Summary
Ce manuscrit décrit une technique de modélisation des capsulaire Infarctus. Ici, nous avons utilisé une technique photothrombotique modifiée avec une faible intensité de la lumière après la cartographie cible pré-opératoire. En utilisant cette technique, nous avons créé un modèle d'infarctus capsulaire circonscrites avec déficience motrice persistante.
Introduction
Jusqu'à récemment, la «matière grise course (GMS) modèles" ont été exclusivement utilisé pour comprendre la physiopathologie de l'AVC et de guider le développement de nouveaux traitements. Cependant, il y a eu une augmentation de la prévalence de l' AVC qui affecte la substance blanche sous - corticale chez les personnes âgées, ce qui constitue 15-25% de tous les AVC 1,2. De nombreuses études ont été menées en ce qui concerne la course en utilisant des modèles GMS, alors qu'il ya peu d'études qui ont utilisé la substance blanche course (WMS) modèles. La matière blanche chez les rongeurs est sensiblement inférieure à la matière blanche chez les êtres humains ou de primates. Par conséquent, il est plus difficile d'accéder sélectivement et détruire les régions cibles dans la substance blanche 3. En outre, aucun des outils efficaces ont été développés à ce jour pour détruire sélectivement l'étendue prévue de la substance blanche ciblée. Par conséquent, il y a eu absence de modèles appropriés pour l'étude des accidents vasculaires cérébraux de la substance blanche.
st animalmodèles Roke sont souvent utilisés pour surveiller la progression de la récupération motrice pour le développement de nouvelles méthodes de réadaptation et thérapeutiques. Il est idéal d'utiliser un modèle animal qui présente un déficit neurologique à long terme concordant avec les altérations anatomiques démontrées dans la course humaine 4,5. À cet égard, la récupération rapide du déficit moteur et une large participation du cerveau après lesioning de l'infarctus peut ne pas être réaliste dans la poursuite de la recherche sur les AVC. Les modèles précédents capsulaire de l' infarctus ont été faites par l'occlusion de l'artère carotide interne des artères ou de la choroïde antérieure et la diffusion de l' endothéline-1 (ET-1) dans la capsule interne 9/6. Néanmoins, l'occlusion de l'artère nécessite une dissection minutieuse des artères, mais il produit une vaste zone de lésion vasculaire, y compris la capsule interne, sans déficits comportementaux persistants. De plus, ET-1 n'a pas été diffusée à détruire complètement le bras postérieur de la capsule interne, et donc moins marqué ou persistant behdéficit avioral.
Un modèle d'infarctus photothrombotique a été largement utilisé pour générer divers types de lésions d' infarctus du cortex et des structures sous - corticales 10. La technique comprend l' administration par voie intraveineuse suivie d' une illumination focale, ce qui conduit à l' agrégation plaquettaire dans les petits vaisseaux et la génération des lésions d'infarctus 10. Technique photothrombotique a été largement utilisé pour créer des lésions GMS, alors qu'il a rarement été utilisé pour générer des lésions WMS 5,11. Pour cette technique, une combinaison de colorant rose bengale et l'irradiation de lumière a été démontrée comme étant utiles dans la destruction de la structure cible, ce qui provoque des déficits fonctionnels correspondants. L'élément clé de la technique photothrombotique est une irradiation lumineuse, car elle détermine la taille des lésions d'infarctus. les résultats d'irradiation de lumière dans des effets différents sur la matière grise et la substance blanche, parce que la diffusion de la lumière est plus de 4 fois plus élevé dans ma blanchetter par rapport à la matière grise 12; Par conséquent, si l'intensité lumineuse a une suffisamment faible irradiance (<1,140 mW / mm 2), on peut limiter l'extension à laquelle la lésion photothrombotique affecte la mesure dans la substance blanche (ie., Capsule interne). Par exemple, la lumière de l'énergie plus élevée peut provoquer des infarctus à la fois la matière grise et blanche, mais la lumière de faible énergie peut induire photothrombosis seulement dans la substance blanche. En outre, la pénétration de l'énergie lumineuse a été très limitée. Environ 99% de l' énergie lumineuse a été perdu au - delà de 1 mm de la source de lumière 13. Par conséquent, il est prévu que vise précisément, la lumière d'énergie inférieure photothrombosis induit seulement dans la substance blanche avec un empiètement minimal de la matière grise voisine.
Ici, nous décrivons un nouveau procédé pour créer des lésions d'infarctus dans la zone de la patte avant de la capsule interne chez les rongeurs. Nous décrivons la méthode d'identification de la zone de forelimb dans le ca internepsule, la technologie de l'irradiation de lumière, y compris l'ajustement et la fourniture de la lumière, et la génération d'une lésion d'infarctus. Nous décrivons également les tests comportementaux utilisés pour évaluer l'exhaustivité de la modélisation capsulaire.
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Protocol
Toutes les procédures ont été menées selon les directives institutionnelles de Gwangju Institute of Science and Technology (GIST), et toutes les procédures ont été approuvées par le Institutional Animal Care et utilisation Comité à GIST.
1. Les étapes de pré-lesioning
- Identification de la zone forelimb dans la capsule interne utilisant AAV-GFP
- Maison et la poignée des rats Sprague Dawley (~ 400 g, 11 - 13 semaines) dans le respect des directives institutionnelles et nationales.
- Stériliser tous les outils et les électrodes chirurgicales utilisant un stérilisateur approprié (à vapeur ou stérilisateur plasma). Utilisez stérilisateur à vapeur à 121 ° C en tant que paramètre de 30 min pour la stérilisation et 30 min pour les peaux sèches.
- Anesthésier l'animal avec un mélange de chlorhydrate de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (7 mg / kg) par une injection intramusculaire. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie par la patte de pincement. Maintenir la température du corps à 37,5 ± 0,5 ° C au moyen d'un coussin chauffant sousle corps de l'animal.
- Placer l'animal dans un cadre stéréotaxique en utilisant une barre d'oreille et le porte-bouche.
- Nettoyer et désinfecter le site chirurgical avec 70% d'alcool et de la solution de povidone iode. Infiltrez 2% de chlorhydrate de lidocaïne sous le cuir chevelu dans la zone du crâne d'incision destiné à réduire la douleur peropératoire.
- Appliquer vétérinaire pommade ophtalmique pour éviter le dessèchement des yeux. Placez un champ stérile sur l'animal aux sites opératoires. Maintenir toutes les procédures dans des conditions stériles.
- Effectuer une incision du crâne de la ligne médiane de 2 cm à l'aide d'un scalpel et retirer la peau bilatérale avec rétracteurs de fil. Sécher le crâne avec des cotons-tiges et 30% de peroxyde d'hydrogène.
- Faire un trou à l'aide d'un foret de la pièce à main sur la zone forelimb du cortex moteur (AP: +2,5 de bregma, ML: ± 2,5 à partir de la ligne médiane) et dégager les voies avec des micro-currette pour le virus de l'injection.
- Décongeler le AAV-GFP (2 x 10 12 molécules de virus / ml) sur la glace et de la charge 1 pl de lavirus dans une seringue de 10 ul. Placez la seringue sur le cadre stéréotaxique.
- Déplacer l'aiguille dans le trou pré-faites et abaisser l'aiguille de 1 mm de profondeur dans la dure-mère.
- Injecter le virus lentement (0,1 pl / min) en utilisant une micro-pompe de haute précision et de laisser l'aiguille en place pendant un temps supplémentaire de 10 min pour permettre au virus de se diffuser à l'extérieur.
- Après le nettoyage du site opératoire avec irrigation saline, sécuriser la plaie avec une suture 3-0 en nylon; libérer le rat dans le cadre stéréotaxique et le transférer dans une chambre de récupération. Administrer kétoprofène (2 mg / kg) par une injection intramusculaire pour le contrôle de la douleur postopératoire.
- Maintenir la température corporelle (37 ° C) avec un coussin chauffant et d'administrer les antibiotiques céphèmes de classe de deuxième génération (0,1%, 1 ml) par l'intermédiaire d'une injection intramusculaire et 2% de chlorhydrate de lidocaïne par voie sous-cutanée si nécessaire. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenirdécubitus sternale. Maison individuelle de l'animal jusqu'à la récupération complète.
- À la suite de 2 - 3 semaines de récupération, anesthésier profondément le rat avec une surdose de chlorhydrate de kétamine (300 mg / kg) par injection intramusculaire dans le capot. Confirmer la mort de l'animal par le manque d'orteil pincement réponse, le pouls et la respiration. Placez la supination de rat dans la hotte.
- Ouvrir la cavité abdominale au moyen d'un 'incision en forme Y'à ouvrir la cavité thoracique. Étroitement serrer l'aorte descendante avec un hémostatique et rompre l'oreillette droite du cœur de rat pour le drainage du sang. Amorcer la perfusion dans le ventricule gauche du coeur à froid paraformaldehyde à 1% pendant 5 minutes (10 ml / min), suivie de 4% de paraformaldehyde pendant 30 minutes (10 ml / min).
- Retirez la tête de rat de la carcasse à l'aide d'une paire de ciseaux. Faire une incision médiane du cou au nez et à retirer les muscles du cou à l'aide de ciseaux ou gouge de telle sorte que le crâne est exposé. disséquer délicatement les os du crâne et duras hors du cerveau.
- Extraire le cerveau et placer le cerveau de rat dans un tube conique de 50 ml remplie de paraformaldehyde à 4% pendant une nuit. Le lendemain, laver le cerveau avec 1x PBS 3 fois et le placer dans une solution de saccharose à 30%.
- Après que le cerveau enfonce complètement au fond de la solution de saccharose à 30%, placer le cerveau dans le cryomoule avec le composé octobre à -20 ° C dans un cryotome. Couper le cerveau, dans le plan coronal à une épaisseur de 40 pm et un intervalle de 200 pm.
- Effectuer GFP coloration immunohistochimique en utilisant la méthode de la diapositive 14. Appliquer l'anticorps primaire (1: 200 d'anticorps anti-protéine fluorescente verte, la fraction d'IgG de lapin) à des tranches de cerveau pendant la nuit à 4 ° C. Le 2 e jour, laver avec 1% Phosphate Buffered Saline avec (PBST) solution Tween-20 3 fois et appliquer l'anticorps secondaire (1: 500 de chèvre anti-lapin IgG (H + L)) pendant 1 h. Rincer la lame avec 1% PBST 3 fois. Placer le couvercle en verre sur la tranche de cerveau.
- En utilisant un microscope à fluorescence (excitation à une longueur d'onde470 nm, longueur d'onde d'émission 525 nm, grossissement 5X), observer le AAV-GFP axones transduites dans la capsule interne. Comparer les emplacements des axones transduites avec l'atlas de cerveau de rat 15 pour déterminer les coordonnées stéréotaxiques des axones transduites
- Réglage de l'intensité lumineuse appropriée pour capsulaire Infarctus Modeling Pre-lesioning
- La construction de la Neural Interface optique
- Couper une longueur appropriée (4 cm) d'une aiguille spinale de calibre 27 avec un stylet à l'intérieur à l'aide d'un foret de coupe.
NOTE: Couper peut comprimer et écraser la pointe de l'aiguille spinale; retirer le stylet et polir la pointe de l'aiguille spinale pour enlever la partie écrasée de l'aiguille spinale et maintenir le calibre interne de l'aiguille spinale. - Dépouiller une longueur appropriée (10 cm) de l'enveloppe de la fibre optique (125 um avec un 62,5 um noyau) d'un côté cordon de raccordement.
- Insérez le fi optique unjackedber dans le tube métallique (diamètre extérieur: 3,8 mm, diamètre intérieur: 3,3 mm, longueur: 17 mm) qui est ensuite serré autour de la fibre. Le tube métallique peut être utile pour combler l'espace entre la fibre optique et le moyeu de l'aiguille spinale. Serrer le double de la moitié inférieure du tube métallique avec un élément presseur.
- Appliquer l'époxy durcissable à chaud sur la fibre optique et d'insérer la fibre optique dans l'aiguille spinale. Appliquer un époxy supplémentaire à l'espace vide dans le moyeu. Cure l'époxy pendant 20 min à 100 ° C pour la fixation stable.
- Cleave la fibre optique qui fait saillie hors de l'aiguille spinale et polir la fibre optique à la pointe de l'aiguille spinale utilisant diamant rodage (polissage) feuilles.
- Branchez la partie du connecteur FC / PC de cordon de raccordement au coupleur du système laser vert et mesurer l'intensité lumineuse de la pointe de la fibre optique en utilisant la puissance optique numérique et compteur d'énergie.
- Couper une longueur appropriée (4 cm) d'une aiguille spinale de calibre 27 avec un stylet à l'intérieur à l'aide d'un foret de coupe.
- La construction de la Neural Interface optique
2. PhotothromBotic Infarctus lesioning dans la capsule interne
- Stériliser tous les outils et les électrodes chirurgicales utilisant un stérilisateur approprié (à vapeur ou stérilisateur plasma). Utilisez stérilisateur à vapeur à 121 ° C en tant que paramètre de 30 min pour la stérilisation et 30 min pour les peaux sèches.
- Anesthésier l'animal (~ 400 g, 11 - 13 semaines) avec un mélange de chlorhydrate de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (7 mg / kg) par une injection intramusculaire. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie par la patte de pincement. Maintenir la température du corps à 37,5 ± 0,5 ° C par l'intermédiaire d'un coussin chauffant sous le corps de l'animal.
- Placer l'animal dans un cadre stéréotaxique en utilisant une barre d'oreille et le porte-bouche.
- Nettoyer et désinfecter le site chirurgical avec 70% d'alcool et de la solution de povidone iode. Infiltrez 2% de chlorhydrate de lidocaïne sous le cuir chevelu dans la zone du crâne d'incision destiné à réduire la douleur peropératoire. Appliquer vétérinaire pommade ophtalmique pour éviter le dessèchement des yeux.
- Appliquer un champ stérile sur unimal et exposer des sites opératoires. Maintenir toutes les procédures dans des conditions stériles.
- Effectuer une incision du crâne de la ligne médiane de 2 cm et retirer la peau bilatérale avec rétracteurs de fil. Sécher le crâne avec des swaps de coton et de peroxyde d'hydrogène.
- Réglez la hauteur de la pince de nez jusqu'à ce que le bregma et lambda sont alignés au même niveau. Etape critique: Cet alignement est critique pour approcher correctement à une structure plus profonde, par exemple en effectuant une lésion d'infarctus dans la capsule interne dans l'expérience principale.
- Faire un trou (diamètre: 2 mm; AP: -2.04 de bregma; ML: ± 3,0 de la ligne médiane) à l'aide d'un foret pour induire photothrombosis.
- Polonais et nettoyer la pointe de la fibre optique de l'interface optique. Fixer le ONI au cadre stéréotaxique sans plier. Vérifiez la pointe de l'ONI et essuyez clairement avant et après l'insertion de l'interface optique.
- Mesurer l'intensité laser à partir de l'extrémité de la fibre optique avant l'insertion de la optical 'interface à l'emplacement cible du cerveau du rat. Réglez l'intensité du laser à 3,5 mW, tel que confirmé par les étapes de pré-chirurgie, à la pointe de la fibre optique.
- Insérez l'ONI dans la zone cible de la capsule interne (-7,8 mm confirmées à l'étape de pré-chirurgie) à travers le trou de forage.
- Maintenir la température du corps à 37,5 ± 0,5 ° C pendant photothrombosis. Une température inférieure de corps ne peut pas produire de l'étendue prévue de l'infarctus. Injecter Rose Bengale (2 ml / kg) par la veine de la queue.
- Allumez le laser vert 532 nm pendant 90 secondes 1 min après l'injection Rose Bengale. Après irradiation, retirez délicatement l'ONI du cerveau. Après le nettoyage du site opératoire, sécuriser la plaie sécuriser la plaie avec une suture 3-0 en nylon; libérer le rat dans le cadre stéréotaxique et le transférer dans une chambre de récupération.
- Pour le groupe de pseudo-opérées (SOG), effectuer une procédure de lésion fabrication identique, sauf pour l'injection d'une solution saline (0,2 ml / 100 g) au lieu de Rose-Bengale.
- Maintenir la température corporelle (37 ° C) avec un coussin chauffant après une intervention chirurgicale et à administrer des antibiotiques (céphalosporines de deuxième génération, 0,1%, 1 ml) par une injection intramusculaire. Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne pas retourner les animaux post-chirurgicales à la cage occupée par d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
NOTE: expérience préliminaire a été réalisée dans les mêmes procédures pour trouver l'intensité lumineuse optimale de 1 mW à 5 mW et la procédure peut être tenue d'acquérir la mesure satisfaisante de la lésion dans un état différent.
3. Évaluation des capsulaire Infarctus lesioning
- Test comportemental et regroupement des animaux
- Effectuer culot unique pour atteindre des tâches telles que décrites par Whishaw et al. 14 pour évaluer le déficit moteur du forelimb chaque jour pendant 1 semaine après la modélisation de la course. Effectuer une seule tâche pellet atteindre(SPRT) chez les animaux destinés à l'alimentation restreinte (90% du poids du corps de contrôle) en utilisant plexiglas transparent (30 x 15 x 35 cm de hauteur) avec une fente large de 1 cm et un plateau de nourriture à l'avant du milieu de la paroi avant.
- Placez une pastille sur le plateau alimentaire obliquement controlatéral à la forelimb préférée. Administrer 20 pastilles par session pendant 3 semaines.
NOTE: Un certain nombre de succès de SPRT est définie comme une portée dans laquelle l'animal saisit une boulette de nourriture et le met dans la bouche sans la laisser tomber. - Calculer la moyenne des scores en pourcentage atteint avec succès, qui est défini par la formule suivante:
NOTE: Nous divisons les animaux en 3 groupes: le groupe opération fictive (SOG), modéré groupe de récupération (MRG), et les pauvres groupe de récupération (PRG). Si un score de SPRT post-AVC> 50%, nous classons les rats comme le MRG, qui indique la présence d'une lésion importante, mais la destruction incomplète de la target. Si le score de SPRT post-AVC est <50% par rapport au score SPRT pré-course, nous classons le groupe PRG, qui indique lesioning complète dans la cible.
- Confirmation neurohistologiques de Infarctus lesioning
- Effectuer la perfusion cardiaque avec 4% de paraformaldehyde comme décrit précédemment. Après que le cerveau enfonce complètement dans la solution de saccharose à 30%, à effectuer le sectionnement coronales d' une épaisseur de 10 pm et un intervalle de 200 um en utilisant un Microtome ou cryotome 4.
- Colorer avec H & E, Nissl, Luxol rapide bleu-PAS, Neurofilament protéine L ou gliale protéine acide fibrillaire coloration et observer les résultats histologiques pour déterminer l'intensité optimale de la lumière qui peut couvrir toute la largeur de la capsule interne dans la zone cible pour observer la coloration 4,17.
- En utilisant le logiciel ImageJ, mesurer le volume de la zone de l'infarctus photothrombotique de la capsule interne sur les lames du cerveau.
- Pour mesurer le volume de la zone de l'infarctus, lancez le logiciel 'ImageJ'. Pour ouvrir les fichiers à empiler, sélectionnez «Image to Stacks '(→' image Stacks '' Image '→' Stacks '). Modifier le nom du fichier et sélectionnez "Définir l'échelle» ( «Analyser» → «Définition de l'échelle ') pour modifier l'échelle.
- Dans 'Plugins', sélectionnez 'Mesurer Stacks' pour calculer le volume ou la zone d'images. Insérez l'intervalle de distance de 2 images en «Slice Espacement». Faire un dessin de la ROI (région d'intérêt) de toutes les images et cliquez sur "Mesure".
REMARQUE: Le logiciel 'ImageJ' calcule automatiquement la surface et le volume de chaque image et volume total d'entre eux.
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Representative Results
La méthode présentée ici est destinée à créer un Infarctus capsulaire circonscrit avec un déficit moteur persistant. Par conséquent, il est essentiel de déterminer correctement la cible à l'intérieur de la capsule interne dans l'étape de pré-chirurgie. La cartographie somatotopique des fibres pyramidales dans la capsule interne n'a pas été réglé à ce jour. D'identifier correctement la cible à l'intérieur de la capsule interne, la zone de la patte avant doit être définie. Une injection d'AAV-GFP dans la zone de la patte avant du cortex moteur peut tracer les axones des fibres pyramidales dans la capsule interne (figure 1). D' autres marqueurs neuronaux, tels que biotinylé dextran amine (BDA), peut être utilisé pour le même objectif. Les coordonnées stéréotaxiques de la cible à l'intérieur de la capsule interne peuvent être élucidées en traçant les projections axonales qui proviennent de la zone de la patte avant du cortex moteur vers la capsule interne.
Figure 1. Identification de la zone forelimb dans la capsule interne 2 semaines après l'injection d'AAV-GFP. Fibres axonales GFP-transduction qui proviennent de la zone de forelimb du cortex moteur sont présentés dans le noyau ventro des thalamus (flèches) et la partie caudale de la capsule interne (pointe de flèche). La ligne pointillée indique le contour de la capsule interne, et les chiffres se rapportent aux distances de bregma. Hippo, hippocampe; Cpu, putamen caudé; VL, noyau ventro; IC, capsule interne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
L'intensité optimale de la lumière peut être différente en fonction du poids de contrainte et le corps de l'animal et les types et diamètres des fibres optiques. Par conséquent, l'intensité lumineuse optimale doit être déterminée séparément avant l'expérience de l'infarctus lesioning principal. En utilisant la procédure photothrombotique, l'intensité lumineuse peut être augmentée progressivement jusqu'à ce que l'étendue de la lésion couvre toute la largeur de la capsule interne , sans détruire les structures de matière grise voisines (figure 2). L'intensité lumineuse optimale peut être vérifiée en comparant la mesure histologique de la lésion d'infarctus et d'emplacements.
Figure 2. Étendue de l'Infarctus Lésions Across Varier l' intensité de la lumière laser de 2 mW à 5 mW 2 semaines après photothrombotique lesioning. L'intensité lumineuse optimale est considéré comme entre 3 mW et 4 mW dans ce cadre expérimental. Les flèches indiquent la lésion d'infarctus./53281/53281fig2large.jpg "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Nous préférons utiliser l'ONI dans lequel la fibre optique est contenue dans un tube métallique mince (aiguille spinale). La fibre optique peut produire un minimum de dispersion de la lumière à partir du côté de la fibre, ce qui est susceptible de générer des dommages neuronaux supplémentaire le long du tube de fibre optique. Enrobage de la fibre optique est également avantageuse pour empêcher la flexion de la fibre optique dans des cibles plus profondes, ainsi que pour fixer le ONI au cadre stéréotaxique (figure 3).
Figure 3. Construction de l'interface optique-neural (ONI). (A) coupe de l'aiguille spinale. (B) de dénudage de la fibre optique. (C & d) Le tube métallique d'ancrage est inséré par-dessus lafibre optique dénudée et à l'étroit pour fixer la fibre optique sur le moyeu de l'aiguille spinale. (E) La fibre optique époxy ajoutée est insérée dans l'aiguille spinale. (F) La résine époxyde est durci à 100 ° C pendant 20 min. (G) La fibre optique est clivé à la pointe de l'aiguille spinale. (H) La fibre optique est polie. (i) L'intensité lumineuse est mesurée à partir de la pointe de la fibre optique. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La procédure photothrombotique produira des lésions et des endroits reproductibles avec ~ réussite de 70% dans la déficience motrice. Lésion capsulaire typique de l' infarctus englobe la dimension ventro - dorsale de fibres capsulaires (figure 4A). En outre, la lésion d'infarctus se prolonge le long de l'axe antéro - postérieur de la capsule interne a augmenté en raison de la diffusion de la lumière dans la fibre capsulaire. (Figure 4B) Le faisceau optique situé au- dessous de la capsule interne est constituée de fibres de matière blanche; Par conséquent, il est souvent endommagée par l'irradiation d'une intensité lumineuse accrue. Des coupes en série et la coloration sont nécessaires pour confirmer l'ensemble du volume et de l'étendue de l'infarctus. Le volume d'infarctus était de 0,63 ± 0,37 mm 3. Pour évaluer la destruction de la fibre capsulaire, neurofilament et luxol taches bleu-PAS rapide sont utiles.
Figure 4. Aspect microscopique des capsulaire 3 semaines après l' infarctus Photothrombosis. Aspect microscopique des capsulaire Infarctus 3 semaines après photothrombosis. A) tranche de cerveau de la section coronale dans le cerveau de rat. Pointe de flèche indique le tube d'aiguille contenant de la fibre optique dans le thalamus et jusqu'à la capsule interne. B) série de coloration Nissl du coronal des tranches de cerveau showi ng toute l'étendue de la lésion d'infarctus dans la capsule interne. Arrowheads indiquent la lésion de l' infarctus. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Le succès de la modélisation peut être évaluée par des tests de comportement en utilisant une seule pastille atteignant tâche. La performance comportementale après 1 semaine après la lesioning de l' infarctus est un bon guide pour confirmer lesioning précis, qui accompagne la dépréciation persistante et marquée de SPRT en dépit de la formation pellet unique quotidienne atteint (figure 5). Une fois que le déficit moteur est indiqué dans le PRG, le déficit neurologique a persisté pendant 3 période d'observation d'un mois. groupe Sham-exploité n'a pas montré la diminution significative de la performance SPRT après l'opération.
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Figure 5. Changements dans Simple Pellet Atteindre Scores après capsulaire infart 4,20. Les groupes expérimentaux (PRG et MRG) présentaient une diminution significative des scores immédiatement après la lesioning de l'infarctus par rapport au groupe de pseudo-opérées (SOG). Le MRG présente une reprise progressive des performances SPRT, tandis que le PRG présente la déficience motrice persistante au fil du temps. Op, photothrombotique Infarctus lesioning; PRG, groupe pauvre de récupération; MRG, groupe de reprise modérée. La signification statistique a été déterminée en utilisant une analyse répétée de la mesure des écarts. + SOG contre MRG; * SOG contre PRG. Les données sont des moyennes ± sem. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le modèle de l'infarctus capsulaire présenté ici démontre une lésion ciblée avec marquée et persistante déficience motrice en fonction de forelimb. Les modèles précédents de l' AVC capsulaire subcortical ont démontré un degré insuffisant de déficience motrice et un 6,8,9 rapide de processus de récupération. En ce sens, ce modèle ressemble aux cas cliniques capsulaire d'infarctus qui présentent une déficience fonctionnelle à long terme.
Les étapes les plus critiques dans le développement d'un modèle capsulaire Infarctus circonscrit sont: 1) d'identifier correctement la représentation somatotopique de la partie du corps destinée à désactiver la fonction au sein de la capsule interne; 2) pour identifier l'intensité optimale du laser vert, qui peut détruire toute la largeur de la capsule interne avec l'empiètement minimal de structures de matière grise voisine; et 3) pour placer avec précision la fibre optique dans la structure cible. Bien que les techniques présentées peuvent induire circonscriventd modèle Infarctus capsulaire avec un taux de réplication élevé (> 70%), de petites différences dans le ciblage et le degré d'exhaustivité de la destruction couvrant toute la largeur de la capsule interne peut tenir compte des différents déficits moteurs.
Le faisceau cortico - spinal est situé dans la moitié antérieure de la branche postérieure de la capsule interne chez l' homme malgré la controverse de l' organisation somatotopique 15. En revanche, il n'y a pas de classification équivalente ou élucidation détaillée de l'organisation somatotopique de la capsule interne chez les rongeurs. Le manque de connaissances en ce qui concerne l'organisation somatotopique conduit souvent à des cibles incorrectes des Infarctus lesioning au sein de la capsule interne avec des résultats différents moteurs parmi les modèles capsulaire d'infarctus. Cependant, nous avons identifié les axones GFP transduite dans la partie caudale de la capsule interne, ce qui représente probablement le trajet des fibres motrices des membres antérieurs. En outre, lesioning de cette zone justified un déficit marqué et persistant de l'forelimb compétence atteint. Par conséquent, nous recommandons la partie caudale de la capsule interne pour lesioning stéréotaxique pour améliorer la validité du modèle capsulaire de l'infarctus.
Pré-réglage de l'intensité lumineuse est obligatoire pour produire une mesure uniforme de l'infarctus lésion dans les modèles de temps parce que la souche animale, le poids corporel, la source lumineuse et le type d'ONI peut générer différentes tailles d'infarctus. Par conséquent, des expériences préliminaires utilisant des intensités lumineuses différentes sur des animaux expérimentaux avec la même souche et de poids corporel doivent être conduites jusqu'à ce que la lésion d'infarctus satisfaisante est obtenue avec une intensité lumineuse minimale.
intensité de la lumière forte qui peut détruire toute la largeur de la fibre capsulaire (antéro-postérieur et dorso-ventral mesure) qui correspond à la zone de forelimb avec un minimum de dommages aux structures voisines est considéré comme l'intensité lumineuse optimale. Le forelimb zone de la capsule interne est limitée par le thalamus supérieurement et les voies optiques inférieurement. Par conséquent, la profondeur d'insertion ONI doit être précis pour détruire toute l'étendue du circuit intégré dans la direction dorso-ventrale, avec la préservation simultanée des structures voisines supérieures et inférieures. le placement imprécis de l'ONI se traduit par une destruction incomplète du circuit intégré, ce qui conduit à une récupération rapide du déficit moteur en raison de la plasticité synaptique des fibres pyramidales restant dans la capsule interne. Lors des examens histologiques de série, le facteur le plus de confusion dans l'induction d'un déficit moteur persistant était le mauvais positionnement de l'ONI, ce qui conduit à l'échec de détruire toute la largeur de la CARP 4,16. Par conséquent, une attention particulière devrait être portée pour atteindre la bonne cible. Récemment, Blasi et al. A rapporté que durant le déficit moteur pur peut être produit en faisant une lésion d'infarctus dans la capsule postérieure interneà l' aide d' endothéline-1 (ET-1) 17. Cependant, ET-1 peut détruire la structure de la matière grise voisine par la diffusion de l'ET-1.
les tests de comportement est une référence immédiatement disponible au laboratoire pour évaluer la formation de la lésion d'infarctus dans la capsule interne. Toutefois, l'évaluation de la performance du moteur, une semaine après l'infarctus lesioning est recommandé de diviser les animaux en groupes de récupération modérés et pauvres. Reprise modérée a été définie comme une augmentation du score de performance de> 50% par rapport au score avant lesioning, alors une mauvaise récupération a été définie comme la récupération de <50%. Parmi les tests de comportement du moteur de forelimb, le culot unique tâche est d' atteindre l' un des tests les plus sensibles pour les mesures quantitatives et qualitatives des performances motrices induites par l' AVC 14. La tâche mesure quantitativement le succès atteint tout en fournissant simultanément une analyse de l'utilisation de forelimb, tels que la saisie et la récupération d'un alimentpastille. L'analyse qualitative du mouvement pour atteindre est également utile pour différencier la qualité de la récupération de l' AVC en distinguant la récupération ou la compensation 20 fonctionnelle réelle. Ici, nous avons brièvement décrit la mesure quantitative de la SPRT; Cependant, l'analyse qualitative en utilisant le tournage et la notation basée sur une analyse trame par trame est recommandé pour une analyse plus détaillée.
Les techniques présentées ici ne doivent pas se limiter à l'induction de la modélisation circonscrite capsulaire de l'infarctus. La technique peut être appliquée à l'induction d'une lésion d'infarctus dans d'autres domaines de la matière blanche, tels que le corps calleux, commissure antérieure et des fibres de liaison entre les structures nerveuses. La combinaison de la technique minuscule ONI et photothrombotique basée sur les propriétés optiques de la matière blanche est susceptible de détruire les structures ciblées avec un minimum de dommages aux structures voisines. Par exemple, infarctus lacunaires peuvent être facilement produired en ciblant les structures sous-corticales liées aux fonctions motrices, cognitives et de la mémoire. Lorsque la structure cible est grande, insertions multiples de l'ONI et différents ciblage et angulaires trajectoires peuvent être nécessaires pour produire le degré souhaité de lésions.
Il existe plusieurs limitations de cette technique. La technique est suffisante pour démontrer la conséquence de l'infarctus lesioning dans le CARP et la récupération ultérieure. Toutefois, ce modèle ne reflète pas le spectre complet des WMS humains parce que la destruction de la matière blanche photothrombotique diffère légèrement de WMS humains. Par conséquent, les résultats d'imagerie neurobiologiques ou IRM peuvent présenter des caractéristiques différentes dans le stade précoce de lesioning photothrombotique. Par conséquent, ce modèle devrait être utilisé de façon appropriée à troquer les avantages et les inconvénients du modèle. Techniquement, pas toutes les chirurgies peuvent produire le déficit moteur marqué et permanent dans ce modèle, car il nécessite des procédures très précises. Specifically, les mains formés et expérimentés sont nécessaires pour produire la grande reproductibilité dans la génération de ce modèle.
En conclusion, l'utilisation combinée d'une technique photothrombotique, l'optimisation de l'intensité lumineuse, et le ciblage correct est une technique utile pour produire un modèle capsulaire Infarctus circonscrit. Ce modèle sera utile non seulement pour étudier WMS au comportement, circuit, et les niveaux cellulaires, mais aussi d'évaluer l'utilité des nouvelles interventions thérapeutiques et de réadaptation.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de l'Institut de médecine System Engineering (IMSE) & GIST-Caltech Fonds de collaboration (de K04592) à partir de GIST et par le Programme de recherche en sciences de base par le biais de la NRF de Corée, financé par le Ministère des sciences, TIC et de la planification future (NRF-2013R1A2A2A01067890).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
| Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
| Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
| Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
| Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
| Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m |
|
| Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
| Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS |
|
| Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
| Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
| Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
| Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
| Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
| Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
| Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
| AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
| Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
| Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
| Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
| Hand Piece Drill | Seshin | ||
| Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
| Ketoprofen | UNIBIOTech |
References
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