Summary
توضح هذه المخطوطة تقنية نمذجة احتشاء المحفظة. نحن هنا تستخدم تقنية photothrombotic تعديل مع كثافة منخفضة من الضوء بعد رسم الخرائط الهدف ما قبل الجراحة. باستخدام هذه التقنية، أنشأنا المحفظة نموذج احتشاء مقيدة يعانون من إعاقة حركية مستمرة.
Introduction
حتى وقت قريب، و "السكتة الدماغية المادة الرمادية (GMS) نماذج" استخدمت حصرا لفهم الفيزيولوجيا المرضية من السكتة الدماغية وتوجيه تطوير علاجات جديدة. ومع ذلك، كان هناك انتشار متزايد من السكتة الدماغية التي تصيب المادة البيضاء تحت القشرية في الأفراد المسنين، التي تشكل 15-25٪ من كل السكتات الدماغية 1،2. وقد أجريت العديد من الدراسات حول السكتة الدماغية باستخدام نماذج GMS، في حين أن هناك عدد قليل من الدراسات التي استخدمت البيضاء مسألة السكتة الدماغية (WMS) نماذج. المادة البيضاء في القوارض هي أقل بكثير من المادة البيضاء في البشر أو القرود. ونتيجة لذلك، فإنه من الصعب للوصول بشكل انتقائي وتدمير المناطق المستهدفة في المادة البيضاء 3. بالإضافة إلى ذلك، وضعت أي أدوات فعالة حتى الآن لتدمير انتقائي مدى المخطط من المادة البيضاء المستهدفة. لذلك، كان هناك نقص في النماذج المناسبة للدراسة من السكتات الدماغية المادة البيضاء.
الحادي والحيوانوغالبا ما تستخدم نماذج ROKE لرصد التقدم المحرز في استعادة السيارات لتطوير التأهيلية الجديدة والطرق العلاجية. وهو مثالي للاستفادة من نموذج حيواني أن يسلك عجز عصبي طويل الأجل متطابقة مع التعديلات التشريحية تبين في السكتة الدماغية الإنسان 4،5. في هذا الصدد، والانتعاش السريع من العجز الحركي ومشاركة واسعة من الدماغ التالية lesioning احتشاء قد لا تكون واقعية في السعي للبحث السكتة الدماغية. وقد بذلت السابقة نماذج المحفظة احتشاء من قبل انسداد الشريان السباتي الداخلي أو الشرايين المشيمية الأمامية ونشر endothelin-1 (ET-1) في كبسولة الداخلية 6-9. ومع ذلك، انسداد الشريان يتطلب تشريح دقيق للشرايين، ولكنها تنتج مساحة واسعة من آفة احتشاء، بما في ذلك كبسولة الداخلية، دون العجز السلوكية الثابتة. وعلاوة على ذلك، كان ET-1 لا منتشر لتدمير تماما الطرف الخلفي من الكبسولة الداخلية، وبالتالي أقل وضوحا، أو داوم بيهالعجز avioral.
وقد استخدم على نطاق واسع نموذج احتشاء photothrombotic لتوليد أنواع مختلفة من الآفات احتشاء في القشرة المخية وتحت القشرية 10. تقنية تشمل الوريد تليها الإضاءة التنسيق، الأمر الذي يؤدي إلى تراكم الصفائح الدموية في الأوعية الصغيرة وجيل من الآفات احتشاء 10. وقد استخدمت تقنية Photothrombotic على نطاق واسع لخلق الآفات GMS، بينما نادرا ما تم استخدامه لتوليد الآفات WMS 5،11. لهذه التقنية، وقد أثبتت مجموعة من روز البنغال صبغ وضوء أشعة لتكون مفيدة في تدمير بنية الهدف، مما تسبب في عجز وظيفي المقابلة. والعنصر الأساسي في تقنية photothrombotic هو أشعة الضوء، لأنه يحدد حجم الآفات احتشاء. النتائج أشعة الضوء في تأثيرات مختلفة على المادة الرمادية والمادة البيضاء، بسبب تناثر الضوء العالي أكثر من 4 مرات في أماه الأبيضtter مقارنة مع المادة الرمادية 12؛ وفقا لذلك، وإذا كانت شدة الضوء لديها الإشعاع منخفض بما فيه الكفاية (<1140 ميغاواط / مم 2)، واحد يمكن أن تحد من التمديد التي الآفة photothrombotic تؤثر على مدى المادة البيضاء (أي، كبسولة الداخلية). على سبيل المثال، يمكن للضوء طاقة أعلى لحث عوائق في كل من المادة الرمادية والبيضاء، وبعد ضوء انخفاض الطاقة قد تدفع photothrombosis فقط في المادة البيضاء. وعلاوة على ذلك، كان تغلغل الطاقة الضوئية محدودة للغاية. فقد ما يقرب من 99٪ من الطاقة الضوئية إلى ما بعد 1 ملم من مصدر الضوء 13. ولذلك، فإنه من المتوقع أن تستهدف بدقة، ضوء انخفاض الطاقة يدفع photothrombosis فقط في المادة البيضاء مع زحف الحد الأدنى من المادة الرمادية المجاورة.
هنا، نحن تصف طريقة رواية لخلق الآفات احتشاء في منطقة forelimb من الكبسولة الداخلية في القوارض. نحن تصف طريقة لتحديد هوية المنطقة forelimb في كاليفورنيا الداخليةpsule، وتكنولوجيا أشعة الضوء، بما في ذلك تعديل والتسليم من الضوء، وتوليد آفة احتشاء. نحن أيضا وصف التجارب السلوكية المستخدمة لتقييم مدى اكتمال نماذج المحفظة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت كافة الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للمعهد غوانغجو للعلوم والتكنولوجيا (GIST)، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم في GIST.
1. خطوات ما قبل lesioning
- تحديد منطقة Forelimb في كبسولة الداخلية باستخدام AAV-GFP
- منزل والتعامل مع الفئران سبراغ داولي (~ 400 غرام، 11-13 أسبوعا) وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية.
- تعقيم جميع الأدوات والأقطاب الكهربائية الجراحية باستخدام معقم مناسب (البخار أو معقم البلازما). استخدام معقم بخار في درجة حرارة 121 مئوية كإعداد من 30 دقيقة لتعقيم و 30 دقيقة لتجف.
- تخدير الحيوانات مع خليط من هيدروكلوريد الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (7 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن العضلي. تحقق من عمق التخدير بواسطة معسر مخلب. الحفاظ على درجة حرارة الجسم 37.5 ± 0.5 درجة مئوية عن طريق وسادة التدفئة تحتجسم الحيوان.
- وضع الحيوان في إطار المجسم باستخدام شريط الأذن وحامل الفم.
- تنظيف وتعقيم موقع الجراحة مع الكحول 70٪ ومحلول البوفيدون اليود. التسلل 2٪ ليدوكائين هيدروكلوريد تحت فروة الرأس في منطقة الجمجمة شق يهدف للحد من الألم أثناء العملية.
- تطبيق التعليم والتدريب المهني مرهم للعين لمنع جفاف العينين. وضع الستارة العقيمة على الحيوان إلى مواقع المنطوق. الحفاظ على جميع الإجراءات في ظروف معقمة.
- إجراء شق خط الوسط الجمجمة من 2 سم باستخدام مشرط وسحب الجلد بشكل ثنائي مع مبعدات الأسلاك. تجفيف الجمجمة مع مسحات القطن و 30٪ بيروكسيد الهيدروجين.
- جعل ثقب باستخدام قطعة اليد الحفر على المنطقة forelimb من القشرة الحركية (ا ف ب: +2.5 من bregma، ML: ± 2.5 من خط الوسط) ومسح الجهاز مع currette الجزئي لفيروس الحقن.
- ذوبان الجليد في AAV-GFP (2 × 10 12 جزيئات الفيروس / مل) على الجليد وتحميل 1 ميكرولتر منفيروس في حقنة 10 ميكرولتر. وضع حقنة في إطار المجسم.
- تحريك الإبرة إلى الحفرة مسبقة الصنع وخفض إبرة 1 ملم عمق الجافية.
- حقن الفيروس ببطء (0.1 ميكرولتر / دقيقة) باستخدام MICROPUMP عالية الدقة وترك الإبرة في مكانها لمدة 10 دقيقة إضافية للسماح للفيروس أن ينتشر خارج.
- بعد تنظيف الموقع المنطوق مع الري بالمياه المالحة، وتأمين الجرح مع خياطة 3-0 النايلون. الافراج عن الفئران من إطار المجسم وتحويلها إلى غرفة الإنعاش. إدارة كيتوبروفين (2 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن العضلي للسيطرة على الألم بعد العملية الجراحية.
- الحفاظ على درجة حرارة الجسم (37 درجة مئوية) مع لوحة التدفئة وإدارة الجيل الثاني المضادات الحيوية من فئة cephems (0.1٪، 1 مل) عن طريق الحقن العضلي و 2٪ ليدوكائين هيدروكلوريد عن طريق الحقن تحت الجلد عند الضرورة. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ علىالاستلقاء القصية. بيت واحد الحيوان حتى الشفاء التام.
- بعد 2 - 3 الانتعاش الأسبوع، تخدير عميق الفئران مع جرعة زائدة من هيدروكلوريد الكيتامين (300 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن العضلي في غطاء محرك السيارة. تأكيد وفاة الحيوان من عدم وجود اصبع القدم معسر استجابة والنبض والتنفس. وضع مستلق الفئران في غطاء محرك السيارة.
- فتح تجويف البطن عن طريق "شق على شكل Y'لفتح تجويف الصدر. بإحكام تضييق الشريان الأورطي النازل مع مرقئ وتمزق الأذين الأيمن للقلب الفئران لتصريف الدم. بدء نضح إلى البطين الأيسر من القلب مع البرد 1٪ امتصاص العرق لمدة 5 دقائق (10 مل / دقيقة)، يليه بنسبة 4٪ لامتصاص العرق لمدة 30 دقيقة (10 مل / دقيقة).
- إزالة رأس فأر من جثة باستخدام زوج من مقص. جعل شق خط الوسط من الرقبة إلى الأنف وإزالة عضلات الرقبة باستخدام مقص أو مقراض بحيث يتعرض الجمجمة. تشريح بلطف عظام الجمجمة ودوراس الخروج من الدماغ.
- استخراج الدماغ ووضع الدماغ الفئران في أنبوب مخروطي 50 مل مملوءة 4٪ بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وغسل الدماغ مع برنامج تلفزيوني 1X 3 مرات ووضعها في محلول السكروز 30٪.
- بعد الدماغ المصارف تماما على الجزء السفلي من الحل السكروز 30٪، وضع الدماغ في cryomold مع أكتوبر المركب عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في مبضع بردي. شريحة الدماغ في الطائرة الاكليلية في سمك 40 ميكرون وفاصل من 200 ميكرون.
- أداء GFP المناعية تلطيخ باستخدام طريقة شريحة 14. تطبيق الأجسام المضادة الأولية (1: 200 من البروتين مكافحة الفلوري الأخضر، الأرنب مفتش جزء) إلى شرائح الدماغ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في 2 اليوم الثاني، ويغسل مع 1٪ الفوسفات مخزنة المالحة مع (PBST) حل توين-20 3 مرات وتطبيق الضد الثانوية (1: 500 من الماعز المضادة للأرنب مفتش (H + L)) لمدة 1 ساعة. شطف الشريحة مع 1٪ PBST 3 مرات. وضع غطاء زجاجي على شريحة الدماغ.
- باستخدام مجهر فلوري (الطول الموجي الإثارة470 نانومتر، والطول الموجي انبعاث 525 نانومتر، والتكبير 5X)، مراقبة AAV-GFP محاور transduced في الكبسولة الداخلية. مقارنة المواقع من المحاور transduced مع دماغ الفئران أطلس 15 لتحديد الإحداثيات المجسم من المحاور transduced
- قبل lesioning تعديل شدة الضوء المناسبة للالمحفظة عائق النمذجة
- بناء واجهة العصبية البصرية
- قطع طول المناسب (4 سم) إبرة في العمود الفقري قياس 27 مع مرود داخل باستخدام مثقاب القطع.
ملاحظة: قد قطع ضغط وسحق رأس إبرة في العمود الفقري. إزالة مرود وتلميع طرف إبرة في العمود الفقري لإزالة الجزء سحق من إبرة في العمود الفقري والحفاظ على عيار الداخلي للإبرة في العمود الفقري. - تجريد طول المناسب (10 سم) من سترة من الألياف الضوئية (125 ميكرون مع 62.5 ميكرون الأساسية) من جانب واحد التصحيح الحبل.
- إدراج فاي البصرية unjackedنوفمبر في أنبوب معدني (القطر الخارجي: 3.8 ملم، القطر الداخلي: 3.3 مم وطول 17 ملم)، والتي يتم بعد ذلك فرضت حول الألياف. أنبوب معدني مفيد لملء الفراغ بين الألياف الضوئية ومحور إبرة في العمود الفقري. المشبك أقل 1/2 من أنبوب معدني مع كوى مرتين.
- تطبيق الايبوكسي للحرارة قابلة للعلاج على الألياف الضوئية وإدراج الألياف البصرية في إبرة في العمود الفقري. تطبيق الايبوكسي إضافية إلى مساحة فارغة في المركز. علاج الايبوكسي لمدة 20 دقيقة في 100 درجة مئوية لمدة تثبيت مستقر.
- يلتصق الألياف البصرية التي يبرز من إبرة في العمود الفقري وتلميع الألياف البصرية في غيض من إبرة في العمود الفقري باستخدام اللف الماس (تلميع) ورقة.
- ربط جزء موصل FC / PC الحبل التصحيح إلى مقرنة نظام ليزر خضراء وقياس شدة الضوء من غيض من الألياف الضوئية باستخدام الطاقة الضوئية الرقمية والطاقة متر.
- قطع طول المناسب (4 سم) إبرة في العمود الفقري قياس 27 مع مرود داخل باستخدام مثقاب القطع.
- بناء واجهة العصبية البصرية
2. Photothrombotic عائق Lesioning في كبسولة الداخلية
- تعقيم جميع الأدوات والأقطاب الكهربائية الجراحية باستخدام معقم مناسب (البخار أو معقم البلازما). استخدام معقم بخار في درجة حرارة 121 مئوية كإعداد من 30 دقيقة لتعقيم و 30 دقيقة لتجف.
- تخدير الحيوانات (~ 400 غرام، 11-13 أسبوعا) مع خليط من هيدروكلوريد الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (7 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن العضلي. تحقق من عمق التخدير بواسطة معسر مخلب. الحفاظ على درجة حرارة الجسم 37.5 ± 0.5 درجة مئوية عن طريق وسادة التدفئة تحت جسم الحيوان.
- وضع الحيوان في إطار المجسم باستخدام شريط الأذن وحامل الفم.
- تنظيف وتعقيم موقع الجراحة مع الكحول 70٪ ومحلول البوفيدون اليود. التسلل 2٪ ليدوكائين هيدروكلوريد تحت فروة الرأس في منطقة الجمجمة شق يهدف للحد من الألم أثناء العملية. تطبيق التعليم والتدريب المهني مرهم للعين لمنع جفاف العينين.
- تطبيق ثنى العقيمة على لآي مال وفضح مواقع المنطوق. الحفاظ على جميع الإجراءات في ظروف معقمة.
- إجراء شق خط الوسط الجمجمة من 2 سم وسحب الجلد بشكل ثنائي مع مبعدات الأسلاك. تجفيف الجمجمة مع مقايضة القطن وبيروكسيد الهيدروجين.
- ضبط ارتفاع المشبك الأنف حتى يتم محاذاة bregma وامدا على نفس المستوى. خطوة حاسمة: هذه المواءمة أمر بالغ الأهمية للاقتراب بشكل صحيح بنية أعمق، مثل في أداء آفة احتشاء في الكبسولة الداخلية في التجربة الرئيسية.
- جعل ثقب (قطر: 2 مم؛ ا ف ب: -2.04 من bregma، ML: ± 3.0 من خط الوسط) باستخدام الحفر للحث على photothrombosis.
- البولندية وتنظيف غيض من الألياف البصرية واجهة بصرية. إصلاح بطاقات الهوية إلى الإطار التجسيمي دون الانحناء. تحقق غيض من بطاقات الهوية والقضاء عليها بشكل واضح قبل وبعد الإدراج واجهة بصرية.
- قياس كثافة الليزر من غيض من الألياف الضوئية قبل ادراج البصريل واجهة إلى موقع الهدف للدماغ الفئران. ضبط كثافة الليزر إلى 3.5 ميغاواط، وهو ما أكدته خطوات ما قبل الجراحة، في غيض من الألياف البصرية.
- إدراج بطاقات الهوية في المنطقة المستهدفة من الكبسولة الداخلية (-7.8 ملم أكد من الخطوة ما قبل الجراحة) من خلال حفر حفرة.
- الحفاظ على درجة حرارة الجسم 37.5 ± 0.5 درجة مئوية خلال photothrombosis. انخفاض درجة حرارة الجسم قد لا ينتج مدى المتوقع لاحتشاء. حقن روز البنغال (2 مل / كجم) عن طريق الوريد الذيل.
- تشغيل 532 نانومتر ليزر أخضر لمدة 90 ثانية 1 دقيقة بعد الحقن روز البنغال. بعد التشعيع، وإزالة بلطف الوطني لبطاقات الهوية من الدماغ. بعد تنظيف الموقع المنطوق، وتأمين الجرح تأمين الجرح مع خياطة 3-0 النايلون. الافراج عن الفئران من إطار المجسم وتحويلها إلى غرفة الإنعاش.
- لمجموعة الشام التي تديرها (مجموعة العمليات الخاصة)، تنفيذ إجراء صنع آفة متطابقة، باستثناء حقن محلول ملحي (0.2 مل / 100 غ) بدلا من روز البنغال.
- الحفاظ على درجة حرارة الجسم (37 درجة مئوية) مع لوحة التدفئة بعد عملية جراحية وإدارة المضادات الحيوية (الجيل الثاني السيفالوسبورين، 0.1٪، 1 مل) عن طريق الحقن العضلي. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. لا عودة الحيوانات بعد الجراحة إلى قفص الحيوانات الأخرى المحتلة حتى تعافى تماما.
ملاحظة: تم تنفيذ تجربة أولية في نفس الإجراءات للعثور على شدة الضوء المثلى من 1 ميغاواط الى 5 ميغاواط، وقد يطلب إجراء للحصول على درجة مرضية من الآفة في حالة مختلفة.
3. تقييم المحفظة عائق Lesioning
- السلوكية اختبار وتجميع الحيوان
- أداء بيليه واحد الوصول إلى المهام كما وصفها يشاو وآخرون. 14 لتقييم العجز الحركي للforelimb كل يوم لمدة 1 أسبوع بعد النمذجة السكتة الدماغية. أداء مهمة واحدة بيليه الوصول(SPRT) في الحيوانات المقيدة الغذائية (90٪ من السيطرة على وزن الجسم) باستخدام زجاجي واضحة (30 × 15 × 35 سم ارتفاع) مع 1 سم فتحة واسعة والجرف الطعام في الجزء الأمامي من منتصف الجدار الأمامي.
- وضع بيليه على الرف الغذاء المقابل بشكل غير مباشر إلى forelimb المفضل. إدارة 20 الكريات في كل دورة لمدة 3 أسابيع.
ملاحظة: يتم تحديد عدد الناجح لSPRTs باعتباره متناول التي الحيوان القبضات بيليه الغذاء ويضعه في فمه دون إسقاطه. - حساب النتيجة كنسبة مئوية من الروافد الناجحة، والتي تم تعريفها من قبل الصيغة التالية:
ملاحظة: نحن تقسيم الحيوانات إلى 3 مجموعات: المجموعة الشام التي تديرها (مجموعة العمليات الخاصة)، مجموعة الانتعاش المعتدل (MRG)، وسوء مجموعة الاسترداد (PRG). إذا كان النتيجة SPRT ما بعد السكتة الدماغية> 50٪، فإننا نصنف الفئران كما MRG، مما يدل على وجود آفة كبيرة، ولكن الدمار لم يكتمل من تاr يمكنك الحصول. إذا كانت النتيجة SPRT ما بعد السكتة الدماغية هي <50٪ مقارنة مع النتيجة SPRT قبل السكتة الدماغية، ونصنف مجموعة كما PRG، مما يدل على lesioning الكامل في الهدف.
- تأكيد Neurohistological احتشاء Lesioning
- أداء نضح القلب مع بارافورمالدهيد 4٪ كما هو موضح سابقا. بعد الدماغ المصارف تماما في محلول السكروز 30٪، نفذ باجتزاء الاكليلية في سمك 10 ميكرون وفاصل من 200 ميكرون باستخدام مشراح أو مبضع بردي 4.
- وصمة عار مع H & E، نيسل، Luxol سريع الأزرق لتقييم الأداء، خيط عصبي بروتين-L أو الغروية بروتين حمض ييفي تلطيخ ومراقبة النتائج النسيجية لتحديد شدة الضوء المثلى التي يمكن أن تغطي كامل اتساع الكبسولة الداخلية في المنطقة المستهدفة لمراقبة تلطيخ 4،17.
- باستخدام برنامج ImageJ، وقياس حجم منطقة احتشاء photothrombotic من الكبسولة الداخلية على الشرائح الدماغ.
- لقياس حجم منطقة احتشاء، إطلاق "يماغيج 'البرمجيات. لفتح ملفات لتكون مكدسة، 'صورة لالأكوام "اختر (' صورة '→" الأكوام "→" صورة لأكوام'). تعديل اسم الملف وحدد "تعيين المقياس '(' تحليل '→" تعيين مقياس') لتعديل الحجم.
- في 'الإضافات'، اختر "قياس الأكوام" لحساب حجم أو مساحة من الصور. إدراج فاصل مسافة 2 الصور إلى "شريحة تباعد. جعل رسم من العائد على الاستثمار (منطقة مهمة) من كل الصور وانقر على 'قياس'.
ملاحظة: البرنامج "يماغيج 'تلقائيا بحساب مساحة وحجم كل صورة والحجم الكلي منها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويهدف الطريقة المعروضة هنا لإنشاء احتشاء المحفظة مقيدة بعجز محرك مستمر. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحديد الهدف في كبسولة الداخلية في الخطوة ما قبل الجراحة بشكل صحيح. لم يتم تسويتها تعيين جسدي التوضع من الألياف الهرمية في الكبسولة الداخلية حتى الآن. لتحديد الهدف في كبسولة الداخلية بشكل صحيح، ويجب أن توضح المنطقة forelimb. حقنة من AAV-GFP في منطقة forelimb من القشرة الحركية يمكن أن تتبع محاور عصبية من الألياف الهرمية في الكبسولة الداخلية (الشكل 1). استشفاف العصبية الأخرى، مثل البيروكسيديز أمين ديكستران (BDA)، يمكن أن تستخدم لنفسه غرض. إحداثيات المجسم الهدف داخل كبسولة الداخلية يمكن توضيحها من خلال تتبع التوقعات محور عصبي التي تنشأ من منطقة forelimb من القشرة الحركية إلى كبسولة الداخلية.
r.within الصفحات = "1"> 
يتم عرض الشكل 1. تحديد منطقة Forelimb في كبسولة الداخلية بعد 2 أسابيع من حقن AAV-GFP. ألياف محور عصبي-transduced GFP التي نشأت من منطقة forelimb من القشرة الحركية في النواة البطنية الوحشية من المهاد (الأسهم) و الجزء الذيلية من الكبسولة الداخلية (رأس السهم). خط منقط يشير كفاف من الكبسولة الداخلية، والأرقام تشير إلى مسافات من bregma. فرس النهر، وقرن آمون. وحدة المعالجة المركزية، putamen المذنبة. VL، نواة البطنية الوحشية. IC، كبسولة الداخلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
قد تكون شدة الضوء الأمثل مختلفة اعتمادا على سلالة ووزن الجسم من الحيوان وأنواع وأقطار الألياف البصرية. ولذلك، ينبغي أن تحدد شدة الضوء الأمثل مسبق على حدة إلى احتشاء lesioning التجربة الرئيسية. باستخدام الإجراء photothrombotic، وشدة الضوء ويمكن زيادة تدريجيا حتى يغطي مدى الآفة اتساع كامل من الكبسولة الداخلية دون تدمير الهياكل المادة الرمادية المجاورة (الشكل 2). ويمكن التحقق من شدة الضوء الأمثل بمقارنة مدى النسيجي الآفة احتشاء والمواقع.
الشكل 2. مدى احتشاء الآفات عبر متفاوتة شدة ضوء الليزر من 2 ميغاواط إلى 5 ميغاواط 2 أسابيع بعد Photothrombotic Lesioning. وتعتبر كثافة الضوء المثلى ما بين 3 ميغاواط و 4 ميغاواط في هذا الإعداد التجريبية. تشير الأسهم الآفة احتشاء./53281/53281fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
نحن نفضل استخدام بطاقات الهوية التي يرد الألياف البصرية في أنبوب معدني رفيع (إبرة في العمود الفقري). الألياف البصرية قد تنتج الحد الأدنى من تشتت الضوء من جانب والألياف، والتي من المرجح أن تولد الضرر العصبي إضافية على طول الجهاز الألياف البصرية. تغطية من الألياف البصرية هو مفيد أيضا لمنع الانحناء من الألياف البصرية في أهداف أعمق، وكذلك إرفاق بطاقات الهوية إلى الإطار المجسم (الشكل 3).
الشكل 3. بناء واجهة البصرية العصبية (بطاقات الهوية). (أ) قطع من إبرة في العمود الفقري. (ب) التعرية من الألياف البصرية. (ج و د) يتم إدخال أنبوب معدني رسو علىتجريد الألياف البصرية وضيقة لتأمين الألياف الضوئية لمحور إبرة في العمود الفقري. يتم إدخال (ه) الألياف الضوئية الايبوكسي وأضاف في إبرة في العمود الفقري. (و) هو صلابة والايبوكسي عند 100 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. هو المشقوق (ز) من الألياف البصرية في غيض من إبرة في العمود الفقري. ومصقول (ح) الألياف البصرية. يتم قياس (ط) شدة الضوء من غيض من الألياف البصرية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فإن الإجراء photothrombotic تنتج الآفات استنساخه والمواقع مع ~ 70٪ النجاح في إعاقة حركية. نموذجية المحفظة احتشاء الآفة تشمل البعد بطني ظهراني من ألياف المحفظة الشكل (4A). وعلاوة على ذلك، فإن آفة احتشاء تمتد على طول المحور الأمامي الخلفي من الكبسولة الداخلية بسبب زيادة تشتت الضوء داخل الألياف المحفظة(الشكل 4B) والجهاز البصري تقع تحت الكبسولة الداخلية يتكون من ألياف المادة البيضاء. وبالتالي، غالبا ما تلف من قبل التشعيع من شدة الضوء زيادة. مطلوبة مسلسل أقسام وتلطيخ لتأكيد وحدة التخزين بأكملها ومدى احتشاء. بلغ حجم احتشاء 0.63 ± 0.37 ملم 3. لتقييم تدمير المحفظة الألياف، خيط عصبي وLuxol البقع سريع الأزرق لتقييم الأداء مفيدة.
الرقم 4. المظهر المجهري المحفظة عائق 3 أسابيع بعد Photothrombosis. مظهر المجهري للاحتشاء المحفظة بعد 3 أسابيع photothrombosis. أ) شريحة الدماغ من قسم الاكليلية في الدماغ الفئران. رأس السهم يشير الجهاز إبرة تحتوي على الألياف الضوئية في المهاد وتصل إلى كبسولة الداخلية. ب) المسلسل نيسل تلطيخ للالاكليلية شرائح الدماغ showi نانوغرام مدى كاملة من آفة احتشاء في الكبسولة الداخلية. النصال تشير الآفة احتشاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
نجاح النمذجة يمكن تقييمها من خلال اختبار السلوك باستخدام بيليه واحد الوصول المهمة. أداء السلوكي بعد 1 أسبوع بعد lesioning احتشاء هو دليل جيد لتأكيد lesioning دقيقة، الذي يرافق انخفاض مستمر وملحوظ من SPRT على الرغم من بيليه واحد يوميا يصل إلى تدريب (الشكل 5). وبمجرد يظهر العجز السيارات في PRG، استمر عجز عصبي خلال فترة شهر 3 من المراقبة. ان حركة الشام التي تديرها لا تظهر انخفاضا كبيرا في أداء SPRT بعد العملية.
تحميل / 53281 / 53281fig5.jpg "/>
الرقم 5. التغييرات في واحدة بيليه الوصول إلى عشرات بعد المحفظة Infart 4،20. أظهرت المجموعات التجريبية (PRG وMRG) بشكل كبير وانخفضت درجات على الفور بعد lesioning احتشاء مقارنة مع المجموعة الشام التي تديرها (مجموعة العمليات الخاصة). وMRG يسلك الانتعاش التدريجي للأداء SPRT، في حين أن PRG يسلك إعاقة حركية مستمرة مع مرور الوقت. المرجع، photothrombotic احتشاء lesioning. PRG، وسوء مجموعة الإنعاش؛ MRG، مجموعة الانتعاش المعتدل. تم تحديد إحصائيا باستخدام تحليل قياس المتكررة من الفروق. + مجموعة العمليات الخاصة مقابل MRG. * مجموعة العمليات الخاصة مقابل PRG. البيانات هي وسائل ± ووزارة شؤون المرأة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نموذج احتشاء المحفظة المعروضة هنا يدل على آفة المستهدفة يعانون من إعاقة حركية ملحوظ ومستمر في وظيفة forelimb. وقد أثبتت النماذج السابقة من السكتة الدماغية المحفظة تحت القشرية على درجة كافية من إعاقة حركية وسرعة 6،8،9 عملية الاسترداد. في هذا المعنى، وهذا النموذج تمثل الحالات السريرية المحفظة احتشاء التي تظهر اضطراب وظيفي طويل الأجل.
الخطوات الأكثر أهمية في تطوير نموذج المحفظة احتشاء مقيدة هي: 1) تحديد التمثيل جسدي التوضع من جزء من الجسم تهدف إلى تعطيل وظيفة داخل كبسولة الداخلية بشكل صحيح؛ 2) لتحديد شدة المثلى من الليزر الأخضر، والتي يمكن أن تدمر اتساع كامل من الكبسولة الداخلية مع زحف الحد الأدنى من الهياكل المادة الرمادية المجاورة. و3) على وجه الدقة مكان الألياف البصرية في بنية الهدف. على الرغم من أن التقنيات المعروضة يمكن أن تحدث تطويقد المحفظة نموذج احتشاء مع معدل تكرار عالية (> 70٪)، والاختلافات الصغيرة في استهداف ودرجة اكتمال الدمار الذي يغطي اتساع كامل من الكبسولة الداخلية قد تكون مسؤولة عن العجز الحركي المختلفة.
يقع الجهاز القشري في النصف الأمامي من الطرف الخلفي في الكبسولة الداخلية في البشر على الرغم من الجدل التنظيم جسدي التوضع 15. على النقيض من ذلك، لم يكن هناك أي تصنيف أو ما يعادلها من توضيح مفصل للمنظمة جسدي التوضع من الكبسولة الداخلية في القوارض. نقص المعرفة بشأن تنظيم جسدي التوضع وغالبا ما يؤدي إلى أهداف غير صحيحة lesioning احتشاء داخل كبسولة الداخلية مع نتائج محرك مختلفة بين نماذج المحفظة احتشاء. ومع ذلك، حددنا محاور-transduced GFP في الجزء الذيلية من الكبسولة الداخلية، والتي من المرجح تمثل مسار الألياف forelimb السيارات. وعلاوة على ذلك، lesioning هذا demonstrat منطقةإد عجز ملحوظ ومستمر من مهارة الوصول forelimb. ولذلك، فإننا نوصي الجزء الذيلية من الكبسولة الداخلية لlesioning المجسم لتحسين صحة النموذج المحفظة احتشاء.
قبل تعديل شدة الضوء إلزامي لانتاج حد موحد للآفة احتشاء في نماذج السكتة الدماغية بسبب سلالة الحيوان، ووزن الجسم، ومصدر وأنواع خفيفة من بطاقات الهوية قد تولد أحجام مختلفة من احتشاء. ولذلك، ينبغي إجراء التجارب الأولية باستخدام شدة الضوء المختلفة في حيوانات التجارب مع نفس السلالة ووزن الجسم حتى يتحقق الآفة احتشاء مرضية مع شدة الضوء الحد الأدنى.
شدة الضوء القوية التي يمكن أن تدمر اتساع كامل من ألياف المحفظة يعتبر (الأمامي الخلفي ومدى ظهري بطني) الذي يتوافق مع منطقة forelimb بأقل ضرر للهياكل المجاورة لتكون شدة الضوء الأمثل. وforelimيحدها منطقة (ب) من الكبسولة الداخلية من قبل المهاد متفوق والجهاز البصري دون المستوى. لذلك، يجب أن يكون عمق بطاقات الهوية الإدراج دقيقة لتدمير مدى كامل من IC في اتجاه ظهري بطني، مع الحفاظ في نفس الوقت من الهياكل المجاورة الأعلى والأدنى. وضع دقيق من بطاقات الهوية النتائج في التدمير غير الكامل للIC، الأمر الذي يؤدي إلى الشفاء السريع من العجز الحركي نتيجة لاللدونة متشابك من الألياف هرمي المتبقية في كبسولة الداخلية. في الامتحانات النسيجية المسلسل، وكان العامل الأكثر التباس في تحريض عجز المحرك المستمر المواقع غير صحيح من بطاقات الهوية، الأمر الذي يؤدي إلى عدم تدمير اتساع كامل من PLIC 4،16. ولذلك، ينبغي إيلاء اهتمام دقيق للوصول إلى الهدف الصحيح. في الآونة الأخيرة، ذكرت بلازي وآخرون أن يدوم العجز نقية المحرك يمكن أن تنتج من خلال جعل آفة احتشاء في كبسولة الداخلية الخلفيةباستخدام endothelin-1 (ET-1) (17). ومع ذلك، ET-1 قد تدمر بنية المادة الرمادية المجاورة عن طريق نشر ET-1.
الاختبار السلوكي هو المعيار يتسن على الفور الاتصال في المختبر لتقييم تشكيل الآفة احتشاء في الكبسولة الداخلية. ومع ذلك، فمن المستحسن تقييم الأداء الحركي بعد أسبوع واحد lesioning احتشاء لتقسيم الحيوانات إلى مجموعات الانتعاش المعتدلة والفقيرة. وقد عرفت انتعاشا معتدلا حيث أن زيادة في درجة الأداء> 50٪ مقارنة مع النتيجة قبل lesioning، في حين تم تعريف الفقراء الانتعاش كما استرداد <50٪. ومن بين الاختبارات السلوكية forelimb السيارات، وبيليه واحد الوصول مهمة هي واحدة من أكثر الاختبارات حساسة لكلا القياسات الكمية والنوعية من العروض الحركية الناجمة عن السكتة الدماغية 14. مهمة يقيس كميا نجاح الوصول وفي نفس الوقت توفير تحليلا لاستخدام forelimb، مثل استيعاب واسترجاع المواد الغذائيةبيليه. التحليل النوعي للحركة الوصول مفيد أيضا للتمييز نوعية الانتعاش السكتة الدماغية عن طريق التمييز الانتعاش وظيفية حقيقية أو التعويض 20. هنا، وصفنا لفترة وجيزة القياس الكمي للSPRT. ومع ذلك، يوصى التحليل النوعي باستخدام التصوير والتسجيل بناء على تحليل الإطار حسب الإطار لمزيد من التحليل المفصل.
التقنيات المعروضة هنا ليس من الضروري أن يقتصر على تحريض مقيدة النمذجة المحفظة احتشاء. ويمكن تطبيق هذه التقنية لتحريض آفة احتشاء في مناطق أخرى من المادة البيضاء، مثل الجسم الثفني، commissures الأمامية وربط الألياف العصبية بين الهياكل. ومن المرجح أن تدمير البنى المستهدفة بأقل ضرر للهياكل المجاورة الجمع بين تقنية صغيرة بطاقات الهوية وphotothrombotic بناء على الخصائص البصرية من المادة البيضاء. على سبيل المثال، احتشاء الجوبي يمكن تنتج بسهولةد باستهداف هياكل تحت القشرية ذات الصلة الوظائف الحركية والمعرفية، والذاكرة. عندما هيكل هدف كبير، قد تكون هناك حاجة الإدراج متعددة من بطاقات الهوية والاستهداف المختلفة والزاوية مسارات لإنتاج مدى المرجوة من الآفات.
هناك العديد من القيود في هذا الأسلوب. تقنية كافية للتدليل على ذلك من lesioning احتشاء في PLIC وانتعاش لاحق. ومع ذلك، لا يعكس هذا النموذج الطيف الكامل من WMS الإنسان بسبب تدمير photothrombotic من المادة البيضاء يختلف قليلا من WMS الإنسان. ونتيجة لذلك، قد نتائج التصوير بالرنين المغناطيسي العصبية أو تظهر ملامح مختلفة في مرحلة مبكرة من lesioning photothrombotic. لذلك، هذا النموذج يجب استخدامها بشكل مناسب لمقايضة المزايا للنموذج وعيوب. من الناحية الفنية، وليس كل العمليات الجراحية يمكن أن تنتج العجز الحركي ملحوظ ودائم في هذا النموذج لأنه يتطلب إجراءات دقيقة للغاية. Specifically، يطلب يد المدربين وذوي الخبرة لإنتاج استنساخ عالية في توليد هذا النموذج.
في الختام، فإن الجمع بين استخدام تقنية photothrombotic، والتحسين من شدة الضوء، والاستهداف الصحيح هو تقنية مفيدة لإنتاج نموذج المحفظة احتشاء مقيدة. وهذا النموذج سوف يكون مفيدا ليس فقط لدراسة WMS في السلوكية، والدوائر، ومستويات الخلايا ولكن أيضا لتقييم جدوى التدخلات العلاجية والتأهيلية الجديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة من معهد هندسة النظم الطبية (iMSE) و-GIST معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا الصندوق التعاوني (K04592) من GIST ومن قبل برنامج أبحاث العلوم الأساسية من خلال جبهة الخلاص الوطني من كوريا بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (جبهة الخلاص الوطني، 2013R1A2A2A01067890).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
| Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
| Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
| Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
| Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
| Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m |
|
| Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
| Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS |
|
| Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
| Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
| Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
| Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
| Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
| Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
| Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
| AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
| Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
| Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
| Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
| Hand Piece Drill | Seshin | ||
| Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
| Ketoprofen | UNIBIOTech |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2012 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 125, 2-220 (2012).
- Debette, S., Markus, H. S. The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging: systematic review and meta-analysis. Bmj. 341, 3666 (2010).
- Zhang, K., Sejnowski, T. A universal scaling law between gray matter and white matter of cerebral cortex. PNAS. 97 (10), 5621-5626 (2000).
- Kim, H. S., et al. A rat model of photothrombotic capsular infarct with a marked motor deficit: a behavioral, histologic, and microPET study. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 683-689 (2014).
- Kleim, J. A., Boychuk, J. A., Adkins, D. L. Rat models of upper extremity impairment in stroke. ILAR J. 48 (4), 374-384 (2007).
- Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat. Behav Brain Res. 169 (2), 206-211 (2006).
- He, Z., et al. Definition of the anterior choroidal artery territory in rats using intraluminal occluding technique. J Neurol Sci. 182 (1), 16-28 (2000).
- Tanaka, Y., et al. Experimental model of lacunar infarction in the gyrencephalic brain of the miniature pig: neurological assessment and histological, immunohistochemical, and physiological evaluation of dynamic corticospinal tract deformation. Stroke. 39 (1), 205-212 (2008).
- Shibata, M., Ohtani, R., Ihara, M., Tomimoto, H. White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion. Stroke. 35 (11), 2598-2603 (2004).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann Neurol. 17 (5), 497-504 (1985).
- Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40 (1), 248-253 (2009).
- Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Handbook of biomedical optics. 83, CRC Press. Boca Raton, Fl. (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Whishaw, I. Q., Whishaw, P., Gorny, B. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a movement rating scale. J Vis Exp. (18), e816 (2008).
- Jang, S. H. A review of corticospinal tract location at corona radiata and posterior limb of the internal capsule in human brain. NeuroRehabilitation. 24 (3), 279-283 (2009).
- Kim, D., et al. Longitudinal changes in resting-state brain activity in a capsular infarct model. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (1), 11-119 (2014).
- Blasi, F., Whalen, M. J., Ayata, C. Lasting pure-motor deficits after focal posterior internal capsule white-matter infarcts in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (6), 977-984 (2015).
- Metz, G. A., Antonow-Schlorke, I., Witte, O. W. Motor improvements after focal cortical ischemia in adult rats are mediated by compensatory mechanisms. Behavioural brain research. 162 (1), 71-82 (2005).
