Summary
Bu el yazması kapsül enfarktüs bir modelleme tekniği anlatılmaktadır. Burada ön ameliyat hedef haritalama sonra ışık düşük yoğunluğu ile modifiye Fototrombotik tekniği kullanılmıştır. Bu tekniği kullanarak, biz kalıcı motorlu bozukluğu olan bir sınırlı kapsül infarkt modeli yarattı.
Introduction
Yakın zamana kadar, "gri madde inme (GMS) modeller" münhasıran inme patofizyolojisi anlamak ve yeni tedavilerin geliştirilmesine rehberlik etmek için kullanılmıştır. Tüm inmelerin 1,2% 25'ini - Ancak, 15 oluşturan yaşlı bireylerde, subkortikal beyaz cevher etkileyen inme giderek artan yaygınlık olmuştur. Çeşitli çalışmalar beyaz cevher inme (WMS) modelleri kullandık az sayıda çalışma vardır oysa GMS modellerini kullanarak ilgili inme yapılmıştır. kemirgenlerde beyaz cevher insan veya primatlarda beyaz cevher daha azdır. Sonuç olarak, seçici bir şekilde beyaz bir madde 3 hedef bölge ulaşmak ve yok etmek için daha zordur. Ayrıca, hiçbir etkin araçları seçici hedeflenen beyaz cevher planlanan ölçüde yok etmek için bugüne kadar geliştirilmiştir. Bu nedenle, beyaz madde vuruş çalışma için uygun modellerin eksikliği vardır.
hayvan stRoke modelleri genellikle yeni iyileştirici ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi için motor iyileşme ilerlemesini izlemek için kullanılır. İnsan inme 4,5 gösterdiği anatomik değişiklikler ile uyumlu uzun vadeli nörolojik açığı sergileyen bir hayvan modeli kullanmak için idealdir. Bu bağlamda, motorlu açığı ve beyin aşağıdaki enfarktüs lezyon geniş katılımı hızlı iyileşme inme araştırma peşinde gerçekçi olmayabilir. Önceki kapsül infarkt modelleri internal kapsül 6-9 içine endotelin-1 (ET-1) internal karotid veya anterior koroidal arterler ve difüzyon tıkanması ile yapılmıştır. Bununla birlikte, arter tıkanıklığı arterlerin dikkatli diseksiyon gerektirir, ancak kalıcı davranış açıkları olmadan, internal kapsül dahil enfarktüs lezyonun geniş bir alanı üretir. Ayrıca, ET-1 tamamen internal kapsül posterior bacağı yok etmek dağınık ve dolayısıyla daha az belirgin veya beh kalıcı değildiavioral açığı.
Bir Fototrombotik enfarktüs modeli genel olarak korteks infarkt lezyonlarında ve subkortikal yapılar 10 çeşitli oluşturmak için kullanılmıştır. Teknik enfarktüs lezyonlar 10 trombosit küçük damarlarda toplama ve oluşumuna yol açan odak aydınlatma, ardından intravenöz uygulamayı içermektedir. Nadiren WMS lezyonlar 5,11 oluşturmak için kullanılır olmuştur oysa FOTOTROMBOTİK teknik yaygın, GMS lezyonlar oluşturmak için kullanılır olmuştur. Bu teknik için, Rose Bengal, boya ve hafif ışınlama bir kombinasyonu işlev bozukluklarını mukabil yol hedef yapının yok yararlı olduğu gösterilmiştir. o enfarktüs lezyonların boyutunu belirler çünkü Fototrombotik tekniğin kilit unsur, ışık ışınlama olduğunu. gri madde ve beyaz madde üzerinde farklı etkileri ışık ışınlama sonuçları, ışık saçılması beyaz ma fazla 4 kat daha fazladır çünkügri madde 12 ile karşılaştırıldığında tter; Işık yoğunluğu, yeterince düşük bir ışık etkisi (<1.140 mW / mm2) Buna göre, eğer bir Fototrombotik lezyondan beyaz bir madde ölçüde etkilediği olan uzatma sınırı (yani. Iç kapsül). Örneğin, yüksek enerji ışık hem gri hem de beyaz cevher infarktları uyarabilir, henüz düşük enerji ışığı sadece beyaz cevher Fototromboz neden olabilir. Bundan başka, ışık enerjisi penetrasyon çok sınırlıydı. Işık enerjisinin yaklaşık% 99 ışık 13 kaynağından 1 mm ötesinde kayboldu. Bu nedenle, doğru hedef olması beklenmektedir, düşük enerji ışık sadece komşu gri cevher az tecavüz beyaz cevherde Fototromboz neden olur.
Burada, kemirgenler, iç kapsülün ön ayakları alanında infarkt lezyonlar oluşturmak için yeni bir metot açıklamaktadır. Biz iç ca ön ayakları alanının belirlenmesi yöntemi tarifpsule, uyum ve ışık teslimat ve bir enfarktüs lezyonun nesil de dahil olmak üzere ışık ışınlama, teknoloji. Biz de kapsül modelleme tamlığını değerlendirmek için kullanılan davranışsal test açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm işlemler Bilim ve Teknoloji (GIST) Gwangju Enstitüsü kurumsal kurallarına göre yapılmıştır ve tüm işlemler GIST Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.
1. Ön lezyon Adımlar
- İç Kapsül içinde ön ayakları Alan tanımlanması AAV-GFP kullanarak
- kurumsal ve ulusal kurallara uygun olarak - (13 hafta ~ 400 gr, 11) Ev Sprague Dawley sıçanları işlemek ve.
- Uygun bir sterilizatör (Buhar veya Plazma sterilizatör) kullanarak tüm cerrahi aletleri ve elektrotları sterilize edin. Sterilizasyon, 30 dakika, kuru 30 dakika ayarı olarak 121 ° C 'de buharlı sterilizatör kullanımı.
- kas içi enjeksiyon yoluyla ketamin hidroklorür (100 mg / kg) ve ksilazin (7 mg / kg) karışımı ile hayvan anestezisi. pençe sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin. Bir ısıtma pedi altında aracılığıyla 37.5 ± 0.5 ° C vücut ısısını korumakhayvanın vücut.
- bir kulak çubuğu ve ağız tutucu kullanarak bir stereotaktik çerçeve içinde hayvan yerleştirin.
- Temiz ve% 70 alkol ve povidon iyot çözeltisi ile cerrahi siteyi dezenfekte edin. intraoperatif ağrıyı azaltmak amacıyla kafatası kesi bölgesinde kafa derisi altında% 2 lidokain hidroklorür Infiltrate.
- gözlerin kurumasını önlemek için veteriner oftalmik merhem sürün. operatif sitelere hayvan üzerinde bir steril örtüyü yerleştirin. Steril şartlarda tüm işlemleri koruyun.
- Bir neşter kullanılarak 2 cm'lik bir orta hat kafatası kesi gerçekleştirmek ve tel Toplayıcılı bilateral cilt geri çekin. pamuklu ve% 30 hidrojen peroksit ile kafatası kurulayın.
- motor korteksin ön ayakları alanı üzerinde bir el parça matkap kullanarak bir delik açın ve virüs enjeksiyon mikro currette ile yolu temizlemek (AP: +2.5 bregmadan, ML orta hattan 2.5 ±).
- Buz ve yük 1 ul üzerinde AAV-GFP (2 x 10 12 virüs molekülleri / ml) Çözülme10 ul şırınga virüs. stereotaktik çerçeve üzerinde şırınga yerleştirin.
- önceden yapılmış delik iğne taşımak ve dura derinliklerine iğne 1 mm indirin.
- virüs yavaş (0.1 ul / dakika) yüksek hassasiyetli mikropompayı kullanılarak enjekte edilir ve virüsün yayılmasına izin vermek için 10 dakika daha iğneyi yerinde bırakın.
- tuzlu sulama ile ameliyat yerinin temizlendikten sonra, 3-0 naylon sütür ile yara sabitleyin; stereotaktik çerçeveden sıçan bırakın ve bir kurtarma odasına transfer. Ameliyat sonrası ağrı kontrolü için kas içi enjeksiyon yoluyla ketoprofen (2 mg / kg) uygulayınız.
- ısıtma pedi ile vücut sıcaklığına (37 ° C) muhafaza etmek ve gerekirse deri altına enjeksiyon yoluyla bir intramüsküler enjeksiyon ve% 2 lidokain hidroklorid ile (% 0.1, 1 mi), ikinci jenerasyon cephems sınıf antibiyotiği. onu korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayınsternum yatma. Tek bir ev tam iyileşme kadar hayvan.
- 2 aşağıdakı - 3 haftalık iyileşme, derin kaputu kas içi enjeksiyon yoluyla ketamin hidroklorür (300 mg / kg) aşırı dozda sıçan anestezisi. ayak kısma yanıt, nabız ve solunum yetersizliği hayvanın ölümüne onaylayın. kaputu sıçan sırtüstü yerleştirin.
- göğüs boşluğunu açmak için bir 'Y'şeklinde kesi yoluyla karın boşluğuna açın. Sıkıca bir hemostatla inen aorta kelepçe ve kan drenajı için sıçan kalbin sağ atrium rüptürü. 30 dakika (10 ml / dakika)% 4 paraformaldehid, ardından 5 dakika (10 ml / dak) soğuk% 1 paraformaldehit ile kalbin sol ventrikül içine perfüzyon başlatın.
- bir makas kullanarak karkas sıçan kafasını çıkarın. burun boyun orta hat kesi yapmak ve kafatası maruz böylece makas veya rongeur kullanarak boyun kasları kaldırın. Yavaşça beyin kafatası kemikleri ve Duras teşrih.
- beyin ekstresi ve gece boyunca% 4 paraformaldehit ile dolu bir 50 ml'lik konik bir tüp içinde, sıçan beyin yerleştirin. Ertesi gün, 1 x PBS ile 3 kez beyin yıkama ve% 30 sukroz çözeltisi içine koyun.
- Beyin tamamen% 30 sukroz çözeltisi dibine batar sonra kriyotom -20 ° C'de OCT bileşiği ile cryomold beyin yerleştirin. 40 um kalınlığa ve 200 um arasında bir aralıkta koronal düzlemde beyin dilim.
- Slayt yöntemi 14 kullanarak GFP immünohistokimyasal boyama yapın. Birincil antikor uygulayın (1: Anti-Yeşil Floresan Protein, tavşan IgG fraksiyonu 200), beyin dilimlerine gece boyunca 4 ° C 'de. 2. günde, Tween-20 (PBST) çözeltisi ile% 1 Fosfat 3 kez yıkama ve ikincil antikor (1: Keçi anti-tavşan IgG, 500 (H + L)) uygulanır, 1 saat. % 1 PBST ile 3 kez slayt durulayın. beyin dilim üzerinde cam kapak yerleştirin.
- floresan mikroskop kullanılarak (emisyon dalga boyu470 nm, emisyon dalga boyu 525 nm, büyütme 5X), internal kapsül AAV-GFP transduced aksonlar gözlemlemek. Transduced akson stereotaktik koordinatlarını belirlemek için Rat Beyin Atlas 15 transduced akson yerleri karşılaştırın
- Kapsül Enfarktüs Modelleme Uygun Işık Şiddeti Ayarı Ön lezyon
- Optik Sinir Arayüz İnşaatı
- Bir kesim matkap kullanarak içinde bir stile ile 27 gauge spinal iğne uygun bir uzunluğa (4 cm) kesin.
NOT: Kesme sıkıştırmak ve spinal iğne ucu ezmek olabilir; stile kaldırmak ve spinal iğne ezilmiş kısmını çıkarmak ve spinal iğnenin iç kalibreli korumak için spinal iğne ucu lehçe. - bir tarafı patch kablosu (62.5 um'lik çekirdek ile 125 um) optik elyafın ceketin uygun bir uzunluğu (10 cm) bir şerit.
- unjacked optik fi takınBER metal boru (dış çapı 17 mm: 3.8 mm, iç çap: 3.3 mm, uzunluk) olarak daha sonra elyafın yaklaşık sıkıştırılır. metal boru fiber optik ve spinal iğne göbek arasındaki boşluğu doldurmak için yararlıdır. iki kez ayağı ile metal borunun 1/2 alt kelepçe.
- fiber optik ısı-kurutmalı epoksi uygulayın ve spinal iğne içine fiber optik yerleştirin. hub boş alana ek bir epoksi uygulayın. stabil tespit için 100 ° C de 20 dakika boyunca epoksi Cure.
- Spinal iğne dışarı çıkıntı fiber optik tutunmaya ve elmas alıştırma (parlatma) sayfaları kullanarak spinal iğnenin ucunda fiber optik lehçe.
- yeşil lazer sisteminin kuplöre yama kablosu FC / PC bağlantı parçası bağlayın ve dijital optik güç ve enerji metre kullanarak fiber optik ucundan ışık yoğunluğunu ölçmek.
- Bir kesim matkap kullanarak içinde bir stile ile 27 gauge spinal iğne uygun bir uzunluğa (4 cm) kesin.
- Optik Sinir Arayüz İnşaatı
2. Photothromİç Kapsül içinde robotik Enfarktüs hasarının
- Uygun bir sterilizatör (Buhar veya Plazma sterilizatör) kullanarak tüm cerrahi aletleri ve elektrotları sterilize edin. Sterilizasyon, 30 dakika, kuru 30 dakika ayarı olarak 121 ° C 'de buharlı sterilizatör kullanımı.
- hayvan anestezisi (~ 400 g, 11-13 hafta) kas içi enjeksiyon yoluyla ketamin hidroklorür (100 mg / kg) ve ksilazin (7 mg / kg) karışımı ile. pençe sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin. hayvanın bünyesinde bir ısıtma pedi vasıtasıyla 37.5 ± 0.5 ° C vücut ısısını korumak.
- bir kulak çubuğu ve ağız tutucu kullanarak bir stereotaktik çerçeve içinde hayvan yerleştirin.
- Temiz ve% 70 alkol ve povidon iyot çözeltisi ile cerrahi siteyi dezenfekte edin. intraoperatif ağrıyı azaltmak amacıyla kafatası kesi bölgesinde kafa derisi altında% 2 lidokain hidroklorür Infiltrate. gözlerin kurumasını önlemek için veteriner oftalmik merhem sürün.
- bir aşırı steril örtüyü uygulaminimal- ve operatif siteleri maruz kalmaktadır. Steril şartlarda tüm işlemleri koruyun.
- 2 cm orta hat kafatası kesi gerçekleştirmek ve tel Toplayıcılı bilateral cilt geri çekin. Pamuk swapları ve hidrojen peroksit ile kafatası kurulayın.
- Bregma ve lambda aynı düzeyde hizaya kadar burun kelepçe yüksekliğini ayarlayın. KRİTİK ADIM: Bu hizalama doğru da ana deneyde, iç kapsül içinde bir enfarktüs lezyon performans gibi, daha derin bir yapı yaklaşım için çok önemlidir.
- bir delik yapın (çapı: 2 mm; AP: bregmadan -2.04; ML: orta hattan 3.0 ±) Fototromboz ikna etmek için bir matkap kullanarak.
- Polonyalı ve optik arayüz fiber optik ucunu temizleyin. bükmeden stereotaksik çerçeveye Oni sabitleyin. Oni ucu kontrol öncesi ve optik arayüz yerleştirilmesinden sonra açıkça silin.
- optika sokulmasından önce, fiber optiğin ucu lazer yoğunluğu ölçmekSıçan beyni hedef siteye l arayüz. Optik fiberin ucunda öncesi ameliyat adımlarla doğrulandığı gibi, 3.5 mW lazer yoğunluğunu ayarlayın.
- internal kapsül hedef bölgeye matkap deliğinden (pre-cerrahi aşamasından doğruladı -7.8 mm) Oni yerleştirin.
- Fototromboz sırasında 37.5 ± 0.5 ° C'de vücut ısısını korumak. Düşük vücut ısısı infarktüsü beklenen ölçüde üretmek olmayabilir. kuyruk damarlarının içerisinden doğru Rose Bengal (2 ml / kg) enjekte edilir.
- Rose Bengal enjeksiyonundan sonra 90 saniye 1 dakika boyunca 532 nm yeşil lazer açın. Işık verilmesinden sonra yavaşça beyinden Oni çıkarın. ameliyat yerinin temizledikten sonra, yara 3-0 naylon sütür ile yara emniyete sabitleyin; stereotaktik çerçeveden sıçan bırakın ve bir kurtarma odasına transfer.
- Yalancı operasyon grubuna (SOG), yerine Gül-Bengal salin enjeksiyonu (0.2 ml / 100 gr) hariç, aynı lezyon yapma yordamı gerçekleştirin.
- Ameliyat sonrası ısıtma pedi ile vücut ısısını (37 ° C) muhafaza ve kas içi enjeksiyon yoluyla antibiyotik (ikinci jenerasyon sefalosporin,% 0.1, 1 ml) yönetmek. sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz hayvan bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanlar tarafından işgal kafesine ameliyat sonrası hayvanların iade etmeyin.
Not: Ön Deney 5 mW 1 mW olan en iyi ışık yoğunluğunu bulmak için aynı prosedür gerçekleştirildi ve prosedür, farklı durumda lezyonun tatminkar ölçüde elde etmek için gerekli olabilir.
Kapsül Enfarktüs hasarının 3. Değerlendirme
- Davranış Testi ve Hayvan Gruplandırılması
- Whishaw ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi görevleri ulaşan bir pelet gerçekleştirin. 14 strok modelleme sonra 1 hafta boyunca her gün ön ayakları motor açık değerlendirmek. Tek bir pelet ulaşan görevi gerçekleştirmek1 cm genişliğinde bir yarık ve ön duvarının ortasında önünde bir gıda raf net Pleksiglas (30 x 15 x 35 cm) kullanan gıda kısıtlamalı hayvanlarda (SPRT) (kontrol vücut ağırlığının% 90).
- Tercih ön ayakları eğik kontralateral gıda rafta pelet yerleştirin. 3 hafta seans başına 20 pelet yönetin.
NOT: Sprts başarılı bir sayıda hayvan gıda pelet kavrar ve onu düşürmeden ağzına koyar bir ulaşılabilecek olarak tanımlanır. - aşağıdaki formül ile tanımlanır başarılı ulaştığı bir yüzdesi olarak bir puan hesaplanır
NOT: Biz 3 gruba hayvanlar bölmek: Sham grubu (SOG), ılımlı toparlanma grubu (MRG) ve kötü kurtarma grubu (PRG). Eğer bir inme sonrası SPRT skoru>% 50, biz önemli bir lezyon varlığını gösterir MRG gibi sıçan sınıflandırmak, ama ta değil tamamen yokrYer. İnme sonrası SPRT puanı öncesi inme SPRT puanı ile karşılaştırıldığında% 50 <ise, biz hedefe tam lezyonu gösterir PRG olarak grup, sınıflandırır.
- Enfarktüs hasarının Neurohistological Onayı
- Daha önce tarif edildiği gibi% 4 paraformaldehit ile kardiyak perfüzyonun gerçekleştirin. Beyin tamamen% 30 sukroz çözeltisi içinde dibe çökmesinden sonra, 10 um kalınlığa ve mikrotom ya kriyotom 4 ile 200 um arasında bir aralıkta koronal bölümlendirilmeleri gerçekleştirin.
- H & E, Nissl, Luxol hızlı mavi-PAS, sinir lifi proteini-L veya Glial fibriler asit protein boyama ve histolojik bulguları gözlemlemek ile Leke boyama gözlemlemek hedef alan internal kapsül tüm genişliği anlatabileceğiniz optimum ışık yoğunluğunu belirlemek için 4,17.
- ImageJ yazılımı kullanarak, beyin slaytlar üzerinde internal kapsül Fototrombotik enfarktüs alanının hacmini ölçmek.
- infarkt alanının hacmini ölçmek için, 'ImageJ' yazılımı başlatmak. Dosyaları açmak için, 'Stacks Image' ( 'Resim' → 'Stacks' → 'Stacks Image') üst üste olmak. Düzenleme dosya adı seçin ve ölçek düzenlemek için (→ "Ölçeği ayarla 'Analiz' ') Ölçeği ayarla'.
- 'Eklentileri' ı seçin görüntülerin hacmi veya alanı hesaplamak için 'Yığınları ölçün'. 'Dilim Aralığı' içine 2 görüntülerin mesafe aralığını yerleştirin. Tüm resimlerin ROI bir çizim (İlgilenilen Bölge) yapın ve 'Tedbir' tıklayın.
NOT: Yazılım 'ImageJ' otomatik alanı ve her bir görüntünün hacmi ve bunların toplam hacmi hesaplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan yöntem kalıcı bir motorlu açığı olan bir sınırlı kapsül infarktı oluşturmak için tasarlanmıştır. Nedenle, doğru bir şekilde, operasyon öncesi aşamada, iç kapsül içinde hedef belirlemek için önemlidir. internal kapsül piramidal liflerin somatotopik haritalama bugüne kadar yerleşmiş edilmemiştir. Doğru iç kapsül içinde hedef belirlemek için, ön ayakları alanı tasvir edilmelidir. Motor korteks ön ayakları alanına AAV-GFP bir enjeksiyon, iç kapsül (Şekil 1) piramidal liflerin aksonlar izleyebilir. Bu biyotinile dekstran amin (BDA) gibi diğer nöral izleyiciler, aynı için kullanılabilmektedir amaç. internal kapsül içindeki hedef stereotaktik koordinatları internal kapsül motor korteksin ön ayakları alanından kaynaklanan aksonal projeksiyonlar izleme tarafından açıklanacaktır edilebilir.
2 Hafta motor korteksin ön ayakları alandan kaynaklandığı AAV-GFP. GFP-transduced aksonal liflerin Enjeksiyonu Sonrası İç Kapsül içinde ön ayakları Alan Şekil 1. Kimlik talamus (oklar) ventrolateral çekirdeğinde gösterilen ve internal kapsül (ok başı) kaudal kısmı. noktalı çizgi internal kapsül kontur gösterir ve sayılar bregma gelen mesafelere bakın. hipokampus, hippi; İşlemci, kaudat putamen; VL, ventrolateral çekirdek; IC, iç kapsül. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
optimum ışık yoğunluğu hayvanın yorgunluğu ve vücut ağırlığı ve türleri ve çaplarına bağlı olarak farklı olabilir Optik fiberler. Bu nedenle, en iyi ışık yoğunluğu, ana enfarktüsü lezyon deney ayrıca önceden belirlenmelidir. Lezyonun ölçüde histolojik ölçüde karşılaştırarak (Şekil 2). En iyi ışık yoğunluğu kontrol edilebilir komşu gri cevher yapıları bozmadan iç kapsülün tüm genişliğini kapsayan kadar Fototrombotik prosedürü kullanarak, ışık şiddeti giderek artabilir infarkt lezyonun ve yerleri.
Şekil FOTOTROMBOTİK hasarının ardından 5 mW 2 Hafta 2 mW Lazer Işık Değişen Yoğunluğu karşısında Enfarkt Lezyonların 2. kapsamı. Optimum ışık yoğunluğu bu deneysel ortamda 3 mW ve 4 mW arasında olduğu kabul edilir. Oklar infarkt lezyon göstermektedir./53281/53281fig2large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu fiber optik ince bir metal boru (spinal iğne) içinde ihtiva edildiği Oni kullanmayı tercih eder. fiber optik fiber optik yolu boyunca ek sinirsel hasar oluşturabilir muhtemeldir lif, yanından az ışık saçılması üretebilir. Optik fiberin kapatma derin hedefler bir optik elyaf bükülmesini önlemek için, hem de stereotaktik çerçeve (Şekil 3) oni takmak için de avantajlıdır.
Optik-sinir Interface (ONI) Şekil 3. inşaatı. (A) spinal iğne kesme. fiber optik soyma (b). (C d) ankraj metal boru üzerine yerleştirilirsoyulmuş fiber optik ve sıkışık spinal iğne göbek fiber optik güvenceye alın. (E) epoksi ilave optik fiber spinal iğne yerleştirilir. (F), epoksi, 20 dakika boyunca 100 ° C'de sertleştirilir. (G) optik elyaf Spinal iğne ucunda bölünür. (H) fiber optik parlatılır. (i) ışık yoğunluğu fiber optik ucundan ölçülür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Fototrombotik prosedür motor hasar% 70 başarı ~ ile tekrarlanabilir lezyonlar ve yerleri üretecek. Tipik kapsül infarkt lezyon kapsül elyaflar (Şekil 4A) ventrodorsal boyutu kapsamaktadır. Bundan başka, infarkt lezyon için kapsül lif içinde artan ışık saçılımı iç kapsülün ön-arka eksen boyunca uzanır. (Şekil 4B), iç kapsülün altındaki bir optik yolu beyaz madde liflerden oluşur; Bu şekilde, çoğu zaman yüksek bir ışık yoğunluğu irradyasyonu ile zarar görmüştür. Seri kesitler ve boyama infarktüsü bütün hacmi ve kapsamı onaylamak için gereklidir. Enfarktüs hacmi 0.63 ± 0.37 mm3 idi. kapsül lif, nörofilament imha değerlendirmek ve Luxol hızlı mavi-PAS lekeleri yararlı için.
Fototromboz sonra Kapsül Enfarktüs 3 Hafta 4. Mikroskobik Görünüm Şekil. Kapsül infarkt mikroskobik görünüm 3 hafta Fototromboz sonra. sıçan beyninde koronal bölümünün A) Beyin dilim. Ok başı talamus ve iç kapsül kadar optik fiber içeren iğne yolu göstermektedir. B) koronal beyin dilimleri showi Seri Nissl boyama İç kapsül enfarkt lezyon bütün ölçüde ng. Ok uçları infarkt lezyonu göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
modelleme başarısı görevi ulaşan tek pelet kullanılarak davranış testi ile değerlendirilebilir. Enfarktüs hasarının takip eden 1 hafta sonra davranışsal performans günlük tek pelet ulaşan eğitim (Şekil 5) rağmen SPRT kalıcı ve belirgin bozulma eşlik doğru lezyonu onaylamak için iyi bir rehber. Motor açığı PRG gösterilmiştir sonra, nörolojik defisit gözlem 3 aylık dönemde devam etti. Sham grubu Ameliyattan sonra SPRT performansının önemli bir azalma göstermemiştir.
/ 53281 / 53281fig5.jpg "upload />
Kapsül Infart 4,20 sonra Puanlarının ulaşmak Tek Pellet 5. Değişiklikleri Şekil. Deney grupları (PRG ve MRG) önemli ölçüde sergilenen sahte operasyona grupta (SOG) ile karşılaştırıldığında enfarktüs lezyon hemen sonra puanları azalmıştır. PRG zamanla kalıcı motor yetersizlik sergiler ise MRG, SPRT performansları kademeli bir iyileşme gösterir. Op, Fototrombotik enfarktüs lezyon; PRG, kötü kurtarma grubu; MRG, ılımlı bir toparlanma grubudur. İstatistiksel önem varyansları tekrarlanan ölçüm analizi kullanılarak belirlenmiştir. MRG karşı + SOG; * PRG karşı SOG. Veri sem ± araçlardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan kapsül infarkt modeli ön ayakları işlevlerinde belirgin ve kalıcı motor yetersizliği ile hedeflenen lezyona göstermektedir. Subkortikal kapsül inme Önceki Modeller motor bozukluk ve hızlı bir iyileşme süreci 6,8,9 yetersiz derecede göstermiştir. Bu anlamda, bu model uzun dönem fonksiyonel bozukluğu sergileyen klinik kapsül infarkt olgusu benzer.
Bir sınırlı kapsül enfarktüs modelinin geliştirilmesi en kritik adımlar şunlardır: 1) doğru internal kapsül içinde işlevini devre dışı bırakmak amacıyla vücut parçası somatotopik temsilini belirlemek için; 2) gri cevher yapıları komşu minimal tecavüz ile internal kapsül tüm genişliği yok edebilir yeşil lazer, optimal yoğunluğunu belirlemek için; ve 3) doğru bir hedef yapıya fiber optik yerleştirin. Sunulan tekniklerin çemberle sağlanabilmekle birlikteyüksek çoğaltma oranı (>% 70) d kapsül enfarktüs modeli, internal kapsül tüm genişliği kaplayan imha bütünlüğü hedefleme ve derecesi küçük farklılıklar farklı motor açıkları sorumlu olabilir.
Kortikospinal yolu somatotopik örgütün 15 tartışmalara rağmen insanlarda iç kapsül posterior ekstremitenin ön yarısında yer almaktadır. Buna karşılık, eşdeğer sınıflandırma ya da kemirgenler internal kapsül somatotopik organizasyonun detaylı aydınlatılması olmuştur. somatotopik organizasyon ile ilgili bilgi eksikliği genellikle kapsül infarkt modelleri arasında farklı motor sonuçları ile iç kapsül içinde enfarktüs lezyon yanlış hedeflere yol açar. Ancak, biz büyük olasılıkla ön ayakları motor lifler yolunu temsil eden internal kapsül kaudal kısmında GFP transduced aksonlar, tespit. Ayrıca, bu alanda demonstrat ve lezyonön ayakları ulaşan beceri belirgin ve kalıcı açığı ed. Bu nedenle, biz kapsül enfarktüs modelinin geçerliliğini artırmak için stereotaktik lezyon için internal kapsül kaudal kısmı öneriyoruz.
Oni hayvan soyu, vücut ağırlığı, ışık kaynağı ve çeşitleri enfarktüs farklı boyutlarda üretmek çünkü ışık yoğunluğunun önceden ayar inme modelinde enfarktüs lezyon muntazam bir ölçüde elde etmek zorunludur. tatmin edici bir infarkt lezyon az ışık yoğunluğu elde edilinceye kadar bu nedenle, aynı şekil değiştirme ve vücut ağırlığı, deney hayvanlarında farklı ışık yoğunlukları ile ön deneyler yürütülmelidir.
kapsüler elyafın tüm genişliği yok edebilir ışık yoğunluğunun (ön-arka ve dorsoventral ölçüde) komşu yapılara en az zararla ön ayakları alanına karşılık gelen en iyi ışık şiddeti olarak kabul edilir. foreliminternal kapsül b alanı superiora talamus ve altta optik yolu ile çevrilidir. Bu nedenle, ONI yerleştirilmesi derinliği üst ve alt komşu yapıların eşzamanlı korunarak, dorsoventral yönde IC tüm boyutlarını yok etmek doğru olmalıdır. Oni doğru olmayan yerleşim, iç kapsül içinde kalan piramidal liflerin sinaptik plastisite sonucu, motor açık hızlı iyileşme neden IC, eksik bir tahrip olur. Seri histolojik incelemelerde, kalıcı bir motorlu açığının indüksiyon en karıştırıcı faktör u ygulam 4,16 bütün genişliği yok yetmezliğine yol açan Oni, yanlış konumlandırma oldu. Bu nedenle, çok dikkat doğru hedefe ulaşmak için dikkat edilmelidir. Son zamanlarda, Blasi ve ark. Kalıcı olarak saf motor açık arka iç kapsül içinde bir enfarktüs lezyon yaparak üretilebilir bildirilmiştirendotelin-1 (ET-1), 17 kullanılmıştır. Bununla birlikte, ET-1, ET-1 ile difüzyon ile komşu gri madde yapısının yok edebilir.
Davranışsal test internal kapsül içinde enfarktüs lezyon oluşumunu değerlendirmek için laboratuvarda bir hemen kullanılabilir ölçüttür. Bununla birlikte, bir hafta infarkt lezyon sonrası motor performans değerlendirmesi, orta derecede ve düşük geri kazanım gruba hayvan ayrılması tavsiye edilir. yoksul kurtarma <% 50 iyileşme olarak tanımlandı ise ılımlı toparlanma önce hasarının puanı ile karşılaştırıldığında>% 50 oranında performans puanı bir artış olarak tanımlandı. Ön ayakları motoru davranış testleri arasında, görev ulaşan tek pelet inme kaynaklı motorlu performansları 14 nicel ve nitel ölçümlerinde hem de en hassas testlerden biridir. Aynı anda böyle tutup bir yemek almak olarak, ön ayakları kullanım analizi sağlarken görev kantitatif ulaşan başarı ölçerpelet. Ulaşan hareketin nitel analiz hakiki fonksiyonel iyileşmeyi veya tazminat 20 ayırarak inme kurtarma kalitesini ayırt etmek de yararlıdır. Burada, kısaca SPRT kantitatif ölçümü tarif; Ancak, bir kare-kare analizine dayalı filme ve puanlama kullanarak nitel analiz daha detaylı analiz için tavsiye edilir.
Burada sunulan teknikler sınırlı kapsül infarkt modelleme indüksiyon sınırlı olması gerekmez. teknik, korpus kallosum beyaz maddenin diğer alanlarda, ön commissures ve nöral yapılar arasında bağlantı lifleri bir enfarktüs lezyon indüksiyon uygulanabilir. beyaz cevher, optik özelliklerine göre ONI küçük ve Fototrombotik tekniğin kombinasyonu komşu yapılara en az zararla hedeflenen yapıları yok etmek olasıdır. Örneğin, laküner infarktlar kolayca üretmek olabilirmotor, bilişsel ve hafıza fonksiyonları ile ilgili subkortikal yapıları hedef alarak, d. Hedef yapı büyük olduğu zaman, oni ve farklı hedefleme ve açılı yörüngelerin çoklu ekleme lezyonların istenen ölçüde elde etmek gerekli olabilir.
Bu teknikte bazı sınırlamalar vardır. teknik u ygulam ve daha sonra geri enfarkt lezyon sonucu göstermek için yeterlidir. beyaz cevher Fototrombotik imha biraz insan WMS'de farklıdır, çünkü Ancak, bu model insan WMS tam spektrum yansıtmamaktadır. Sonuç olarak, nörobiyolojik veya MR görüntüleme bulguları Fototrombotik hasarının erken evrede farklı özelliklere gösterebilir. Bu nedenle, bu model uygun modelin avantaj ve dezavantajları kapalı ticaret için kullanılmalıdır. çok doğru prosedürleri gerektirdiğinden Teknik, tüm ameliyatlar bu modelde belirgin ve sürekli motor açığı üretebilir. Specifically, eğitimli ve deneyimli eller bu modelin üretiminde yüksek tekrarlanabilirlik üretmek için gereklidir.
Sonuç olarak, Fototrombotik teknikle, ışık şiddeti optimizasyonu ve doğru hedefleme kombine kullanımı sınırlı kapsül enfarkt model üretmek için yararlı bir tekniktir. Bu model sadece davranışsal, pistte WMS ve hücresel seviyelerini incelemek için değil, aynı zamanda yeni tedavi ve rehabilite edici girişimlerin yararlılığını değerlendirmek için yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık Sistemleri Mühendisliği Enstitüsü (IMSE) GIST gelen GIST-Caltech İşbirlikçi Fonu (K04592) bir hibe ile ve Bilim, bilgi ve iletişim teknolojileri ve gelecek Planlama Bakanlığı tarafından finanse Kore NMK vasıtasıyla Temel Bilimler Araştırma Programı tarafından desteklenen (NRF-2013R1A2A2A01067890).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
| Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
| Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
| Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
| Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
| Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m |
|
| Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
| Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS |
|
| Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
| Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
| Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
| Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
| Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
| Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
| Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
| AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
| Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
| Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
| Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
| Hand Piece Drill | Seshin | ||
| Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
| Ketoprofen | UNIBIOTech |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2012 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 125, 2-220 (2012).
- Debette, S., Markus, H. S. The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging: systematic review and meta-analysis. Bmj. 341, 3666 (2010).
- Zhang, K., Sejnowski, T. A universal scaling law between gray matter and white matter of cerebral cortex. PNAS. 97 (10), 5621-5626 (2000).
- Kim, H. S., et al. A rat model of photothrombotic capsular infarct with a marked motor deficit: a behavioral, histologic, and microPET study. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 683-689 (2014).
- Kleim, J. A., Boychuk, J. A., Adkins, D. L. Rat models of upper extremity impairment in stroke. ILAR J. 48 (4), 374-384 (2007).
- Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat. Behav Brain Res. 169 (2), 206-211 (2006).
- He, Z., et al. Definition of the anterior choroidal artery territory in rats using intraluminal occluding technique. J Neurol Sci. 182 (1), 16-28 (2000).
- Tanaka, Y., et al. Experimental model of lacunar infarction in the gyrencephalic brain of the miniature pig: neurological assessment and histological, immunohistochemical, and physiological evaluation of dynamic corticospinal tract deformation. Stroke. 39 (1), 205-212 (2008).
- Shibata, M., Ohtani, R., Ihara, M., Tomimoto, H. White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion. Stroke. 35 (11), 2598-2603 (2004).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann Neurol. 17 (5), 497-504 (1985).
- Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40 (1), 248-253 (2009).
- Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Handbook of biomedical optics. 83, CRC Press. Boca Raton, Fl. (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Whishaw, I. Q., Whishaw, P., Gorny, B. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a movement rating scale. J Vis Exp. (18), e816 (2008).
- Jang, S. H. A review of corticospinal tract location at corona radiata and posterior limb of the internal capsule in human brain. NeuroRehabilitation. 24 (3), 279-283 (2009).
- Kim, D., et al. Longitudinal changes in resting-state brain activity in a capsular infarct model. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (1), 11-119 (2014).
- Blasi, F., Whalen, M. J., Ayata, C. Lasting pure-motor deficits after focal posterior internal capsule white-matter infarcts in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (6), 977-984 (2015).
- Metz, G. A., Antonow-Schlorke, I., Witte, O. W. Motor improvements after focal cortical ischemia in adult rats are mediated by compensatory mechanisms. Behavioural brain research. 162 (1), 71-82 (2005).
