Summary
Dieses Manuskript beschreibt eine Modellierungstechnik der Kapsel Infarkt. Hier verwendeten wir eine modifizierte photothrombotic Technik mit geringer Intensität des Lichts nach Vorchirurgischer Ziel-Mapping. Mit dieser Technik haben wir einen umschriebenen Kapselinfarktmodell mit persistierendem motorischen Beeinträchtigungen.
Introduction
Bis vor kurzem wurden verwendet, die "graue Substanz Schlaganfall (GMS) Modelle" ausschließlich die Pathophysiologie des Schlaganfalls zu verstehen und die Entwicklung neuer Therapien zu führen. Allerdings hat es eine zunehmende Prävalenz von Schlaganfall gewesen , die subkortikalen weißen Substanz bei älteren Menschen betrifft, die 15 ausmacht - 1,2 25% aller Schlaganfälle. Zahlreiche Studien haben in Bezug auf Schlaganfall mit GMS-Modellen durchgeführt wurden, während es gibt nur wenige Studien, die weiße Substanz Schlaganfall (WMS) Modelle verwendet haben. Weiße Substanz in Nagern ist wesentlich geringer als die der weißen Substanz in Menschen oder Primaten. Folglich ist es schwieriger , um selektiv die Zielregionen in der weißen Substanz 3 zuzugreifen und zu zerstören. Darüber hinaus haben keine effiziente Werkzeuge wurden bisher entwickelt, um selektiv den geplanten Umfang der gezielten weißen Substanz zu zerstören. Daher gab es für das Studium der weißen Substanz Hübe Mangel an geeigneten Modellen gewesen.
Tier stroke Modelle werden oft zu überwachen den Fortschritt der Motor Erholung für die Entwicklung neuer rehabilitative und therapeutische Methoden verwendet. Es ist ideal , ein Tiermodell zu verwenden , die eine langfristige neurologische Defizit konkordant mit den anatomischen Veränderungen im menschlichen Schlaganfall 4,5 demonstriert zeigt. In dieser Hinsicht ist eine schnelle Wiederherstellung des Motors Defizit und breite Beteiligung des Gehirns nach Infarkt Läsion möglicherweise nicht realistisch bei der Verfolgung der Schlaganfallforschung. Früheren Kapselinfarkt Modelle wurden durch die Okklusion der Carotis interna oder anterioren choroidalen Arterien und Diffusion von Endothelin-1 (ET-1) in die Capsula interna 6-9 hergestellt. Dennoch erfordert Arterienverschluss sorgfältig seziert und der Arterien, aber es produziert ein breites Gebiet der Infarkt Läsion, einschließlich der inneren Kapsel, ohne persistent Verhaltensdefizite. Außerdem ET-1 war nicht diffuses vollständig den hinteren Schenkel der inneren Kapsel zerstören und damit weniger stark ausgeprägt oder beh persistierendenavioral Defizit.
Ein photothrombotic Infarkt Modell wurde verschiedene Arten von Infarkt - Läsionen in der Hirnrinde und subkortikalen Strukturen 10 zu erzeugen , weit verbreitet. Die Technik umfassen die intravenöse Verabreichung durch fokale Beleuchtung gefolgt, die in den kleinen Gefäßen und die Erzeugung von Infarkt Läsionen 10 zu Thrombozytenaggregation führt. Photothrombotic Technik wurde GMS Läsionen intensiv genutzt zu schaffen, während es wurde selten verwendet , um WMS - Läsionen 5,11 erzeugen. Für diese Technik hat sich eine Kombination von Rose Bengal-Farbstoff und Lichtbestrahlung nachgewiesen wurde zur Zerstörung der Zielstruktur nützlich zu sein, so dass funktionelle Defizite entspricht. Das Schlüsselelement der photothrombotic Technik ist Bestrahlung mit Licht, weil es die Größe der Infarkt Läsionen bestimmt. Lichtbestrahlungsergebnisse in unterschiedliche Wirkungen auf grauer Substanz und weißer Substanz, weil die Streuung von Licht mehr als 4-mal höher in Weiß ma isttter im Vergleich mit der grauen Substanz 12; Dementsprechend wird , wenn die Lichtintensität eine ausreichend niedrige Bestrahlungsstärke (<1,140 mW / mm 2) hat, kann man die Erweiterung beschränken , auf die photothrombotic Läsion das Ausmaß der weißen Substanz beeinflussen (dh., Innere Kapsel). Zum Beispiel Licht höherer Energie kann Infarkte in beiden grauen und weißen Substanz zu induzieren, noch niedrigere Energie Licht photothrombosis nur in der weißen Substanz induzieren kann. Außerdem war das Eindringen der Lichtenergie sehr begrenzt. Etwa 99% der Lichtenergie wurde über 1 mm von der Lichtquelle 13 verloren. Daher wird erwartet, dass genau gezielt, niedrigere Energie Licht induziert photothrombosis nur in der weißen Substanz mit einem minimalen Eingriff der grauen Substanz Nachbar.
Hier beschreiben wir ein neues Verfahren Infarkt Läsionen im forelimb Bereich der inneren Kapsel in Nagetieren zu schaffen. Wir beschreiben die Methode der Identifizierung des forelimb Bereich im internen capsule, die Technik der Lichtbestrahlung, einschließlich der Einstellung und Abgabe von Licht und die Erzeugung eines Infarkts Läsion. Wir beschreiben auch Verhaltenstests verwendet, um die Vollständigkeit der Kapsel Modellierung zu bewerten.
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Protocol
Alle Verfahren wurden nach den Richtlinien des Instituts der Gwangju Institute of Science and Technology (GIST) durchgeführt, und alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee bei GIST zugelassen.
1. Pre-Läsion Schritte
- Bezeichnung des Vorderbein Bereich in der inneren Kapsel mit AAV-GFP
- (- 13 Wochen ~ 400 g, 11) in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen Richtlinien Haus und Sprague Dawley Ratten behandeln.
- Sterilisieren alle chirurgischen Werkzeugen und Elektroden einen entsprechenden Sterilisator (Dampf oder Plasma-Sterilisator) verwendet wird. Verwenden Sie Dampf-Sterilisator bei 121 ° C als Einstellung von 30 Minuten für die Sterilisation und 30 min für trocken.
- Anästhesieren das Tier mit einem Gemisch von Ketamin-Hydrochlorid (100 mg / kg) und Xylazin (7 mg / kg) über eine intramuskuläre Injektion. Schauen Sie sich die Tiefe der Anästhesie durch Pfote Kneifen. Aufrechterhaltung der Körpertemperatur bei 37,5 ± 0,5 ° C über ein Heizkissen unterder Körper des Tieres.
- Legen Sie das Tier in einem stereotaktischen Rahmen ein Ohr bar und Mund Halter verwenden.
- Sauber und die Operationsstelle mit 70% Alkohol und Povidon-Jodlösung zu desinfizieren. Infiltrieren 2% Lidocainhydrochlorid unter der Kopfhaut in der beabsichtigten Schädel Inzisionsbereich die intraoperative Schmerzen zu reduzieren.
- Bewerben Tierarzt Augensalbe Trocknen der Augen zu vermeiden. Legen Sie ein steriles Tuch über das Tier zu den operativen Standorten. Pflegen Sie alle Verfahren unter sterilen Bedingungen.
- Führen Sie eine Mittellinie Schädel Schnitt von 2 cm mit einem Skalpell und die Haut auf bilateraler Ebene mit Draht Retraktoren zurückzuziehen. Trocknen Sie den Schädel mit Wattestäbchen und 30% Wasserstoffperoxid.
- Machen Sie ein Loch mit einem Handstück Bohrer über den forelimb Bereich der motorischen Kortex (AP: +2,5 von Bregma, ML: ± 2,5 von der Mittellinie) und löschen Sie den Darm-Trakt mit Mikro-currette für Virus-Injektion.
- Auftauen AAV-GFP (2 x 10 12 Virus Moleküle / ml) auf Eis und Last 1 ul derVirus in einem 10 & mgr; l-Spritze. Legen Sie die Spritze auf den stereotaktischen Rahmen.
- Bewegen Sie die Nadel in die vorgefertigten Loch und senken Sie die Nadel 1 mm tief in die Dura.
- Spritzen Sie das Virus langsam (0,1 & mgr; l / min) unter Verwendung eines hochpräzisen Mikropumpe und lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle für weitere 10 min das Virus zu erlauben, zu diffundieren.
- Nachdem die Operationsstelle mit Kochsalzlösung Bewässerung Reinigung, sichern Sie die Wunde mit 3-0 Nylonnaht; lassen Sie die Ratte aus der stereotaktischen Rahmen und überträgt es auf eine Erholung Kammer. Verabreichen Ketoprofen (2 mg / kg) über eine intramuskuläre Injektion zur postoperativen Schmerzkontrolle.
- Pflegen Sie die Körpertemperatur (37 ° C) mit Heizkissen und verwalten zweiten Generation Cephemen-Klasse Antibiotika (0,1%, 1 ml) über eine intramuskuläre Injektion und 2% Lidocainhydrochlorid als subkutane Injektion nach Bedarf. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt hat aufrechtzuerhaltenBrustlage. Einfamilienhaus das Tier bis zur vollständigen Genesung.
- Nach 2 - 3 wöchigen Erholungs, betäuben tief die Ratte mit einer Überdosis von Ketamin-Hydrochlorid (300 mg / kg) über eine intramuskuläre Injektion in der Haube. Bestätigen Sie den Tod des Tieres durch einen Mangel an toe Kneifen Antwort, Puls und Atmung. Legen Sie die Ratte Rücken in der Haube.
- Öffnen Sie die Bauchhöhle über ein 'Y'-förmigen Einschnitt die Brusthöhle zu öffnen. Fest klemmen den rechten Vorhof des Rattenherzens zur Blutdrainage der absteigenden Aorta mit einem Hämostatikum und Bruch. Initiieren Perfusion in den linken Ventrikel des Herzens mit kalter 1% Paraformaldehyd für 5 min (10 ml / min), gefolgt von 4% Paraformaldehyd für 30 min (10 ml / min).
- Entfernen Sie die Ratte Kopf von Karkasse, die eine Schere. Machen Sie einen Mittelschnitt vom Hals bis zur Nase und entfernen Sie die Nackenmuskulatur mit Schere oder Zange, so dass Schädel ausgesetzt ist. sezieren Sie vorsichtig die Schädelknochen und Duras aus dem Gehirn heraus.
- Extrahieren Sie das Gehirn und legen Sie das Rattengehirn in einem 50 ml konischen Röhrchen mit 4% Paraformaldehyd gefüllt über Nacht. Am nächsten Tag, waschen das Gehirn mit 1x PBS 3 mal und legen Sie sie in einer 30% igen Saccharoselösung.
- Nachdem sich das Gehirn an der Unterseite der 30% Saccharose-Lösung vollständig sinkt, legen Sie das Gehirn in der cryomold mit OCT-Verbindung bei -20 ° C in Kryotom. Scheibe das Gehirn in koronalen Ebene bei einer Dicke von 40 um und einem Intervall von 200 & mgr; m.
- Führen GFP Immunhistochemie - Färbung mit dem Schiebeverfahren 14. Anwenden primärem Antikörper (1: 200 Anti-Green Fluorescent Protein, Kaninchen-IgG-Fraktion) zu Hirnschnitten über Nacht bei 4 ° C. Am 2. Tag, wasche mit 1% Phosphat - gepufferte Salzlösung mit Tween-20 (PBST) Lösung 3 mal sowie die Anwendung des sekundären Antikörpers (1: 500 von Ziegen - Anti-Kaninchen - IgG (H + L)) für 1 Stunde. Spülen Sie die Folie mit 1% PBST 3 mal. Legen Sie das Deckglas auf das Gehirn in Scheiben schneiden.
- Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Anregungswellenlänge470 nm, Emissionswellenlänge 525 nm, Vergrößerung 5fach), beachten Sie bitte die AAV-GFP transduziert Axone in der inneren Kapsel. Vergleichen Sie die Standorte der transduzierten Axone mit dem Rat Brain Atlas 15 die stereotaktischen Koordinaten der transduzierten Axone zu bestimmen
- Pre-Läsion Einstellung der Lichtintensität Geeignet für Capsular Infarkt Modellierung
- Aufbau der optischen Neural - Schnittstelle
- Schneiden Sie eine passende Länge (4 cm) einer 27-Gauge-Spinalnadel mit einem Stilett mit einer Schneidbohrer innen mit.
HINWEIS: Das Schneiden kann das Rückennadelspitze zu komprimieren und zu vernichten; das Stilett zu entfernen und die spinale Nadelspitze polieren das zerkleinerte Teil der Spinalnadel und Aufrechterhaltung der inneren Kaliber der Spinalnadel zu entfernen. - Streifen eine geeignete Länge (10 cm) des Mantels der optischen Faser (125 & mgr; m mit einem 62,5 & mgr; m-Kern) von einer Seite Rangierkabel.
- Legen Sie die unjacked optische fiber in das Metallrohr (Außendurchmesser: 3,8 mm, Innendurchmesser: 3,3 mm und Länge: 17 mm), die dann um die Faser festgeklemmt wird. Das Metallrohr ist hilfreich, um den Raum zwischen der optischen Faser und der Nabe der Spinalnadel zu füllen. Klemmen Sie den unteren 1/2 des Metallrohres mit einem Presser zweimal.
- Tragen Sie die wärmehärtbare Epoxy auf der optischen Faser und legen Sie die optische Faser in die Spinalnadel. Tragen Sie eine zusätzliche Epoxy auf den leeren Raum in der Nabe. Härten des Epoxy 20 min bei 100 ° C für eine stabile Fixierung.
- Spalten die optische Faser, die aus der Spinalkanüle ragt und zu polieren, die optische Faser an der Spitze der Spinalnadel mit Diamant Läppen (Polieren) Blätter.
- Schließen Sie den FC / PC-Stecker Teil der Patchkabel an den Koppler von grünen Laser-System und messen die Lichtstärke von der Spitze der optischen Faser unter Verwendung von digitalen optischen Leistung und Energiezähler.
- Schneiden Sie eine passende Länge (4 cm) einer 27-Gauge-Spinalnadel mit einem Stilett mit einer Schneidbohrer innen mit.
- Aufbau der optischen Neural - Schnittstelle
2. PhotothromBotic Infarkt Läsion in der inneren Kapsel
- Sterilisieren alle chirurgischen Werkzeugen und Elektroden einen entsprechenden Sterilisator (Dampf oder Plasma-Sterilisator) verwendet wird. Verwenden Sie Dampf-Sterilisator bei 121 ° C als Einstellung von 30 Minuten für die Sterilisation und 30 min für trocken.
- Anästhesieren das Tier (~ 400 g, 11-13 Wochen) mit einem Gemisch von Ketamin-Hydrochlorid (100 mg / kg) und Xylazin (7 mg / kg) über eine intramuskuläre Injektion. Schauen Sie sich die Tiefe der Anästhesie durch Pfote Kneifen. Aufrechterhaltung der Körpertemperatur bei 37,5 ± 0,5 ° C über ein Heizkissen unter dem Körper des Tieres.
- Legen Sie das Tier in einem stereotaktischen Rahmen ein Ohr bar und Mund Halter verwenden.
- Sauber und die Operationsstelle mit 70% Alkohol und Povidon-Jodlösung zu desinfizieren. Infiltrieren 2% Lidocainhydrochlorid unter der Kopfhaut in der beabsichtigten Schädel Inzisionsbereich die intraoperative Schmerzen zu reduzieren. Bewerben Tierarzt Augensalbe Trocknen der Augen zu vermeiden.
- Tragen Sie einen sterilen Tuch über die einimal und setzen die operativen Standorten. Pflegen Sie alle Verfahren unter sterilen Bedingungen.
- Führen Sie eine Mittellinie Schädel Schnitt von 2 cm und einfahren, die Haut auf bilateraler Ebene mit Draht Retraktoren. Trocknen Sie den Schädel mit Wattestäbchen und Wasserstoffperoxid.
- Stellen Sie die Höhe der Nase Klammer, bis die Bregma und Lambda auf der gleichen Ebene ausgerichtet sind. CRITICAL STEP: Diese Ausrichtung ist wichtig zur korrekten eine tiefere Struktur nähern, beispielsweise in einen Infarkt Läsion in der inneren Kapsel in dem Hauptversuch durchgeführt wird.
- Machen Sie ein Loch (Durchmesser: 2 mm; AP: -2.04 von Bregma; ML: ± 3,0 von der Mittellinie) unter Verwendung eines Bohrers photothrombosis zu induzieren.
- Polnisch und reinigen Sie die optische Faserspitze der optischen Schnittstelle. Befestigen Sie die ONI zum Stereotaxierahmen ohne sich zu verbiegen. Überprüfen Sie die Spitze des ONI und wischen sie sich deutlich vor und nach dem Einsetzen der optischen Schnittstelle.
- Messung der Laserintensität von der Spitze der optischen Faser vor dem Einsetzen des optical-Schnittstelle an die Zielstelle des Rattenhirns. Stellen Sie die Laserintensität auf 3,5 mW, wie durch Vorchirurgischer Schritte bestätigt, an der Spitze der optischen Faser.
- Legen Sie die ONI in den Zielbereich der inneren Kapsel (-7,8 mm von Vorchirurgischer Schritt bestätigt) durch das Bohrloch.
- Pflegen Sie die Körpertemperatur bei 37,5 ± 0,5 ° C während photothrombosis. Eine niedrigere Körpertemperatur kann nicht das erwartete Ausmaß des Infarkts produzieren. Injizieren Rose Bengal (2 ml / kg) durch die Schwanzvene.
- Schalten Sie den 532 nm grünen Laser für 90 sec 1 min nach der Rose Bengal-Injektion. Nach der Bestrahlung, entfernen Sie die ONI aus dem Gehirn. Nach der Operationsstelle Reinigung, sichern die Wunde, die Wunde mit 3-0 Nylonnaht sichern; lassen Sie die Ratte aus der stereotaktischen Rahmen und überträgt es auf eine Erholung Kammer.
- Für scheinoperierten Gruppe (SOG), eine identische Läsion Fassungsverfahren, mit Ausnahme der Injektion von Kochsalzlösung (0,2 ml / 100 g) anstelle von Rose-Bengal auszuführen.
- Pflegen Sie die Körpertemperatur (37 ° C) mit Heizkissen nach der Operation und verabreichen Antibiotika (zweite Generation Cephalosporin, 0,1%, 1 ml) über eine intramuskuläre Injektion. Nicht das Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Nicht postchirurgische Tiere in den Käfig von anderen Tieren besetzt, bis sie vollständig erholt.
HINWEIS: Preliminary Experiment wurde in den gleichen Verfahren durchgeführt, um die optimale Lichtintensität von 1 mW bis 5 mW, und das Verfahren zu finden, kann erforderlich sein, um die zufriedenstellenden Ausmaß der Läsion in unterschiedlichen Zustand zu erwerben.
3. Bewertung der Capsular Infarkt Läsion
- Verhaltenstest und Tiergruppierung
- Führen einzelne Pellet Erreichen Aufgaben wie Whishaw et al. 14 beschrieben , die motorisches Defizit des forelimb täglich für 1 Woche nach dem Schlaganfall Modellierung zu bewerten. Führen Sie eine einzelne Pellet Erreichen Aufgabe(SPRT) in Lebensmitteln beschränkt Tiere (90% der Kontrolle des Körpergewichts) mit klarem Plexiglas (30 x 15 x 35 cm Höhe) mit einem 1 cm breiten Schlitz und einem Nahrungsmittelregal in der Vorderseite der Mitte der Vorderwand.
- Legen Sie ein Pellet auf das Essen Regal schräg kontralateral zur bevorzugten forelimb. Verwalten 20 Pellets pro Sitzung für 3 Wochen.
HINWEIS: Eine erfolgreiche Reihe von SPRTs wird als Reichweite definiert, in dem das Tier eine Futterpellet ergreift und legt sie in den Mund, ohne sie fallen zu lassen. - Berechnen der Partitur als Prozentsatz der erfolgreich erreicht, die durch die folgende Formel definiert ist:
HINWEIS: Wir teilen Tiere in 3 Gruppen: Die scheinoperierten Gruppe (SOG), moderate Erholung Gruppe (MRG) und eine schlechte Erholung Gruppe (PRG). Wenn ein nach Schlaganfall SPRT-Score> 50%, klassifizieren wir die Ratten als MRG, die das Vorliegen einer erheblichen Verletzung anzeigt, nicht aber eine vollständige Zerstörung der target. Wenn der nach Schlaganfall SPRT-Score <50% im Vergleich zum Vorhub SPRT-Score, klassifizieren wir die Gruppe als PRG, die im Ziel komplette Läsion anzeigt.
- Neurohistologische Bestätigung der Infarkt Läsion
- Führen kardialen Perfusion mit 4% Paraformaldehyd wie zuvor beschrieben. Nachdem sich das Gehirn in den 30% igen Zuckerlösung vollständig sinkt, bei einer Dicke von 10 um und einem Intervall von 200 & mgr; m koronale Schnitte auszuführen 4 ein Mikrotom oder Kryotom verwenden.
- Stain mit H & E, Nissl, Luxol schnell blau-PAS, Neurofilament Protein-L oder Säure gliafibrilläres Proteinfärbung und beachten Sie die histologischen Befunde, die optimale Lichtintensität zu bestimmen, die die gesamte Breite der inneren Kapsel im Zielbereich Färbung zu beobachten abdecken kann 4,17.
- Mit ImageJ Software, messen die Lautstärke des photothrombotic Infarktbereich der inneren Kapsel auf die Gehirn gleitet.
- Um das Volumen der Infarktbereich messen, starten Sie die 'ImageJ' Software. Zum Öffnen der Dateien gestapelt werden, wählen Sie "Image to Stacks '(' Bild '→' Stacks '→' Image to Stacks '). Bearbeiten Dateinamen und wählen Sie "Stellen Sie den Maßstab" ( "Analysieren" → "Stellen Sie den Maßstab ') Skala zu bearbeiten.
- In 'Plugins', wählen Sie 'messen Stacks' Volumen oder Bereich der Bilder zu berechnen. Legen Sie die Distanzintervall von 2 Bildern in 'Slice-Abstand ". Machen Sie eine Zeichnung des ROI (Region of Interest) aller Bilder und klicken Sie auf "Messen".
HINWEIS: Die Software 'ImageJ' berechnet automatisch die Fläche und das Volumen jedes Bildes und Gesamtvolumen von ihnen.
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Representative Results
Die hier vorgestellte Methode soll eine umschriebene Kapsel Infarkt mit einem anhaltenden Motor-Defizit zu schaffen. Daher ist es wichtig, richtig das Ziel innerhalb der inneren Kapsel in der vor der Operation Schritt bestimmen. Die somatotopen Kartierung der pyramidalen Fasern in der inneren Kapsel ist bisher nicht geklärt ist. Um richtig das Ziel innerhalb der inneren Kapsel zu identifizieren, muss der forelimb Bereich abgegrenzt werden. Eine Injektion von AAV-GFP in die forelimb Bereich des motorischen Kortex kann die Axone der Pyramiden Fasern in der inneren Kapsel (Abbildung 1). Andere neuronale Tracer verfolgen, wie biotinyliertes Dextran Amin (BDA), kann dafür verwendet werden , Zweck. Die stereotaktischen Koordinaten des Ziels innerhalb der inneren Kapsel kann durch Verfolgen der axonale Projektionen erläutert, die aus der forelimb Bereich des motorischen Kortex zu der inneren Kapsel stammen.
Abbildung 1. Bezeichnung des Vorderbein Bereich in der inneren Kapsel 2 Wochen nach der Injektion von AAV-GFP. GFP-transduzierten axonalen Fasern , die aus dem forelimb Bereich des motorischen Kortex entstanden sind im ventrolateralen Thalamuskern (Pfeile) gezeigt und der kaudale Teil der inneren Kapsel (Pfeilspitze). Die gestrichelte Linie zeigt die Kontur der inneren Kapsel, und die Zahlen beziehen sich auf die Abstände von Bregma. Hippo, Hippocampus; Cpu, Nucleus caudatus Putamen; VL, ventrolateral Kern; IC, innere Kapsel. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die optimale Lichtintensität kann unterschiedlich sein in Abhängigkeit von der Belastung und dem Körpergewicht des Tieres und der Art und Durchmesser der optische Fasern. Daher sollte die optimale Lichtintensität separat vor der Hauptinfarkt Läsion Experiment bestimmt werden. Mit dem photothrombotic Verfahren kann die Lichtintensität allmählich erhöht werden , bis das Ausmaß der Läsion die gesamte Breite der inneren Kapsel schützt , ohne die benachbarten grauen Substanz Strukturen zu zerstören (Abbildung 2). Die optimale Lichtintensität durch den Vergleich der histologischen Umfang überprüft werden kann des Infarkts Läsion und Standorte.
Abbildung 2. Umfang der Infarkt Läsionen Quer durch Variieren Intensität des Laserlichts von 2 mW bis 5 mW 2 Wochen nach Photothrombotic Läsion. Die optimale Lichtintensität zwischen 3 mW und 4 mW in diesem experimentellen Einstellung betrachtet werden. Die Pfeile zeigen die Infarkt Läsion./53281/53281fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Wir bevorzugen die MND in dem die optische Faser in einem dünnen Metallrohr (Spinalnadel) enthalten ist, zu verwenden. Die optische Faser kann entstehen minimale Lichtstreuung von der Seite der Faser, die geeignet ist, zusätzliche neuronale Schäden entlang der optischen Faser-Darm-Trakt zu erzeugen. Umhüllung der optischen Faser ist auch vorteilhaft , um das Biegen der optischen Faser in tiefer Ziele zu verhindern, sowie die ONI zur stereotaktischen Rahmens (Figur 3) zu befestigen.
Abbildung 3. Aufbau der optischen-neuronalen Interface (ONI). (A) Schneiden der Spinalnadel. (B) Abziehen der optischen Faser. (C & d) Die Verankerung Metallrohr über das eingeführt wirdabisolierten optischen Faser und eng die optische Faser an der Nabe der Spinalnadel zu sichern. (E) Das Epoxy-Added optische Faser wird in die Spinalnadel eingeführt. (F) Das Epoxid wird 20 min bei 100 ° C gehärtet. (G) Die optische Faser wird an der Spitze der Spinalnadel gespalten. (H) Die optische Faser wird poliert. (i) Die Lichtstärke von der Spitze der optischen Faser gemessen wird. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die photothrombotic Verfahren produzieren reproduzierbare Läsionen und Standorte mit ~ 70% Erfolg in motorischen Störungen. Typische Kapselinfarkt Läsion umfasst die ventrodorsal Dimension der Kapselfasern (4A). Ferner erstreckt sich die Infarkt Läsion entlang der anterior - posterioren Achse der inneren Kapsel aufgrund der erhöhten Lichtstreuung innerhalb der Faser Kapsel. (4B) Der optische Trakt unterhalb der inneren Kapsel befindet besteht aus der weißen Substanz Fasern; Somit ist es oft durch Bestrahlung mit einer erhöhten Lichtintensität beschädigt. Serienschnitte und Färbung sind erforderlich, um das gesamte Volumen und das Ausmaß des Infarkts zu bestätigen. Das Infarktvolumen betrug 0,63 ± 0,37 mm 3. Zur Beurteilung der Zerstörung der Kapsel Faser, Neurofilament und Luxol schnell blau-PAS Flecken sind hilfreich.
Abbildung 4. Mikroskopische Darstellung von Capsular Infarkt 3 Wochen nach Photothrombosis. Mikroskopische Auftreten von Kapsel Infarkt 3 Wochen nach photothrombosis. A) Hirnschnitt Frontalschnitt im Gehirn der Ratte. Pfeilspitzen zeigen den Darm-Trakt der Nadel optische Faser im Thalamus und bis zu inneren Kapsel. B) Serielle Nissl-Färbung des koronalen Hirnschnitten showi ng das ganze Ausmaß der Infarkt Läsion in der inneren Kapsel. Pfeilspitzen zeigen die Infarkt Läsion. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Der Erfolg der Modellierung kann durch Verhaltenstests unter Verwendung eines einzigen Pellets erreicht Aufgabe ausgewertet werden. Die Verhaltensleistung nach 1 Woche nach dem Infarkt Läsion ist ein guter Führer genaue Läsion zu bestätigen, was die anhaltende und deutliche Beeinträchtigung der SPRT trotz der täglichen Einzelpellet erreicht Training (Abbildung 5) begleitet. Sobald der Motor das Defizit im PRG gezeigt, das neurologische Defizit während Zeitraum von 3 Monaten der Beobachtung anhielt. Sham-operierten Gruppe zeigte nicht die signifikante Abnahme der SPRT Leistung nach der Operation.
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Abbildung 5. Änderungen in Einzel Pellet Erreichen Scores nach Capsular Infart 4,20. Die experimentellen Gruppen (PRG und MRG) zeigten signifikant verringerte Werte unmittelbar nach dem Infarkt Läsion im Vergleich mit der scheinoperierten Gruppe (SOG). Die MRG zeigt eine allmähliche Erholung der SPRT Leistungen, während der PRG persistent motorischen Beeinträchtigung im Laufe der Zeit zeigt. Op, photothrombotic Infarkt Läsion; PRG, schlechte Recovery-Gruppe; MRG, moderate Erholung Gruppe. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung von Mess Analyse von Abweichungen bestimmt. + SOG gegen MRG; * SOG gegen PRG. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das Modell Kapsel Infarkt präsentiert hier zeigt eine gezielte Läsion mit deutlichen und anhaltenden motorischen Beeinträchtigung in forelimb Funktion. Frühere Modelle von subcortical Kapsel Schlaganfall haben einen unzureichenden Grad an motorischen Beeinträchtigung und eine schnelle Recovery - Prozess 6,8,9 demonstriert. In diesem Sinne ähnelt dieses Modell die klinischen Kapselinfarktfälle, die langfristige Funktionsbeeinträchtigung aufweisen.
Die kritischsten Schritte in der Entwicklung eines umschriebenen Kapselinfarktmodells sind: 1), um die korrekte somatotopen Darstellung des Körperteils identifizieren soll die Funktion innerhalb der inneren Kapsel zu deaktivieren; 2) die optimale Intensität des grünen Lasers zu identifizieren, die die gesamte Breite der inneren Kapsel mit minimaler Beeinträchtigung der benachbarten grauen Substanz Strukturen zerstören kann; und 3) genau zu platzieren, die optische Faser in der Zielstruktur. Obwohl die vorgestellten Techniken können circumscribe induzierend Kapsel Infarkt-Modell mit einer hohen Replikationsrate (> 70%), kleine Unterschiede in der Ausrichtung und dem Grad der Vollständigkeit der Zerstörung die gesamte Breite der inneren Kapsel Abdeckung kann für verschiedene motorische Defizite ausmachen.
Die Pyramidenbahn ist in der vorderen Hälfte des hinteren Schenkel in der inneren Kapsel beim Menschen trotz der Kontroverse von somatotopen Organisation 15 gelegen. Im Gegensatz dazu gab es bei Nagern keine entsprechende Einstufung oder detaillierte Aufklärung der somatotopen Organisation der inneren Kapsel. Der Mangel an Wissen über die somatotopen Organisation führt oft zu falschen Ziele der Infarkt Läsion innerhalb der inneren Kapsel mit verschiedenen Motor Ergebnisse bei Kapselinfarktmodellen. Jedoch haben wir festgestellt, die GFP-Transduktion Axone im kaudalen Abschnitt der inneren Kapsel, die wahrscheinlich den Weg der forelimb motorischen Fasern darstellen. Darüber hinaus Läsion dieses Bereichs demonsed eine deutliche und anhaltende Defizit der forelimb erreicht Geschick. Aus diesem Grund empfehlen wir den kaudalen Teil der inneren Kapsel für die stereotaktische Läsion die Gültigkeit des Kapsel Infarkt-Modell zu verbessern.
Pre-Einstellung der Lichtintensität ist zwingend eine einheitliche Ausdehnung der Infarkt Läsion in Schlaganfallmodellen, weil das Tier Stamm, Körpergewicht, Lichtquelle und Arten von ONI zu produzieren, können verschiedene Größen von Infarkt erzeugen. Daher sollten Vorversuche mit unterschiedlichen Lichtintensitäten bei Versuchstieren mit dem gleichen Stamm und dem Körpergewicht durchgeführt werden, bis der zufriedenstellende Infarkt Läsion mit minimaler Lichtintensität erreicht wird.
Starke Lichtintensität, die die gesamte Breite des Kapsel Faser zerstören kann (anterior-posterior und dorsoventral Ausmaß), die mit minimalen Schäden an den benachbarten Strukturen in die forelimb Bereich entspricht, wird als die optimale Lichtintensität sein. Die forelimb Bereich der inneren Kapsel ist oben durch den Thalamus begrenzt und der Sehbahn inferior. Deshalb sollte die Tiefe der Insertion ONI genau den gesamten Umfang des IC in der dorsoventralen Richtung zu zerstören, bei gleichzeitiger Erhaltung der oberen und unteren benachbarten Strukturen. Ungenauen Platzierung der ONI führt zu einer unvollständigen Zerstörung des IC, die von dem Motor Defizit als Folge der synaptischen Plastizität der verbleibenden pyramidal Fasern in der inneren Kapsel zu einer schnellen Wiederherstellung führt. Bei der seriellen histologischen Untersuchungen, war der Störfaktor bei der Induktion eines persistenten motorische Defizite der falsche Positionierung des ONI, was zum Ausfall führt die gesamte Breite des PLIC 4,16 zu zerstören. Daher sollte eine sorgfältige Aufmerksamkeit das richtige Ziel zu erreichen bezahlt werden. Vor kurzem Blasi et al. Berichtet , dass ein dauerhafter rein motorische Defizite , indem sie ein Infarkt Läsion im hinteren inneren Kapsel hergestellt werden kannVerwendung von Endothelin-1 (ET-1) 17. Jedoch kann ET-1 die benachbarten grauen Substanz Struktur durch die Diffusion von ET-1 zu zerstören.
Verhaltenstests ist ein sofort verfügbar Benchmark im Labor die Bildung von Infarkt-Läsion in der inneren Kapsel zu beurteilen. Allerdings Auswertung der Motorleistung eine Woche nach dem Infarkt Läsion wird empfohlen, die Tiere in gemäßigten und schlechte Erholung Gruppen zu unterteilen. Moderate Erholung wurde als eine Erhöhung der Performance-Score von> 50% im Vergleich mit dem Ergebnis vor Läsion definiert, während schlechte Erholung als Erholung von <50% festgelegt wurde. Unter den forelimb Motor Verhaltenstests ist die einzige Pellet Aufgabe Erreichen eines der empfindlichsten Tests für sowohl quantitative als auch qualitative Messungen von Schlaganfall-induzierten Motorleistungen 14. Die Aufgabe quantitativ misst die Erreichung Erfolg, während gleichzeitig eine Analyse der forelimb Nutzung vorsehen wie Greifen und ein Lebensmittel Abrufenpelletieren. Die qualitative Analyse des Erreichens Bewegung ist auch hilfreich , um die Qualität der Wiederherstellung nach Schlaganfall zu unterscheiden durch echte funktionelle Erholung oder eine Entschädigung zu unterscheiden 20. Hier stellen wir kurz beschrieben die quantitative Messung des SPRT; jedoch, Filmen und Scoring qualitative Analyse auf einer Frame-by-Frame-Analyse auf Basis verwendet, wird für weitere detaillierte Analyse empfohlen.
Die vorgestellten Techniken hier braucht nicht auf die Induktion von umschriebenen Kapsel Infarkt Modellierung beschränkt werden. Die Technik kann in anderen Bereichen der weißen Substanz, wie dem Corpus callosum, vordere Kommissuren und Verbindungsfasern unter den neuralen Strukturen zur Induktion einer Infarkt Läsion aufgetragen werden. Die Kombination der kleinen ONI und photothrombotic Technik basiert auf den optischen Eigenschaften der weißen Substanz geeignet ist, die zielgerichtete Strukturen mit minimaler Beschädigung an den benachbarten Strukturen zu zerstören. Zum Beispiel kann lacunar Infarkte produzieren werden leichtd durch die subkortikalen Strukturen gezielt in Bezug auf motorische, kognitive und Gedächtnisfunktionen. Wenn die Zielstruktur groß ist, können mehrfache Insertionen des ONI und verschiedenen Targeting und angewinkelten Flugbahnen erforderlich sein, um das gewünschte Ausmaß der Läsionen zu erzeugen.
Es gibt mehrere Einschränkungen in dieser Technik. Die Technik ist ausreichend, um die Folge der Infarkt Läsion in der PLIC und anschließende Erholung zu demonstrieren. Allerdings ist dieses Modell nicht das gesamte Spektrum der menschlichen WMS reflektieren, weil photothrombotic Zerstörung der weißen Substanz leicht von menschlichen WMS unterscheidet. Folglich können verschiedene Funktionen in der frühen Phase der photothrombotic Läsion Erkenntnisse neurobiologischen oder MRT-Bildgebung zeigen. Daher sollte dieses Muster entsprechend dem Modell der Vor- und Nachteile abwägen verwendet werden. Technisch gesehen, sind nicht alle Operationen können die deutliche und dauerhafte motorische Defizite in diesem Modell zu produzieren, weil es sehr genaue Verfahren erfordert. Specifically sind ausgebildete und erfahrene Hände erforderlich, um die hohe Reproduzierbarkeit bei der Erzeugung dieses Modells zu erzeugen.
Abschließend wird die kombinierte Verwendung einer photothrombotic Technik, die Optimierung der Lichtintensität, und die korrekte Ausrichtung ist eine nützliche Technik eine umschriebene Kapselinfarktmodell zu erzeugen. Dieses Modell wird hilfreich sein, nicht nur an der WMS Verhaltens-, Schaltung zu untersuchen, und zellulärer Ebene, sondern auch die Nützlichkeit neuer therapeutischer und Rehabilitationsmaßnahmen zu beurteilen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Institut für Medizinische Systemtechnik (IMSE) & GIST-Caltech Collaborative Fonds (K04592) von GIST und von der Basic Science Research Program durch NRF Korea durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und zukünftige Planung finanziert unterstützt (NRF-2013R1A2A2A01067890).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
| Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
| Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
| Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
| Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
| Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m |
|
| Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
| Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS |
|
| Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
| Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
| Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
| Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
| Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
| Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
| Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
| AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
| Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
| Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
| Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
| Hand Piece Drill | Seshin | ||
| Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
| Ketoprofen | UNIBIOTech |
References
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