Summary
Dit manuscript beschrijft een modellering techniek van kapselvorming infarct. Hier hebben we gebruik gemaakt van een gemodificeerde fototrombotisch techniek met een lage intensiteit van het licht na de pre-operatie doel mapping. Met behulp van deze techniek, hebben we een omgeschreven kapselvorming infarct model met aanhoudende motorische handicap.
Introduction
Tot voor kort was de "grijze stof beroerte (GMS) modellen" zijn uitsluitend gebruikt om de pathofysiologie van beroerte te begrijpen en de ontwikkeling van nieuwe behandelingen leiden. 25% van alle beroertes 1,2 - Er is echter een toenemende prevalentie van beroerte die subcorticale witte stof van invloed op bij oudere personen, waarvan 15 vormt geweest. Talrijke studies zijn uitgevoerd met betrekking tot een beroerte met behulp van GMS-modellen, terwijl er weinig studies die witte stof beroerte (WMS) modellen hebben gebruikt. Witte stof bij knaagdieren is aanzienlijk minder dan de witte stof bij mensen of primaten. Bijgevolg is het moeilijker om selectief te openen en te vernietigen de doelgebieden in de witte stof 3. Bovendien zijn er geen efficiënte instrumenten ontwikkeld tot op heden om selectief vernietigen van de geplande omvang van gerichte witte stof. Daarom is er een gebrek aan geschikte modellen voor studie van witte stof slagen geweest.
Animal stroke modellen worden vaak gebruikt om de voortgang van motorisch herstel voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische werkwijzen en revalidatie controleren. Het is ideaal om een diermodel dat een langdurige neurologische uitval overeenstemmend met de anatomische veranderingen aangetoond in menselijke beroerte 4,5 vertoont gebruiken. In dit verband kan snel herstel van het tekort op de motor en brede betrokkenheid van de hersenen na infarct laesie niet realistisch in het nastreven van een beroerte onderzoek. Previous capsulaire infarct modellen zijn door de occlusie van de arteria carotis interna of anterior choroïdale bloedvaten en verspreiding van endotheline-1 (ET-1) in de capsula interna 6-9. Toch slagader occlusie vereist een zorgvuldige dissectie van de slagaders, maar het produceert een breed gebied van infarct letsel, met inbegrip van de interne capsule, zonder blijvende gedrags tekorten. Bovendien, ET-1 was niet diffuus om het achterste been van de interne capsule volledig te vernietigen, en dus minder uitgesproken of aanhoudende behavioral tekort.
Een fototrombotisch infarct model is op grote schaal gebruikt om verschillende soorten infarct laesies in de cortex en subcorticale structuren 10 genereren. De techniek omvat intraveneuze toediening gevolgd door focale belichting, wat leidt tot bloedplaatjesaggregatie in de kleine bloedvaten en de vorming van laesies 10 infarct. Fototrombotisch techniek is uitgebreid gebruikt om GMS laesies te creëren, terwijl het is zelden gebruikt voor WMS laesies 5,11 te genereren. Voor deze techniek is een combinatie Bengaals rood en lichtbestraling aangetoond bruikbaar zijn bij de vernietiging van de doelstructuur worden, waardoor overeenkomstige functionele gebreken. Het belangrijkste element van de fototrombotisch techniek bestraling met licht, omdat het de grootte van infarct laesies bepaalt. Bestraling met licht leidt tot verschillende effecten op grijze en witte stof, vanwege de verstrooiing van het licht is meer dan 4 keer hoger in wit matter vergelijking met grijze stof 12; Dienovereenkomstig, als de lichtintensiteit een voldoende lage straling (<1140 mW / mm 2), kan men de uitbreiding te beperken tot die fototrombotisch laesie van invloed op de mate van de witte stof (bijv., Interne capsule). Bijvoorbeeld, kan het licht van de hogere energie infarcten zowel in grijze en witte stof te induceren, maar lagere energie licht mag photothrombosis veroorzaken alleen in witte stof. Bovendien is de penetratie van lichtenergie zeer beperkt. Ongeveer 99% van de lichtenergie verloren dan 1 mm vanaf de lichtbron 13. Daarom wordt verwacht dat nauwkeurig gerichte, onderste energy light induceert photothrombosis alleen in de witte stof met een minimale aantasting van de aangrenzende grijze stof.
Hier beschrijven we een nieuwe methode om infarct laesies in de voorpoot gebied van de interne capsule bij knaagdieren. We beschrijven de werkwijze voor identificatie van de voorpoot in de interne capsule, de technologie van lichtbestraling, zoals de aanpassing en toediening van licht, en het genereren van een infarct laesie. We beschrijven ook gedragstesten gebruikt om de volledigheid van de capsulaire modelleren evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen van Gwangju Institute of Science and Technology (GIST), en alle procedures werden door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op GIST goedgekeurd.
1. Pre-laesie Stappen
- Identificatie van de voorpoot in de interne capsule met behulp van AAV-GFP
- Huis en handvat Sprague Dawley ratten (~ 400 g, 11-13 weken) in overeenstemming met de institutionele en nationale richtlijnen.
- Steriliseer alle chirurgische instrumenten en de elektroden met behulp van een geschikte sterilisator (Steam of Plasma sterilisator). Gebruik stoomsterilisator bij 121 ° C en instelling van 30 minuten voor sterilisatie en 30 min voor droge.
- Verdoven het dier met een mengsel van ketamine hydrochloride (100 mg / kg) en xylazine (7 mg / kg) via een intramusculaire injectie. Controleer de diepte van de anesthesie door poot knijpen. Handhaving van de lichaamstemperatuur bij 37,5 ± 0,5 ° C door middel van een verwarmingselement onderhet lichaam van het dier.
- Plaats het dier in een stereotactische frame met behulp van een oor bar en mond houder.
- Reinigen en ontsmetten van de chirurgische site met 70% alcohol en povidonjodium oplossing. Infiltreren 2% lidocaïne hydrochloride onder de hoofdhuid in de beoogde schedel incisie gebied om de intra-operatieve pijn te verminderen.
- Toepassen dierenarts oogzalf om uitdroging van de ogen te voorkomen. Plaats een steriel laken over de dieren naar de operationele sites. Handhaaf alle procedures in steriele omstandigheden.
- Voer een middellijn schedel incisie van 2 cm met behulp van een scalpel en trekken de huid bilateraal met draad oprolmechanismen. Droog de schedel met wattenstaafjes en 30% waterstofperoxide.
- Maak een gat met behulp van een hand stuk boor over de voorpoot gebied van de motorische cortex (AP: 2,5 uit bregma, ML: ± 2,5 vanaf de middenlijn) en verwijder het darmkanaal met micro-currette voor virus-injectie.
- Ontdooi de AAV-GFP (2 x 10 12 virus moleculen / ml) op ijs en de belasting 1 ui van hetvirus in een 10 gl spuit. Plaats de spuit op de stereotactische frame.
- Verplaats de naald op de vooraf gemaakte gat en laat de naald 1 mm diep in de dura.
- Injecteer het virus langzaam (0,1 ul / min) met een hoge precisie micropomp en laat de naald op zijn plaats gedurende nog 10 minuten om het virus te diffunderen.
- Na het reinigen van de operatieve plaats met een zoutoplossing irrigatie, zet de wond met 3-0 nylon hechtdraad; laat de rat uit de stereotactische frame en overbrengen naar een herstel kamer. Dien ketoprofen (2 mg / kg) via een intramusculaire injectie voor postoperatieve pijnbestrijding.
- Handhaaf de lichaamstemperatuur (37 ° C) met verwarmingselement en beheren tweede generatie cephems klasse antibiotica (0,1%, 1 ml) via een intramusculaire injectie en 2% lidocaïne hydrochloride subcutaan nodig. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn herwonnen te onderhoudenborstligging. Enkel huis van het dier tot volledig herstel.
- Na 2-3 weken herstel diep verdoven de rat met een overdosis ketamine hydrochloride (300 mg / kg) via een intramusculaire injectie in de kap. Controleer of de dood van de dieren door een gebrek aan teen knijpen respons, hartslag en ademhaling. Plaats de rat rugligging in de kap.
- Open de buikholte via een 'Y'-vormige insnijding aan de borstholte geopend. Nauw klem de afdalende aorta met een hemostaat en scheuren de rechter atrium van de rat hart voor het bloed drainage. Initiëren perfusie in de linker hartkamer met koude 1% paraformaldehyde gedurende 5 min (10 ml / min), gevolgd door 4% paraformaldehyde gedurende 30 min (10 ml / min).
- Verwijder de rat hoofd van karkas met behulp van een schaar. Maak een middellijn incisie van de nek tot de neus en verwijder de nekspieren met behulp van schaar of rongeur zodat schedel wordt blootgesteld. Voorzichtig ontleden de schedel botten en Duras uit de hersenen.
- Pak de hersenen en plaats de hersenen van de rat in een 50 ml conische buis 's nachts gevuld met 4% paraformaldehyde. De volgende dag, was de hersenen met 1x PBS 3 keer en plaats deze in een 30% sucrose-oplossing.
- Wanneer de hersenen volledig zinkt naar de bodem van de 30% sucrose oplossing, plaats de hersenen in de cryomold met OCT verbinding bij -20 ° C in cryotoom. Snijd de hersenen frontale vlak bij een dikte van 40 urn en een interval van 200 um.
- Voer GFP immunohistochemie kleuring met behulp van de slide-methode 14. Toepassen primaire antilichaam (1: 200 van anti-Green Fluorescent Protein, konijn IgG-fractie) aan hersencoupes nacht bij 4 ° C. Op Dag 2, wassen met 1% fosfaat gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (PBST) oplossing 3 maal en toepassen secundair antilichaam (1: 500 van geit-anti-konijn IgG (H + L)) gedurende 1 uur. Spoel de dia met 1% PBST 3 keer. Plaats het deksel glas op de hersenen slice.
- Met behulp van een fluorescentiemicroscoop (excitatiegolflengte470 nm, emissiegolflengte 525 nm, vergroting 5x), acht de AAV-GFP getransduceerde axonen in de interne capsule. Vergelijk de locaties van getransduceerde axons de Rat Brain Atlas 15 de stereotactische coördinaten van het getransduceerde axonen bepalen
- Pre-laesie Aanpassing van de lichtintensiteit Geschikt voor Capsular Infarct Modeling
- De bouw van de Optical Neural Interface
- Snij een juiste lengte (4 cm) van een 27 gauge spinale naald met een stift in met behulp van een scherpe boor.
LET OP: Het snijden kan comprimeren en plet de spinale naald; Verwijder de stilet en poets de spinale naald naar de geplette gedeelte van de spinale naald te verwijderen en de binnenste kaliber van de spinale naald te handhaven. - Strip een geschikte lengte (10 cm) van de mantel van de optische vezel (125 urn met een 62,5 urn kern) van een zijde patch cord.
- Plaats de unjacked optische fiber in de metalen buis (buitendiameter: 3,8 mm, binnendiameter: 3,3 mm Lengte: 17 mm), dat vervolgens wordt geklemd rond de vezel. De metalen buis is nuttig om de ruimte tussen de optische vezel en de naaf van de spinale naald vullen. Klem de onderste 1/2 van de metalen buis met een perser tweemaal.
- Breng de warmte hardbare epoxy op de optische vezel en steek de optische vezel in de spinale naald. Toepassen extra epoxy om de lege ruimte in de naaf. Hard de epoxy gedurende 20 minuten bij 100 ° C voor stabiele bevestiging.
- Splijten van de optische vezel die uitsteekt uit de spinale naald en poets de optische vezel aan het uiteinde van de spinale naald behulp van diamant geklots (polijsten) vellen.
- Sluit de FC / PC connectordeel uit pleister aan op de koppeling van groene lasersysteem en meet de lichtintensiteit van de punt van de optische vezel via digitale optische vermogen en energiemeter.
- Snij een juiste lengte (4 cm) van een 27 gauge spinale naald met een stift in met behulp van een scherpe boor.
- De bouw van de Optical Neural Interface
2. PhotothromBotic Infarct maligne en in de interne Capsule
- Steriliseer alle chirurgische instrumenten en de elektroden met behulp van een geschikte sterilisator (Steam of Plasma sterilisator). Gebruik stoomsterilisator bij 121 ° C en instelling van 30 minuten voor sterilisatie en 30 min voor droge.
- Verdoven het dier (~ 400 g, 11-13 weken) met een mengsel van ketamine hydrochloride (100 mg / kg) en xylazine (7 mg / kg) via een intramusculaire injectie. Controleer de diepte van de anesthesie door poot knijpen. Handhaaf de lichaamstemperatuur bij 37,5 ± 0,5 ° C over een verwarmingselement onder het lichaam van het dier.
- Plaats het dier in een stereotactische frame met behulp van een oor bar en mond houder.
- Reinigen en ontsmetten van de chirurgische site met 70% alcohol en povidonjodium oplossing. Infiltreren 2% lidocaïne hydrochloride onder de hoofdhuid in de beoogde schedel incisie gebied om de intra-operatieve pijn te verminderen. Toepassen dierenarts oogzalf om uitdroging van de ogen te voorkomen.
- Breng een steriel laken over de eeniMAL en bloot de operationele sites. Handhaaf alle procedures in steriele omstandigheden.
- Voer een middellijn schedel incisie van 2 cm en trekken de huid bilateraal met draad oprolmechanismen. Droog de schedel met katoen swaps en waterstofperoxide.
- Stel de hoogte van de neus klem totdat de bregma en lambda zijn afgestemd op hetzelfde niveau. Kritische stap: Deze afstemming is essentieel te kunnen benaderen een diepere structuur, zoals het uitvoeren van een infarct laesie in de inwendige capsule hoofdexperiment.
- Maak een gat (diameter: 2 mm; AP: -2,04 vanaf bregma; ML: ± 3,0 vanaf de middellijn) met behulp van een boor om photothrombosis induceren.
- Polijsten en reinigen van de optische vezel tip van de optische interface. Bevestig de ONI de stereotaxisch frame zonder te buigen. Controleer de punt van de ONI en veeg het duidelijk voor en na het inbrengen van de optische interface.
- Meet de laser intensiteit van de punt van de optische vezel voorafgaand aan het inbrengen van de optical interface naar de doelplaats van de rattenhersenen. Stel de laser intensiteit 3,5 mW, zoals bevestigd door pre-operatie stappen aan het uiteinde van de optische vezel.
- Steek de ONI in het doelgebied van de interne capsule (-7,8 mm bevestigd uit de pre-operatie stap) door het boorgat.
- Handhaving van de lichaamstemperatuur bij 37,5 ± 0,5 ° C tijdens photothrombosis. Een lagere lichaamstemperatuur produceert niet de verwachte omvang van infarct. Injecteren Rose Bengal (2 ml / kg) via de staartader.
- Schakel de 532 nm groene laser gedurende 90 sec 1 min na de Bengaals injectie. Na bestraling, de ONI verwijder voorzichtig uit de hersenen. Na het reinigen van de operatieve site, zet de wond zet de wond met 3-0 nylon hechtdraad; laat de rat uit de stereotactische frame en overbrengen naar een herstel kamer.
- Voor de schijn-geopereerde groep (SOG), het uitvoeren van een identieke-laesie maken procedure, met uitzondering van de injectie van zoutoplossing (0,2 ml / 100 g) in plaats van Rose-Bengalen.
- Handhaaf de lichaamstemperatuur (37 ° C) met verwarmingselement na operatie en beheren antibiotica (tweede generatie cefalosporine, 0,1%, 1 ml) via een intramusculaire injectie. Laat de dieren niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Mis postoperatieve dieren niet naar de kooi bezet door andere dieren tot volledig hersteld.
OPMERKING: Voorafgaande proef werd uitgevoerd op dezelfde procedures om de optimale lichtintensiteit van 1 mW vinden tot 5 mW en de procedure kan nodig zijn om een bevredigende mate van letsel verwerven andere conditie.
3. Evaluatie van Capsular Infarct maligne
- Behavioral Testen en Animal Groepering
- Voer één pellet bereiken taken zoals beschreven door Whishaw et al. 14 om het tekort motor van de voorpoot dagelijks evalueren 1 week na de beroerte modelleren. Voer een enkele pellet bereiken taak(SPRT) bij voedselproducerende dieren beperkt (90% van de controle lichaamsgewicht) met schoon plexiglas (30 x 15 x 35 cm hoogte) met een 1 cm brede sleuf en een voedselplank in de voorzijde van het midden van de voorwand.
- Plaats een pellet op het voedsel plank schuin contralaterale naar de gewenste voorpoot. Dien 20 pellets per sessie voor 3 weken.
LET OP: Een succesvolle aantal SPRT wordt gedefinieerd als een bereik waarin het dier grijpt een levensmiddel pellet en zet het in de mond zonder te laten vallen. - Bereken de score als een percentage geslaagde bereikt, die wordt gedefinieerd door de volgende formule:
LET OP: Wij verdelen dieren in 3 groepen: de schijn-geopereerde groep (SOG), gematigd herstel groep (MRG), en een slechte herstel groep (PRG). Als een post-stroke SPRT score> 50%, classificeren we de ratten als MRG, die de aanwezigheid van een aanzienlijk letsel aangeeft, maar niet volledige vernietiging van de tarGebruik. Als de post-stroke SPRT score <50% in vergelijking met het pre-takt SPRT score, classificeren we de groep als PRG, die een volledige laesie in het doel aangeeft.
- Neurohistological Bevestiging van Infarct maligne
- Voer cardiale perfusie met 4% paraformaldehyde zoals eerder beschreven. Wanneer de hersenen volledig zinkt de 30% sucrose oplossing uitvoeren coronale coupes met een dikte van 10 urn en een interval van 200 pm met behulp van een microtoom of cryotoom 4.
- Vlek met H & E, Nissl, Luxol snel blauw-PAS, Neurofilament proteïne-L of gliale fibrillaire zuur eiwit kleuring en observeer de histologische bevindingen aan de optimale lichtintensiteit die de volle breedte van de interne capsule in het doelgebied om vlekken te observeren kan dekken bepalen 4,17.
- Behulp ImageJ software, meet het volume van het infarct fototrombotisch gebied van de interne capsule op de hersenen dia.
- Om het volume van infarct gebied te meten, de lancering van de 'ImageJ' software. Om de bestanden te openen te stapelen, selecteert u 'Image to Stacks' ( 'Image' → 'Stacks' → 'Image to Stacks'). Bewerk de bestandsnaam en selecteer 'Zet de schaal' ( 'Analyze' → 'Zet de schaal') op schaal bewerken.
- In 'Plugins', selecteer 'Measure Stacks' om het volume of het gebied van foto's te berekenen. Steek de afstand interval van 2 beelden in 'Slice Spacing'. Maak een tekening van de ROI (Region Of Interest) van alle beelden en klik op 'Measure'.
LET OP: De software 'ImageJ' berekent automatisch het gebied en het volume van elk beeld en het totale volume van hen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier gepresenteerde methode is bedoeld om een omschreven kapsel infarct met een aanhoudend tekort op de motor te creëren. Daarom is het essentieel om het doel correct te bepalen binnen de interne capsule pre-operatie stap. De somatotopic in kaart brengen van piramidale vezels in de interne capsule is niet geregeld tot op heden. Om het doel correct te identificeren binnen de interne capsule, moet de voorpoot gebied worden afgebakend. Een injectie van AAV-GFP in de voorpoot gebied van de motorische cortex kan de axonen van de piramidale vezels sporen in de capsula interna (figuur 1). Andere neurale tracers, zoals gebiotinyleerd dextran amine (BDA), kan worden gebruikt voor hetzelfde doel. De stereotactische coördinaten van het doel binnen de interne capsule kan worden toegelicht door het traceren van de axonale uitsteeksels die vanaf voorpoot gebied van de motorische cortex van de interne capsule.
Figuur 1. Identificatie van de voorpoot in de interne capsule 2 weken na de injectie van AAV-GFP.-GFP getransduceerde axonale vezels die afkomstig zijn van de voorpoot gebied van de motorische cortex wordt in ventrolaterale nucleus van de thalamus (pijlen) en het caudale deel van de interne capsule (pijlpunt). De gestippelde lijn geeft de contour van de interne capsule, en de nummers verwijzen naar de afstanden van bregma. Hippo, hippocampus; Cpu, caudatus putamen; VL, ventrolaterale kern; IC, interne capsule. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De optimale lichtintensiteit kan verschillen afhankelijk van de stam en het lichaamsgewicht van het dier en de soorten en diameters van optische vezels. Daarom moet de optimale lichtintensiteit wordt afzonderlijk bepaald voor de belangrijkste infarct laesie experiment. Met de fototrombotisch procedure kan de lichtintensiteit geleidelijk opgevoerd tot de omvang van de laesie bestrijkt de gehele breedte van de interne capsule zonder het vernietigen van de aangrenzende grijze stof structuren (Figuur 2). De optimale lichtintensiteit kan worden geverifieerd door vergelijking van de histologische mate van het infarct laesie en locaties.
Figuur 2. De omvang van het infarct lesies Across variërende intensiteit van laserlicht van 2 mW tot 5 mW 2 weken na fototrombotisch maligne. De optimale lichtintensiteit wordt geacht tussen 3 mW en 4 mW in deze experimentele opstelling. Pijlen geven het infarct laesie./53281/53281fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Wij vinden de ONI waarin de optische vezel is opgenomen in een dunne metalen buis (spinale naald) gebruikt. De optische vezel kan minimale lichtverstrooiing producten uit de zijde van de vezel, die waarschijnlijk extra neurale schade aan de optische vezel kanaal genereren. Omhulsel van de optische vezel is ook voordelig om het buigen van de optische vezel in dieper gelegen objecten te voorkomen en om de ONI hechten aan de stereotactische frame (figuur 3).
Figuur 3. De bouw van de optische-neurale Interface (ONI). (A) Het snijden van de spinale naald. (B) strippen van de optische vezel. (C & d) Het verankeren metalen buis wordt ingebracht viaontdaan glasvezel en krap om de optische vezel vast aan de naaf van de spinale naald. (E) De epoxy toegevoegde optische vezel wordt in de spinale naald. (F) De epoxy wordt uitgehard bij 100 ° C gedurende 20 min. (G) De optische vezel wordt gesplitst op het punt van de spinale naald. (H) De optische vezel wordt gepolijst. (i) De lichtintensiteit wordt gemeten vanaf de punt van de optische vezel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De fototrombotisch procedure zal reproduceerbaar laesies en locaties te produceren met ~ 70% succes in motorische stoornissen. Typische capsulaire infarct laesie omvat de ventrodorsale dimensie van capsulaire vezels (figuur 4A). Bovendien, het infarct laesie uitstrekt langs de achterwaartse as van de capsula interna wegens verhoogde lichtverstrooiing in de capsulaire vezel. (Figuur 4B) De optische-darmkanaal zich onder de interne capsule bestaat uit witte stof vezels; het is dus vaak beschadigd door bestraling van een toegenomen lichtintensiteit. Seriële secties en kleuring moeten het gehele volume en de omvang van infarct bevestigen. Het infarct volume was 0,63 ± 0,37 mm 3. Tot de vernietiging van het kapsel vezel, neurofilament evalueren en Luxol snel blauw-PAS vlekken zijn nuttig.
Figuur 4. Microscopische Verschijning van kapselvorming Infarct 3 weken na Photothrombosis. Microscopische verschijning van kapselvorming infarct 3 weken na photothrombosis. A) Brain stukje van coronale sectie in de hersenen van de rat. Arrowhead geven het darmkanaal van de naald met optische vezel in de thalamus en tot interne capsule. B) Serial Nissl kleuring van de coronale hersenen plakjes showi ng de gehele omvang van infarct laesie in de capsula interna. Pijlpunten geven de infarct laesie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het succes van het model kan worden geëvalueerd door gedragstesten met één pellet bereiken taak. De gedrags- vertonen na 1 week na het infarct laesie is een goede gids nauwkeurige laesie, waarbij de aanhoudende en sterke verslechtering van SPRT begeleidt ondanks de dagelijkse één pellet bereiken training (Figuur 5) te bevestigen. Nadat het tekort motor getoond in de PRG, de neurologische uitval bleef gedurende 3 maanden van observatie. -Sham geopereerde groep had de sterke daling van de SPRT prestaties na de operatie niet te laten zien.
uploaden / 53281 / 53281fig5.jpg "/>
Figuur 5. Veranderingen in de Single Pellet bereiken Scores na Capsular Infart 4,20. De experimentele groepen (PRG MRG) vertoonden significant verminderde scores direct na het infarct laesie vergeleken met schijn-geopereerde groep (SOG). De MRG vertoont een geleidelijk herstel van de SPRT optredens, terwijl de PRG vertoont aanhoudende motorische stoornis in de tijd. Op, fototrombotisch infarct laesie; PRG, slechte herstel groep; MRG, gematigd herstel groep. Statistische significantie werd bepaald met behulp van herhaalde meting analyse van afwijkingen. + SOG versus MRG; * SOG versus PRG. De gegevens zijn gemiddelden ± sem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het kapsel infarct hier gepresenteerde model toont een gerichte laesie met uitgesproken en aanhoudende motorische stoornis in voorpoot functie. Voorgaande modellen van subcorticale kapselvorming beroerte hebben een onvoldoende mate van motorische stoornissen en een snel herstel proces 6,8,9 aangetoond. In deze zin is dit model lijkt op de klinische capsulaire infarct gevallen die langdurige functionele beschadiging vertonen.
De meest kritische stappen in het ontwikkelen van een omschreven capsulair infarct model zijn: 1) de somatotopic representatie van het lichaamsdeel bedoeld om de functie in de capsula interna uitschakelen correct te identificeren; 2) de optimale intensiteit van de groene laser, die de volle breedte van de interne capsule kan vernietigen met minimale aantasting van aangrenzende grijze stof structuren te identificeren; en 3) om op juiste wijze de optische vezel in de doelstructuur. Hoewel de gepresenteerde technieken omschrijven kan inducerend kapselvorming infarct model met een hoge replicatie-tarief (> 70%), kunnen kleine verschillen in de targeting en de mate van volledigheid van de vernietiging die de hele breedte van de interne capsule goed voor verschillende motorische beperkingen.
De corticospinal landstreek is gelegen in de voorste helft van het achterste been in de interne capsule bij de mens, ondanks de controverse van somatotopic organisatie 15. Daarentegen is er geen gelijkwaardige kwalificatie of gedetailleerde toelichting van de somatotopic organisatie van de interne capsule bij knaagdieren geweest. Het gebrek aan kennis over de somatotopic organisatie leidt vaak tot verkeerde doelwit van infarct laesie binnen de interne capsule met verschillende motor uitkomsten onder kapselvorming infarct modellen. Echter gaf aan welke GFP getransduceerde axons in het caudale gedeelte van de interne capsule, die waarschijnlijk het pad van de voorpoot motor vezels vertegenwoordigen. Bovendien laesie van dit gebied demonstrated een duidelijke en aanhoudende tekort van de voorpoot bereiken vaardigheid. Daarom raden wij het caudale deel van de interne capsule voor stereotactische laesie om de geldigheid van het kapsel infarct model te verbeteren.
Voorinstelling van lichtintensiteit noodzakelijk voor een uniforme mate van infarct laesie tweetaktmodellen opleveren omdat het dier stam lichaamsgewicht lichtbron en soorten ONI verschillende maten infarct kan genereren. Daarom moeten voorlopige experimenten met verschillende lichtintensiteiten bij proefdieren met dezelfde stam en het lichaamsgewicht worden uitgevoerd totdat een bevredigende infarct laesie bereikt met minimale lichtintensiteit.
Sterke lichtintensiteit die de volledige breedte van de capsulaire vezel kan vernietigen (anterior-posterior en dorsoventral mate) die overeenkomt met de voorpoot met minimale schade aan de aangrenzende structuren wordt geacht de optimale lichtintensiteit is. de forelimb gebied van de interne capsule wordt begrensd door de thalamus craniaal en caudaal optische tractus. Daarom moet de diepte van inbrenging ONI nauwkeurig de gehele omvang van de IC vernietigen de dorsoventrale richting, met gelijktijdige bescherming van de bovenste en onderste aangrenzende structuren. Onnauwkeurige plaatsing van de ONI resulteert in een onvolledige vernietiging van de IC, wat leidt tot snel herstel van het tekort motor als gevolg van de synaptische plasticiteit van de piramidale resterende vezels in de capsula interna. In seriële histologische onderzoeken, de meest storende factor bij de inductie van een aanhoudend tekort motor was de onjuiste plaatsing van de ONI, wat leidt tot het feit dat de gehele breedte van de PLIC 4,16 vernietigen. Daarom moet aandacht worden besteed aan de juiste doelgroep te bereiken. Recentelijk Blasi et al. Beschreven dat een duurzame tekort pure-motor kan worden geproduceerd door een infarct laesie achterste capsula internamiddels endotheline-1 (ET-1) 17. Evenwel ET-1 de naburige grijze stof structuur vernietigen door de diffusie van ET-1.
Gedragstesten is direct beschikbaar referentie in het laboratorium om de vorming van infarct laesie in de capsula interna beoordelen. Echter, evaluatie van motorische prestatie één week na infarct laesie wordt aanbevolen om de dieren in matige en slechte herstelgroepen verdelen. Gematigd herstel werd gedefinieerd als een stijging van de prestaties scoren> 50% ten opzichte van de score voorafgaand aan de laesie, terwijl arme herstel werd gedefinieerd als het herstel van <50%. Onder de voorpoot motor gedragstesten, de interne korrel bereiken taak is een van de meest gevoelige tests voor zowel kwantitatieve als kwalitatieve metingen van beroerte geïnduceerde motorische prestaties 14. De taak meet kwantitatief het bereiken van succes en tegelijkertijd analyse van voorpoot gebruik, zoals grijpen en ophalen van een levensmiddelpellet. De kwalitatieve analyse van het bereiken van de beweging is ook nuttig om de kwaliteit van een beroerte herstel differentiëren door onderscheid te maken echt functioneel herstel of compensatie 20. Hier hebben we kort beschreven de kwantitatieve meting van de SPRT; echter, wordt de kwalitatieve analyse met behulp van filmen en scoren op basis van een frame-voor-beeld analyse aanbevolen voor verdere gedetailleerde analyse.
De hier gepresenteerde technieken niet beperkt kan blijven tot de inductie van infarct omgeschreven capsulaire modellering. De techniek kan worden toegepast op de inductie van een infarct laesie in andere gebieden van de witte stof, zoals het corpus callosum, commissura anterior en verbindende vezels onder neurale structuren. De combinatie van de kleine ONI en fototrombotisch techniek waarbij de optische eigenschappen van witte stof zal waarschijnlijk beoogde structuren te vernietigen met minimale schade aan de aangrenzende structuren. Zo kan lacunaire infarcten gemakkelijk producerend door zich te richten de subcorticale structuren soortgelijk aan motorische, cognitieve en geheugenfuncties. Wanneer de doelstructuur groot is, kunnen meerdere inserties van de ONI en verschillende targeting en schuine banen vereist zijn om de gewenste mate van lesies produceren.
Er zijn verscheidene beperkingen in deze techniek. De techniek is voldoende om de gevolgen van infarct laesie demonstreren de PLIC en daaropvolgende herstel. Echter, dit model niet overeen met het volledige spectrum van de menselijke WMS vanwege fototrombotisch vernietiging van de witte stof enigszins afwijkt van de menselijke WMS. Bijgevolg kan neurobiologische of MRI imaging bevindingen verschillende kenmerken vertonen in het beginstadium van fototrombotisch laesie. Daarom moet deze adequaat model worden gebruikt om af te handelen en nadelen van het model. Technisch gezien, niet alle operaties kunnen de sterke en permanente tekort motor te produceren in dit model, omdat het zeer nauwkeurige procedures vereist. Specifically, getraind en ervaren handen nodig zijn om de hoge reproduceerbaarheid bij het genereren van dit model.
Concluderend, het gecombineerde gebruik van een fototrombotisch techniek optimalisering van lichtintensiteit en correct moet worden is een nuttige techniek om een omschreven capsulaire infarct model te produceren. Dit model zal nuttig zijn niet alleen WMS op gedragsmatig, circuit en cellulaire niveaus maar ook de bruikbaarheid van nieuwe therapeutische en rehabilitatie interventies te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Institute of Medical System Engineering (Imse) & GIST-Caltech Collaborative Fund (K04592) van GIST en door de Basic Science Research Program door de NRF Korea gefinancierd door het ministerie van Wetenschap, ICT en de toekomst Planning (NRF-2013R1A2A2A01067890).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
| Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
| Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
| Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
| Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
| Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m |
|
| Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
| Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS |
|
| Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
| Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
| Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
| Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
| Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
| Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
| Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
| AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
| Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
| Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
| Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
| Hand Piece Drill | Seshin | ||
| Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
| Ketoprofen | UNIBIOTech |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2012 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 125, 2-220 (2012).
- Debette, S., Markus, H. S. The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging: systematic review and meta-analysis. Bmj. 341, 3666 (2010).
- Zhang, K., Sejnowski, T. A universal scaling law between gray matter and white matter of cerebral cortex. PNAS. 97 (10), 5621-5626 (2000).
- Kim, H. S., et al. A rat model of photothrombotic capsular infarct with a marked motor deficit: a behavioral, histologic, and microPET study. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 683-689 (2014).
- Kleim, J. A., Boychuk, J. A., Adkins, D. L. Rat models of upper extremity impairment in stroke. ILAR J. 48 (4), 374-384 (2007).
- Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat. Behav Brain Res. 169 (2), 206-211 (2006).
- He, Z., et al. Definition of the anterior choroidal artery territory in rats using intraluminal occluding technique. J Neurol Sci. 182 (1), 16-28 (2000).
- Tanaka, Y., et al. Experimental model of lacunar infarction in the gyrencephalic brain of the miniature pig: neurological assessment and histological, immunohistochemical, and physiological evaluation of dynamic corticospinal tract deformation. Stroke. 39 (1), 205-212 (2008).
- Shibata, M., Ohtani, R., Ihara, M., Tomimoto, H. White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion. Stroke. 35 (11), 2598-2603 (2004).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann Neurol. 17 (5), 497-504 (1985).
- Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40 (1), 248-253 (2009).
- Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Handbook of biomedical optics. 83, CRC Press. Boca Raton, Fl. (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Whishaw, I. Q., Whishaw, P., Gorny, B. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a movement rating scale. J Vis Exp. (18), e816 (2008).
- Jang, S. H. A review of corticospinal tract location at corona radiata and posterior limb of the internal capsule in human brain. NeuroRehabilitation. 24 (3), 279-283 (2009).
- Kim, D., et al. Longitudinal changes in resting-state brain activity in a capsular infarct model. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (1), 11-119 (2014).
- Blasi, F., Whalen, M. J., Ayata, C. Lasting pure-motor deficits after focal posterior internal capsule white-matter infarcts in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (6), 977-984 (2015).
- Metz, G. A., Antonow-Schlorke, I., Witte, O. W. Motor improvements after focal cortical ischemia in adult rats are mediated by compensatory mechanisms. Behavioural brain research. 162 (1), 71-82 (2005).
