2 мм; AP: -2.04 от темени; ML: ± 3,0 от средней линии), используя дрель, чтобы побудить фототромбоза.
- Польский и очистить оптический наконечник волокна оптического интерфейса. Закрепить ONI к стереотаксической рамы без изгиба. Проверьте кончик НПУ и уничтожить его ясно перед и после вставки оптического интерфейса.
- Измеряют интенсивность лазерного излучения от кончика оптического волокна до введения Opticaл интерфейс к целевому участку головного мозга крысы. Регулировка интенсивности лазерного до 3,5 мВт, что подтверждается шагами перед операцией, на конце оптического волокна.
- Вставьте НПУ в целевой области внутренней капсулы (-7.8 мм подтверждено из стадии предварительной операции) через просверленное отверстие.
- Поддерживать температуру тела при температуре 37,5 ± 0,5 ° C в течение фототромбоза. Более низкая температура тела может не дать ожидаемого степени инфаркта. Вводят бенгалроза (2 мл / кг) через хвостовую вену.
- Включите 532 нм зеленый лазер в течение 90 сек 1 мин после инъекции бенгалроза. После облучения, осторожно удалите ONI из головного мозга. После очистки операционного участка, обеспечить рану обеспечить рану 3-0 нейлоновой нити; освободить крысу от стереотаксической рамы и передать его в камере регенерации.
- Для ложнооперированными группы (ГСК), выполняют идентичную процедуру поражения решений, для инъекции физиологического раствора (0,2 мл / 100 г) вместо Rose-Bengal за исключением того.
- Поддержание температуры тела (37 ° С) с грелку после операции и администрировать антибиотики (второго поколения цефалоспорин, 0,1%, 1 мл) с помощью внутримышечной инъекции. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Не возвращайте послеоперационные животных в клетке, занятой другими животными, пока полностью не выздоровел.
Примечание: Предварительный эксперимент проводили в тех же процедур, чтобы найти оптимальную интенсивность света от 1 мВт до 5 мВт и процедура может потребоваться для получения удовлетворительной степени поражения в различных условиях.
3. Оценка капсульного Lesioning инфаркта
- Поведенческий тест и группирование животных
- Выполнение одной гранулы , достигающего задачи , как описано Уайшав и др. 14 , чтобы оценить моторный дефицит передней лапы каждый день в течение 1 недели после того, как при моделировании инсульта. Выполните одну таблетку, достигающего задачу(ЭПТС) в пищевых ограничено животных (90% от контрольной массы тела) с помощью прозрачного плексигласа (30 х 15 х 35 см высота) с шириной 1 см и щелью пищевой полке в передней части средней части передней стенки.
- Поместите шарик на пищевой полке наклонно контралатеральной с предпочтительным передних конечностей. Администрирование 20 таблеток на каждую сессию в течение 3-х недель.
Примечание: Успешное количество SPRTs определяется как рядом, в котором животное схватывает шарик пищи и помещает его в рот, не уронить. - Рассчитывают счет как процент от успешных течении, которое определяется по следующей формуле:
Примечание: Мы делим животных на 3 группы: ложнооперированными группа (СОГ), умеренное восстановление группы (МРГ), и бедные группы восстановления (PRG). Если оценка ЭПТС после инсульта> 50%, мы классифицируем крыс как MRG, что указывает на наличие значительного поражения, но не полное разрушение таrget. Если после инсульта оценка ЭПТС составляет <50% по сравнению с предтактового счетом ЭПТС, мы классифицируем группу в качестве PRG, что указывает на полную lesioning в мишени.
- Neurohistological Подтверждение инфаркта Lesioning
- Выполнение сердечной перфузии 4% параформальдегида, как описано ранее. После того, как мозг полностью погружается в 30% растворе сахарозы, выполняют корональной секционирования при толщине 10 мкм и с интервалом 200 мкм с использованием микротома или замораживающий микротом 4.
- Пятно с H & E, Нисслю, Luxol быстрой сине-PAS, нейрофиламентов белок-L или глиальных белок фибриллярный кислоты окрашивания и наблюдать гистологические результаты для определения оптимальной интенсивности света, который может охватить всю ширину внутренней капсулы в целевой области для наблюдения окрашивания 4,17.
- С помощью программного обеспечения ImageJ, измеряют объем фототромботического площади инфаркта внутренней капсулы на слайдах мозга.
- Для измерения объема зоны инфаркта, запустите программное обеспечение 'ImageJ'. Чтобы открыть файлы для штабелирования, выберите 'Изображение в стеки' ( 'Image' → 'стеки' → 'Изображения для стеков'). имя файла Edit и выберите "Установить Scale '(' Analyze '→' установить масштаб ') для редактирования масштаба.
- В разделе "Плагины", выберите "Мера стеки ', чтобы вычислить объем или площадь изображения. Вставьте расстояние интервал 2 изображения в "Кусочек Spacing". Сделайте чертеж ROI (область интереса) всех изображений и нажмите 'Measure'.
Примечание: Программное обеспечение 'ImageJ' автоматически вычисляет площадь и объем каждого изображения и общий объем их.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод, представленный здесь, предназначен для создания очерченной капсульный миокарда с постоянным двигательным дефицитом. Следовательно, крайне важно, чтобы правильно определить цели в пределах внутренней капсулы на стадии предварительной операции. Somatotopic отображение пирамидальных волокон во внутренней капсуле не решен до сих пор. Для того, чтобы правильно определить цели в пределах внутренней капсулы, область передней конечности должны быть разграничены. Инъекции AAV-GFP в области передних конечностей моторной коры можно проследить аксоны пирамидных волокон во внутренней капсуле (рисунок 1). Другие нейронные трейсеры, такие как биотинилированного декстрана амина (BDA), могут быть использованы для того же самого цель. Стереотаксической координаты цели в пределах внутренней капсулы могут быть выяснены путем отслеживания аксонов проекций, которые исходят из области передних конечностей моторной коры к внутренней капсуле.
Рисунок 1. Идентификация передней конечности в зоне внутренней капсулы 2 недель после инъекции AAV-GFP. GFP-трансдуцированных аксонов волокон , которые произошли из области передних конечностей моторной коры показаны в вентролатеральной ядре таламуса (стрелки) и каудальной части внутренней капсулы (стрелки). Пунктирная линия показывает контур внутренней капсулы, а также номера относятся к расстояниям от темени. Бегемот, гиппокамп; Cpu, хвостатых скорлупа; В.Л., вентролатеральный ядро; IC, внутренняя капсула. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Интенсивность Оптимальный свет может быть различной в зависимости от штамма и массы тела животного, так и типов и диаметров оптических волокон. Таким образом, оптимальная интенсивность света должна быть определена отдельно перед основным инфарктом lesioning эксперимента. Используя фототромботического процедуру, интенсивность света может быть постепенно увеличена до степень поражения охватывает всю ширину внутренней капсулы , не разрушая соседние серое вещество структуры (рисунок 2). Оптимальная интенсивность света может быть подтверждена путем сравнения гистологическую степень при инфаркте поражения и местах.
Рисунок 2. Степень Инфаркт поражениями Через различной интенсивности лазерного излучения от 2 мВт до 5 мВт 2 недели после фототромботического Lesioning. Интенсивность Оптимальный свет считается от 3 мВт до 4 мВт в этой экспериментальной установке. Стрелки указывают на поражение инфаркта./53281/53281fig2large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Мы предпочитаем использовать НПУ, в котором оптическое волокно, содержащееся в тонкой металлической трубки (спинальной иглы). Оптическое волокно может производить минимальное рассеивание света со стороны волокна, что, вероятно, создаст дополнительные нервные заболевания по световоду кишечного тракта. Encasement оптического волокна также является преимуществом для предотвращения изгиба оптического волокна в более глубоких целей, а также для крепления ONI к стереотаксической рамы (рисунок 3).
Рисунок 3. Построение оптико-нейронных интерфейса (ONI). (А) Валка спинного иглы. (Б) Вскрытие оптического волокна. (С & d) анкерного металлическая трубка вставлена поверхраздели оптическое волокно и стесненными, чтобы обеспечить оптическое волокно со ступицей спинного иглы. (Е) эпоксидного добавил оптическое волокно вставляется в спинномозговой иглы. (Е) Эпоксидная отверждается при температуре 100 ° С в течение 20 мин. (Г) Оптическое волокно расщепляется на кончике спинного иглы. (Ч) Оптическое волокно шлифуют. (я) Интенсивность света измеряется от кончика оптического волокна. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фототромботического процедура будет производить воспроизводимые повреждения и местоположения с ~ 70% успеха в двигательных нарушений. Типичное поражение капсульного инфаркте охватывает аспекты капсульных в направлении от живота к спине волокон (рис 4а). Кроме того, поражение миокарда проходит вдоль передне - задней оси внутренней капсулы из - за увеличения рассеяния света внутри капсульного волокна. (4В) Оптический тракт расположен ниже внутренней капсулы состоит из белого вещества волокон; Таким образом, она часто повреждается при облучении повышенной интенсивности света. Серийные срезы и окрашивание необходимы, чтобы подтвердить весь объем и масштабы инфаркта. Объем инфаркта был 0,63 ± 0,37 мм 3. Для того, чтобы оценить разрушение капсульного волокна, нейрофиламентов и Luxol быстро сине-PAS пятна полезны.
Рисунок 4. Внешний вид Микроскопический Капсулярная инфарктом через 3 недели после фототромбоза. Микроскопический появление капсульной инфарктом через 3 недели после фототромбоза. А) мозга срез корональных секции в головном мозге крыс. Эрроухед указывают тракта иглы, содержащего оптическое волокно в таламуса и до внутренней капсулы. B) Последовательный Нисслю окрашивание корональной срезов мозга showi нг всю степень поражения инфарктом во внутренней капсуле. Наконечники указывают на поражение зоны инфаркта. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Успех моделирования можно оценить с помощью поведенческим тестированием с использованием одной гранулы идущей задачи. Поведенческие показатели через 1 неделю после инфаркта lesioning является хорошим ориентиром для подтверждения точного lesioning, которая сопутствует стойкое и значительное ухудшение ЭПТС несмотря на ежедневные одной гранулы , достигающего обучения (рисунок 5). После того , как дефицит двигателя показан в PRG, неврологический дефицит сохраняется в течение 3-месячного периода наблюдения. Ложнооперированными группа не показала значительное снижение производительности ЭПТС после операции.
загрузить / 53281 / 53281fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Изменения в одной гранулы Достижение счеты после капсульного Infart 4,20. Экспериментальные группы (PRG и MRG) показали значительно уменьшились сразу после того, как баллы инфаркт- lesioning по сравнению с ложнооперированными группой (SOG). MRG демонстрирует постепенное восстановление ЭПТС спектаклей, в то время как PRG демонстрирует ухудшение упорную двигателя в течение долгого времени. Оп, фототромботического инфаркте lesioning; PRG, бедная группа восстановления; MRG, умеренная группа восстановления. Статистическая значимость была определена с использованием повторного анализа измерения дисперсий. + SOG по сравнению с ГПМ; * SOG по сравнению с PRG. Данные средства ± СКО. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модель инфаркте капсульного представленная здесь демонстрирует целенаправленную поражения с выраженным и стойким нарушением двигательной функции в передней конечности. Предыдущие модели подкорковых инсульта капсульного показали недостаточную степень двигательных нарушений и быстрого 6,8,9 процесса восстановления. В этом смысле, эта модель напоминает клинические случаи капсульный инфаркта, которые проявляют долгосрочное функциональное нарушение.
Наиболее важные шаги в разработке вписанной модели капсульного инфарктом являются: 1), чтобы правильно определить somatotopic представление части тела, предназначенного для отключения функции внутри внутренней капсулы; 2) для определения оптимальной интенсивности зеленого лазера, который может разрушить всю ширину внутренней капсулы с минимальным вторжением соседних структур серого вещества; и 3), чтобы точно поместить оптическое волокно в конечной структуре. Хотя представленные методы могут вызвать окружатьd капсульного модель инфаркта с высокой скоростью репликации (> 70%), небольшие различия в адресности и степени полноты разрушения, охватывающих всю ширину внутренней капсулы может учитывать различные дефициты двигателя.
Кортикоспинальных тракт расположен в передней половине задней конечности во внутренней капсуле в организме человека , несмотря на противоречивость somatotopic организации 15. В противоположность этому, не было никакого эквивалента классификации или подробное выяснение somatotopic организации внутренней капсулы у грызунов. Отсутствие знаний о somatotopic организации часто приводит к ошибочным целям инфаркта lesioning в пределах внутренней капсулы с различными результатами моторных среди моделей капсульного инфарктом. Тем не менее, мы определили GFP-трансдуцированных аксоны в каудальной части внутренней капсулы, которые, вероятно, представляют путь передних конечностей моторных волокон. Кроме того, lesioning этой области demonstratэд выраженный и стойкий дефицит достигает мастерства передних конечностей. Поэтому мы рекомендуем хвостовую часть внутренней капсулы для стереотаксической lesioning для повышения достоверности модели капсульного инфарктом.
Предварительная регулировка интенсивности света является обязательным для получения однородной степени инфарктом поражения в моделях инсульта, так как штамм животного, вес тела, источник света и типы НПУ может генерировать различные размеры инфаркта. Таким образом, предварительные эксперименты с использованием различных интенсивностей света в экспериментальных животных с тем же штаммом, и массы тела следует проводить до тех пор, удовлетворительное поражение миокарда не достигается при минимальной интенсивности света.
Сильная интенсивность света, который может разрушить всю ширину капсульного волокна (передне-задней и дорсовентральный степени), что соответствует площади передних конечностей с минимальным повреждением соседних структур считается оптимальной интенсивности света. forelimб площадь внутренней капсулы ограничена таламуса главно и зрительного тракта книзу. Таким образом, глубина введения ONI должна быть точной, чтобы уничтожить всю степень IC в дорсовентральной направлении, с одновременным сохранением верхнего и нижнего смежных структур. Неточное размещение НПУ приводит к неполному разрушению ИС, что приводит к быстрому восстановлению дефицита двигателя в результате синаптической пластичности остальных пирамидных волокон во внутренней капсуле. В серийных гистологического исследования, наиболее обескураживающий фактор в индукции постоянного дефицита моторного было неправильное позиционирование НПУ, что приводит к неспособности уничтожить всю ширину 4,16 ПЛИС. Поэтому особое внимание следует уделить, чтобы достичь правильной цели. В последнее время , Бласи и др. Сообщили , что устойчивый дефицит чистого двигателя может быть получен путем , сделав повреждение инфарктом в задней внутренней капсулыиспользуя эндотелина-1 (ET-1) 17. Тем не менее, ЕТ-1 может уничтожить соседнее серой структуры вещества диффузией ЕТ-1.
Поведенческий тест является непосредственно доступны тест в лаборатории, чтобы оценить образование инфарктом поражения во внутренней капсуле. Тем не менее, оценка двигательной активности через одну неделю после инфаркта lesioning рекомендуется разделить животных в умеренных и бедных групп по восстановлению. Умеренное восстановление было определено как увеличение производительности по счет> 50% по сравнению со счетом до lesioning, в то время как бедные восстановления был определен как восстановление <50%. Среди моторных передней конечности поведенческие тесты, единственный гранула достижение задачи является одним из наиболее чувствительных тестов на качественных и количественных измерений хода индуцированных двигательных характеристик 14. Задача количественно измеряет достижение успеха, одновременно обеспечивая анализ использования передних конечностей, например, захватывая и извлечение пищигранул. Качественный анализ , достигающего движения также полезно дифференцировать качество восстановления инсульта путем различения подлинного функционального восстановления или компенсации 20. Здесь мы кратко описали количественное измерение ЭПТС; Однако качественный анализ с использованием кино- и количественной оценки на основе анализа кадр за кадром рекомендуется для дальнейшего детального анализа.
Методы, представленные здесь, не обязательно должен ограничиваться индукцию вписанной моделирования капсульный с инфарктом. Методика может быть применена к индукции инфарктом поражения в других областях белого вещества, такие как мозолистого, передней спайки и соединительных волокон между нейронными структурами. Сочетание крошечного ДВР и фототромботического техники, основанной на оптических свойствах белого вещества может разрушить целевые структуры с минимальным повреждением соседних структур. Например, лакунарные инфаркты можно легко производитьd путем охвата подкорковые структуры, связанные с функциями двигателя, когнитивных и памяти. Когда целевая структура велика, множественные инсерции НПУ и различных нацеливания и угловыми траекторий может потребоваться для получения желаемой степени поражений.
Есть несколько ограничений в этой технике. Методика достаточно, чтобы продемонстрировать последствия инфаркта lesioning в ПЛИС и последующего восстановления. Тем не менее, эта модель не отражает полный спектр человеческих ЗЦМ, потому что фототромботического разрушение белого вещества незначительно отличается от человека ЗЦМ. Следовательно, нейробиологические или МРТ визуализации могут иметь различные особенности в ранней стадии фототромботического lesioning. Таким образом, эта модель должна быть соответствующим образом использован компромисс преимущества и недостатки модели. С технической точки зрения не все операции могут производить заметное и постоянный дефицит двигателя в этой модели, поскольку она требует очень точных процедур. Specifically, обученные и опытные руки необходимы для получения высокой воспроизводимости в поколения этой модели.
В заключение отметим, что комбинированное применение фототромботического техники, оптимизации интенсивности света и правильного таргетирования является полезным методом для получения очерченной модели капсульного инфаркта. Эта модель будет полезна не только для изучения WMS на поведенческом, цепи, и клеточном уровнях, но и оценить полезность новых терапевтических и реабилитационных мероприятий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Института медицинской системотехники (Imse) и GIST-Caltech Collaborative фонда (K04592) из GIST и Программой развития фундаментальной науки исследований на основе СИФ Корея, финансируемого Министерством науки, ИКТ и будущего планирования (СРН-2013R1A2A2A01067890).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
| Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
| Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
| Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
| Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
| Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m |
|
| Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
| Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS |
|
| Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
| Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
| Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
| Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
| Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
| Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
| Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
| AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
| Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
| Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
| Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
| Hand Piece Drill | Seshin | ||
| Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
| Ketoprofen | UNIBIOTech |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2012 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 125, 2-220 (2012).
- Debette, S., Markus, H. S. The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging: systematic review and meta-analysis. Bmj. 341, 3666 (2010).
- Zhang, K., Sejnowski, T. A universal scaling law between gray matter and white matter of cerebral cortex. PNAS. 97 (10), 5621-5626 (2000).
- Kim, H. S., et al. A rat model of photothrombotic capsular infarct with a marked motor deficit: a behavioral, histologic, and microPET study. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 683-689 (2014).
- Kleim, J. A., Boychuk, J. A., Adkins, D. L. Rat models of upper extremity impairment in stroke. ILAR J. 48 (4), 374-384 (2007).
- Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat. Behav Brain Res. 169 (2), 206-211 (2006).
- He, Z., et al. Definition of the anterior choroidal artery territory in rats using intraluminal occluding technique. J Neurol Sci. 182 (1), 16-28 (2000).
- Tanaka, Y., et al. Experimental model of lacunar infarction in the gyrencephalic brain of the miniature pig: neurological assessment and histological, immunohistochemical, and physiological evaluation of dynamic corticospinal tract deformation. Stroke. 39 (1), 205-212 (2008).
- Shibata, M., Ohtani, R., Ihara, M., Tomimoto, H. White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion. Stroke. 35 (11), 2598-2603 (2004).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann Neurol. 17 (5), 497-504 (1985).
- Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40 (1), 248-253 (2009).
- Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Handbook of biomedical optics. 83, CRC Press. Boca Raton, Fl. (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Whishaw, I. Q., Whishaw, P., Gorny, B. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a movement rating scale. J Vis Exp. (18), e816 (2008).
- Jang, S. H. A review of corticospinal tract location at corona radiata and posterior limb of the internal capsule in human brain. NeuroRehabilitation. 24 (3), 279-283 (2009).
- Kim, D., et al. Longitudinal changes in resting-state brain activity in a capsular infarct model. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (1), 11-119 (2014).
- Blasi, F., Whalen, M. J., Ayata, C. Lasting pure-motor deficits after focal posterior internal capsule white-matter infarcts in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (6), 977-984 (2015).
- Metz, G. A., Antonow-Schlorke, I., Witte, O. W. Motor improvements after focal cortical ischemia in adult rats are mediated by compensatory mechanisms. Behavioural brain research. 162 (1), 71-82 (2005).
