Abstract
Relativamente células madre somáticas quiescentes apoyan la renovación celular de toda la vida en la mayoría de los tejidos adultos. Las células madre neurales en el cerebro adulto de mamíferos están restringidos a dos nichos neurogénicos específicos: la zona subgranular del giro dentado del hipocampo y la zona ventricular-subventricular (V-SVZ; también llamada zona subependimario o ZEE) en las paredes de los laterales ventrículos. El desarrollo de estrategias de transferencia génica in vivo para las poblaciones de células madre adultas (es decir, las del cerebro de los mamíferos) que resulta en la expresión a largo plazo de los transgenes deseados en las células madre y su progenie derivada es una herramienta crucial en la investigación biomédica y biotecnológica actual. Aquí, se presenta un método directo in vivo para la modificación genética estable de células de ratón adulto V-SVZ que se aprovecha de la infección de ciclo independiente de células por LVs y la citoarquitectura altamente especializado del nicho V-SVZ. En concreto, el protocolo actual implicaes la inyección de LVs vacíos (control) o LV codifican casetes de expresión de transgén específica en cualquiera de la propia V-SVZ, para la dirección in vivo de todos los tipos de células en el nicho, o en el lumen del ventrículo lateral, para la focalización de ependimarias Sólo las células. Los casetes de expresión se integran en el genoma de las células transducidas y las proteínas fluorescentes, también codificadas por el LVs, permitir la detección de las células transducidas para el análisis de células de efectos autónomos y no autónomos, de nicho dependiente en las células y se marcaron su progenie.
Introduction
La zona ventricular-subventricular murino (V-SVZ), en las paredes del ventrículo lateral hacia el cuerpo estriado, es una región germinal muy activo en el que un proceso continuo de replicación de células progenitoras y de diferenciación como resultado la producción persistente del bulbo olfatorio (OB interneuronas) y oligodendrocitos del cuerpo calloso 1. La generación de toda la vida de estas células parece estar apoyada por la presencia en esta región de las células madre neurales (NSC, también llamadas células B1), que expresan la proteína ácida glial fibrilar antígeno de los astrocitos (GFAP) y marcadores de células tales como nestina, Id1 madre y Sox2 2. Que expresan GFAP células B1 generan células (TAP) (células C), que expresan factores de transcripción Dlx2 tránsito amplificar progenitora (distal-less homeobox 2) y Ascl1 (mamíferos achaete-Schute homólogo 1) y dividir rápidamente un par de veces antes de que den origen a neuroblastos migran (células a) o oligodendroblasts 3. Recién generada prolifeneuroblastos rativa migran hacia delante, formando la corriente migratoria rostral (RMS) para el OB, en la que se integran en el granulares y capas glomerulares como interneuronas inhibitorias diferenciadas. Migración de oligodendroblasts jóvenes se mueven a la CC, donde se convierten en células NG2 positivo inmaduras que siguen dividiendo a nivel local o diferenciarse en oligodendrocitos maduros myelinating 1,4.
células B1, que derivan de las células gliales radiales fetales, conservan la morfología alargada y polarizada de sus predecesores y exhiben una relación altamente especializada con su nicho. Ellos abarcan entre el epéndimo, que se alinea el ventrículo y la red de vasos sanguíneos que irrigan el nicho V-SVZ. El pequeño proceso apical de las células se intercala entre B1 ependymocytes multiciliated y termina en un solo cilio primario no móvil, que en los procesos basales se extiende largas distancias para abordar el plexo vascular plana que irriga este nicho de final en el basal lámina de los capilares del plexo 2,5-8.
La forma más fiable para distinguir B1-NSC a partir de astrocitos no neurogénicos, que también son GFAP +, en el nicho intacta V-SVZ se basa en todo el montaje de preparaciones de la pared lateral del ventrículo y su análisis por microscopía confocal 3-D después de inmunotinción para GFAP para etiquetar el proceso apical B1-NSC delgada, β-catenina para delinear las membranas celulares, y, o bien γ-tubulina como un marcador de cuerpos basales ciliar o acetilado α-tubulina para etiquetar la extensión de cada cilio 5,8. Las observaciones de estos enteros monturas de la superficie ventricular han indicado que las células ependimales B1 y están dispuestas en "molinetes" 5, en el que los procesos apicales uniciliated de uno o varios GFAP + células B1 están rodeadas por una roseta de células ependimarias multiciliated.
La morfología característica de células B1 se correlaciona con la evidencia experimental indicating que los vasos sanguíneos células endoteliales y ventriculares / líquido cefalorraquídeo (LCR) constituyen las fuentes reguladas de señales solubles que actúan sobre células madre neurales 2,6,9-11. En la superficie ventricular, y las interacciones homotipica heterotípicos apico-lateral con células ependimarias y B1 incluir uniones estrechas y uniones adherentes 5,12. Por otra parte, las moléculas de adhesión implicadas en los complejos de unión entre las células B1 y ependimarias, tales como N-cadherina y V-CAM, se ha demostrado que regular no sólo el posicionamiento altamente organizada de B1 en el nicho de V-SVZ, sino también su quiescencia 12 , 13. La monocapa de células ependimarias-B1 parece actuar como una barrera de difusión que permite el flujo regulado de agua y las moléculas pequeñas de la CSF, pero restringiendo el paso intercelular de proteínas grandes 10,11. La evidencia experimental indica que la celda B1 cilio apical posición única podría desempeñar un papel como un sensor de polipéptidos presentes en el LCR 2 de señalización,5-7. Las células ependimarias son, per se, también una fuente de señales solubles y unidas a la membrana con un papel en la regulación del comportamiento NSC 14,15.
Nucleósidos trazables, tales como bromo-desoxiuridina (BrdU), o retrovirus han sido ampliamente utilizados para marcar las células progenitoras, incluyendo NSCs, in vivo. Sin embargo, estos métodos no son óptimas para el rastreo destino a largo plazo ya que las señales BrdU diluido a través de repetidas divisiones celulares y retrovirus parecen estar dirigidas preferentemente de forma transitoria células debido a su requerimiento de la proliferación celular para la transducción 16,17 amplificar. Para examinar NSC fisiología in vivo, incluyendo las interacciones con los componentes de nicho, es crucial establecer un método para etiquetar y rastrear células rara vez se dividen, como B1-NSCs son en gran parte de reposo y sus células ependimarias vecinos nunca se dividen en condiciones fisiológicas 3. Aquí, se muestra que los vectores lentiviral (LV) permiten una marca de genes de alta eficienciaING y modificación a largo plazo de NSCs adultas y que no se dividen las células ependimales, debido más razonablemente a su capacidad para transducir y para integrarse en el genoma de las células diana de una manera independiente del ciclo celular. Por otra parte, se muestra cómo la vía de administración y virales ayuda título para transducir específicamente a las células ependimarias, pero no los linfocitos B1 permitiendo así que el análisis de nichos dependiente, efectos ependimarias en células madre neurales.
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Protocol
DECLARACIÓN DE ÉTICA: Este protocolo sigue las pautas de cuidado de animales de la Universidad de Valencia conforme a la Directiva Europea 2010/63 / UE.
1. Generación de LV para estudios in vivo de marcado (véase la figura 1a)
PRECAUCIÓN: El procedimiento descrito en este documento es de bioseguridad de nivel 2, por lo tanto, realizar todos los procedimientos siguientes en una campana de bioseguridad. Asegurarse que el personal de investigación son suficiente formación y experiencia en todos los procedimientos. Use equipo de protección personal, incluyendo bata, guantes dobles y protección adecuada para los ojos. Por último, la descontaminación a fondo todas las herramientas y las superficies que podrían haber estado en contacto con los virus de acuerdo con las prácticas de instalación de desinfección autorizados (frotando con etanol al 70%, el 10% de lejía y / o tratamiento en autoclave).
- La producción de LV embrionarias humanas en células 293T de riñón
- Iniciar este protocolo mediante la preparación de ADN puro para la transfección. Preparar y purificar cada plásmido por doble graduado de CsClient centrifugación u otros métodos de columnas disponibles en el mercado que producen ADN libre de endotoxinas. En este protocolo se ha utilizado el plásmido vector de transferencia PRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre. Recomendadas plásmidos de embalaje son fundamentales pMDLg / pRRE y pRSV.REV y sobre del plásmido pMD2G 13,18,19.
- Veinticuatro horas antes de la transfección, la placa de 5 x 10 6 células 293T en Modificado de Iscove Medio (IMDM) de Dulbecco (véase la Tabla de Materiales) en una placa de plástico 10 cm con el fin de obtener un cultivo de aproximadamente 1.4 a 1.3 confluente para transfección. Incubar a 37 ° C en un incubador humidificado en una atmósfera de 5 a 7% de CO 2.
- Sustituir el medio con medio fresco 2 horas antes de la transfección.
- En una mezcla estéril tubo de microcentrífuga de 1,5 ml 10 g de plásmido vector de transferencia (que contiene el ADNc del transgén o el shRNA para ser entregados) con 2,5 g de la pRSV.REV y 5 g de los plásmidos de embalaje pMDLg / pRRE, y 3,5 y #181; g del plásmido de la cubierta pMD2G. Compensar la solución plásmido a un volumen final de 450 l con tampón TE 0,1x (véase la Tabla de Materiales) / dH 2 0 (2: 1). A continuación, añadir 50 l de 2,5 M de CaCl2.
- Formar el precipitado por la adición gota a gota de 500 l de la solución salina tamponada con Hepes 2x (HBS, véase la Tabla de Materiales) solución a la mezcla de 500 l de ADN-TE-CaCl 2 mientras vórtex a toda velocidad.
- Añadir el precipitado a las células 293T inmediatamente. Hacer girar suavemente la placa para mezclar. Volver a las células a la incubadora y cambiar el medio 14 a 16 horas después de la transfección.
- Recoger los sobrenadantes de las células 30 horas después de cambiar los medios de comunicación. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de nitrocelulosa de 0,22 micras de poro y proceder a la concentración.
- Concentración de LVs
- Se concentra el medio acondicionado por ultracentrifugación a 50000 xg (19000 rpm con SW-28 rotor de ultracentrífuga) de 2hr a temperatura ambiente (RT) en un tubo de rotor cónico transparente 30 ml de polipropileno.
Nota: Use adaptadores de ultracentrífuga para tubos de rotores cónicos (ver tabla de Materiales). - Desechar los sobrenadantes por decantación y resuspender los gránulos en un volumen pequeño (200 l o menos, si se lleva a cabo sólo una centrifugación) de tampón fosfato salino (PBS; véase la Tabla de Materiales). A continuación pipetear arriba y abajo unas 20 veces.
- Reunir las suspensiones y se concentra de nuevo por ultracentrifugación, también a 50.000 x g (23.000 rpm con SW-55 rotor de ultracentrífuga) durante 2 horas a temperatura ambiente. Utilice tubos de rotores de polipropileno transparente con un volumen nominal de 5 ml (véase la Tabla de Materiales).
- Resuspender el sedimento final en un volumen muy pequeño (1/500 o 1 / 1.000 del volumen de partida de medio) de PBS estéril y agitar en una rueda giratoria durante 1 hora a RT. Dividir en alícuotas pequeñas (5-20 l) yfellos Reeze a -80 ° C.
- Tratar a todos los tubos vacíos con lejía al 10% antes de desechar.
- Se concentra el medio acondicionado por ultracentrifugación a 50000 xg (19000 rpm con SW-28 rotor de ultracentrífuga) de 2hr a temperatura ambiente (RT) en un tubo de rotor cónico transparente 30 ml de polipropileno.
- La valoración lentiviral usando citometría de flujo
- El día anterior, la placa de 5 x 10 4 células HeLa por pocillo en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos en 2 ml de medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) (véase la Tabla de Materiales). Incubar a 37 ° C en un incubador humidificado en una atmósfera de 5 a 7% de CO2 durante 24 hr.
- En el día de la valoración, descongelar una alícuota de la solución madre viral y preparar diluciones seriadas, de 10 -3-10 -8, en DMEM.
- Para ello, tomar una placa de 24 pocillos y añadir 2 ml de DMEM al primer pocillo y 1,8 ml de los siguientes pozos. A continuación, añadir a la primera y 2 l de la solución madre viral concentrada (a una dilución final de 1: 1.000 o 10 -3).
- Después de pipetear varias veces para mezclar la solución, la punta del cambio y la transferencia de 200 l de la dilución 10 -3al segundo también. Repita el procedimiento en serie en los siguientes pozos hasta que se realiza la dilución 10 -8.
- Tome células HeLa chapadas el día anterior de la incubadora. Retirar con cuidado medio de los pozos. Añadir 1 ml de cada dilución viral junto con 1 l de 8 mg / ml de bromuro de hexadimetrina a los pocillos que contienen células HeLa. Hacer girar suavemente la placa para mezclar.
Nota: Se añadió bromuro de hexadimetrina para aumentar la adsorción del virus a las células en cultivo. - Volver a las células a la incubadora y permitir que la infección de proceder durante 72 horas. Después de eso, se elimina el medio, se lavan las células una vez con PBS y añadir 200 l de tripsina-EDTA (véase la Tabla de Materiales) a cada pocillo.
- Después de 5 min a 37 ° C, añadir 2 ml de PBS a cada pocillo y las células de la cosecha en tubos de citometría de flujo.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 min a RT y aspirar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento con 1 ml de soluti fijaciónen (electrón formaldehído grado microscopía de 1% y suero bovino fetal al 2% en PBS), a continuación, vórtice los tubos.
- Analizar las células en un citómetro de flujo utilizando un 488 nm de argón-ionlaser a 15 mW de potencia.
- Configurar el instrumento con la configuración estándar: la dispersión frontal (FS), dispersión lateral (SS), y la fluorescencia de GFP (525/40 nm). Seleccione compuerta población de células en una trama FS vs SS punto de excluir a los agregados de células y los desechos. Recoger fluorescencia en escala logarítmica. Calcular el número de células GFP + en cada muestra.
- Calcular título de vector utilizando la siguiente fórmula:% de GFP + / 100 x número de células infectadas x factor de dilución (DF) = unidades de transducción (UT) / ml.
Figura 1: Representación esquemática de las diferentes partes del procedimiento (a) de la Parte 1 de t.él protocolo: generación de LVs para estudios de marcación in vivo, a partir de la transfección de células HEK293T con plásmidos apropiados para generar los LVs a la determinación del título de virus mediante citometría de flujo utilizando la fórmula indicada. Los nombres de los plásmidos y los rotores de centrifugación se indican. (B y c) de la Parte 2 del Protocolo: inyección estereotáxica de LVs. "B" representa un ejemplo de una escala Vernier, un dispositivo que es parte de los instrumentos de estereotáxico y sirve para mediciones de finos. Como ejemplo, las flechas indican 4.23 cm. Una escala Vernier se utiliza para determinar las coordenadas en el antero-posterior (AP), medio-lateral (ML), y el eje dorso-ventral (DV) como se muestra en una vista superior (izquierda) y de una sección sagital (derecha ) del cerebro. "C" indica la posición del bregma como la intersección entre las suturas sagital y coronal. LVs se inyecta usando una jeringa. (D) los dibujos esquemáticos que muestran cómo el cerebro is procesada para el análisis. Los dos hemisferios se dividen y cada uno se divide en dos bloques. Bloquear "a", que contiene los OBs, se produce mediante un corte coronal a nivel AP inmediatamente posterior a la unión OB con el telencéfalo (bregma 2,46 mm; ver Paxinos' Atlas para una referencia). Bloque "B" es producido por dos cortes coronales, una en el nivel inmediatamente anterior al aspecto más rostral del cuerpo calloso (bregma 1,7 mm) y una segunda a nivel de la unión de los dos ventrículos laterales (bregma -0,22 mm). GL, la capa glomerular; GCL, capa de células granulares; st, el cuerpo estriado; cc, cuerpo calloso; ac, comisura anterior; lv, ventrículo lateral.
2. estereotáxica La inyección de LV en el / borde estriado V-SVZ o en el ventrículo lateral (véase la figura 1b)
- Preparación
- Esterilizar una jeringa capacidad de 5 l con una aguja de calibre 33 por la pulverización hacia abajo el cuerpo y aguja con 70% de etanol con el émbolosacó todo el camino. Repetidamente aspirar etanol a partir de un tubo de 1.5 ml y expulsar todo el camino a cabo varias veces, y enjuagar la jeringa a fondo con agua estéril después. Coloque la jeringa en forma segura a un lado de la campana de cultivo y deje que se seque.
- Preparar un recipiente de residuos biopeligrosos con 10% de lejía a un volumen adecuado para la inmersión de todos los residuos de este procedimiento (generalmente 200 ml en un recipiente de 500 ml).
- Preparar y precalentar una cama de agua C 37 ° llenando una bolsa de plástico sellable con agua y calentar a 37 ° C. Esto permitirá que los ratones que se recuperan después de la inyección.
- Eliminar stocks virales de -80 ° C almacenamiento en el congelador 1 hr antes de comenzar las inyecciones y colocar el vial en una rueda giratoria a temperatura ambiente. Después de la descongelación, mantener la población viral en hielo durante la época de las inyecciones. Antes de la inyección estereotáxica de LV, diluir los stocks virales concentradas a 10 6 TU / l usando PBS en la campana de cultivo.
- Desinfectar el área seleccionada para realizar la cirugía con un 70% de etanol.
- La microinyección de LV
- Seleccionar y esterilizar instrumentos necesarios para la cirugía (bisturí, taladro, pinzas y pequeñas).
- Anestesiar a un ratón de 6-8 semanas de edad por vía intraperitoneal (ip) inyección de una mezcla de veterinaria-supervisado de ketamina y medetomidina. Pesar cada animal y la dosis cada una con 50 a 75 mg de ketamina y 0,5 a 1 mg medetomidina por kg de peso corporal del ratón (alrededor de 100 a 125 l de la ketamina / medetomidina solución por ratón de trabajo).
- Evaluar el plano anestésico apretando los dedos del pie, la cola o el oído y la garantía de que el animal no muestra ninguna reacción.
- Una vez que se anestesia el ratón, inyecta por vía subcutánea butorfanol a una dosis final de 0,4-0,5 mg por kg de peso del ratón para minimizar el dolor post-quirúrgico.
- Afeitar el área entre las orejas y la desinfección de la piel utilizando un yodóforo tal como yodopovidona o 70% de etanol. Limpiar con un algodón estérilaplicadores -tipped. Tenga cuidado de no mojar en exceso el animal ya que esto puede agravar la hipotermia.
- Colocar el animal en posición boca abajo en un marco estereotáxico y fijar cuidadosamente el cabezal con las barras de oído y el apoyo para el paladar del aparato. Mantenga el ratón con un juego de almohadillas de calentamiento a 37 ° C y aplicar lubricante oftálmica para los ojos.
- Hacer una incisión de 1 cm de largo en la piel de la cabeza longitudinalmente con un bisturí, y retraer con suavidad la piel para exponer el cráneo con unas pinzas finas.
- Con cuidado, limpie la superficie del hueso con un aplicador con punta de algodón estéril. Limpiar el hueso del cráneo expuesta de cualquier tejido restante.
- El montaje de jeringa esterilizada en el dispositivo estereotáctica utilizando el soporte de jeringa.
- Mover eje del soporte de jeringa x, y y z hasta que la punta de la aguja de la jeringa se coloca en el bregma, el punto de conjunción donde la sutura sagital (longitudinal y medial) se perpendicularmente cortada por la sutura coronal (Figure 1b). Asegúrese de que la posición "cero" del eje dorso-ventral (DV) se encuentra en la superficie del cráneo al bregma.
- Mover la jeringa para las coordenadas X e Y de destino (véase la Tabla 1 y la Figura 1b).
| Región de inyección | coordenadas | ||
| Antero-posterior (AP) | Medio-lateral (ML) | Dorso-ventral (DV) | |
| SEZ / borde estriado | +0,6 mm | +1,2 mm | -3,0 mm |
| Ventrículo lateral | -0.3 mm | +1,0 mm | -2.6 mm |
Tabla 1: estereotáxica coordenadas de la inproyecciones. Para el AP y el eje ML, coordenadas X e Y se dan como una distancia (en mm) del bregma. "-" Indica "hacia la parte posterior". Para el DV coordenadas "cero" es la superficie del cráneo en el punto bregma y DV coordenadas indican la distancia (en mm) por debajo de este punto.
- Anotar la x, y, z las coordenadas de destino en la escala Vernier con el fin de ser capaz de volver a la zona de inyección más adelante. Marcar el hueso en las coordenadas X e Y usando un rotulador quirúrgico.
- Mover la jeringa fuera de la zona de trabajo.
- Usando un taladro eléctrico a hacer un agujero en el cráneo con cuidado de no dañar el cerebro. No perfore la superficie pial ya que esto puede dañar la superficie del cerebro.
- Cargar la jeringa con 1 l de la solución viral 10 6 TU / l. Use un medidor 33 de aguja afilada y biselada cuya punta tiene un ángulo de 10-12 °. Coloque la aguja de la jeringa en una ang 90 °LE con respecto a la superficie del cerebro.
- Mover la jeringa de nuevo al sitio de la inyección y moverlo hacia abajo hasta que la punta toque la superficie pial.
- Penetrar en el cerebro con la jeringa a la coordenada z en el eje DV.
- liberar lentamente la suspensión viral, a una velocidad de 0,2 l / min, con el fin de minimizar el daño al tejido cerebral debido a la presión excesiva de líquidos.
- Espere 5-10 min para minimizar el reflujo de la suspensión viral y luego retraer la jeringa muy lentamente. Seque cualquier exceso de líquido que puede aparecer en la superficie como resultado de la retracción de la jeringa usando un laboratorio de limpiar y colocarlo inmediatamente en el contenedor de residuos de bioseguridad que contiene blanqueador.
- Llevar al animal fuera del conjunto estereotáxica, colocarlo sobre una almohadilla caliente, y cerrar la herida utilizando adhesivo para la piel. Revertir la sedación usando 0,1-1,0 mg / kg de peso corporal atipamezol.
- Se inyecta por vía subcutánea Bupenorphrine a una dosis final de 0,1 mg por kg de peso del ratón cada 12 horas,comenzando 4 horas después de la administración del analgésico corta butorfanol duradera.
- Colocar el animal en una jaula de individualizada con una almohadilla caliente y vigilar de cerca hasta que el ratón se recupera de la anestesia. Coloque una bolsa de hidrogel en la jaula para ayudar al hidrato de animales después de la recuperación.
- Disponer de todos los residuos bio-contaminados en la eliminación del blanqueo de riesgo biológico líquido. Limpiar la jeringa mediante aspiración y expulsión de etanol y enjuague con agua. Desinfectar el área, el conjunto estereotáxica y el material quirúrgico que se ha utilizado con lejía y un 70% de etanol.
- Mantener los ratones inyectados aislados en la sala de bioseguridad de nivel 2 durante 24-48 horas después de lo cual se pueden transferir a una instalación convencional de vivienda
3. Análisis histológico
- Perfusión, la recogida de tejidos, y seccionamiento
- Profundamente anestesiar a los ratones con una mezcla de veterinaria-supervisado de medetomidina y ketamina (evaluar el plan anestésico pellizcando la toes, la cola o el oído), como se ha descrito antes.
- Transcardially perfundir los ratones con 25 ml de solución salina seguido de 75 ml de 4% PFA en PB a la misma velocidad 17.
- Extraer el cerebro y post-solucionarlo sumergiéndolo en al menos 10 veces su volumen de frío 4% PFA en PB para 1-16 hr (aumento de los tiempos posteriores a la fijación pueden disminuir la inmunorreactividad de algunos antígenos). Lavar a fondo las PFA restante con PB.
- Cortar el cerebro siguiendo las indicaciones de la figura 1d y pegar el bloque resultante al titular de un vibratome utilizando cianoacrilato.
- Recoger 30 secciones coronales seriadas micras de espesor en un vibrátomo. Almacenar los cortes de cerebro en placas de 24 pocillos múltiples con PB a 4 ° C. Para evitar la contaminación, 0,05% de azida de sodio se puede añadir a la solución de PB.
- La inmunohistoquímica
- Incubar las secciones de flotación libre en tampón de bloqueo (PB con azida de sodio 0,05%, 1% de glicina, suero de cabra normal al 5%, y 0,1% Tritsobre X-100) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave en una plataforma oscilante.
- Con cuidado eliminar el tampón de bloqueo con una pipeta, añadir una dilución apropiada de anticuerpo primario de conejo anti-GFP (véase la Tabla de Materiales) en tampón de bloqueo y se incuba el tejido con esta dilución durante 48 horas a 4 ° C con agitación suave.
- Lavar la solución de anticuerpo primario un mínimo de 3 veces con PB, un lavado cada 10 minutos.
- Incubar las secciones de flotación libre con una dilución adecuada de anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado) en solución de bloqueo (véase la Tabla de Materiales) durante 1 hora a RT y agitación suave. Protección de los cuerpos de la luz directa durante la incubación.
- Lavar la solución de anticuerpo secundario con PB, 3 veces, una vez cada 10 min, y contrateñir el tejido mediante la incubación de las secciones con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) a 1 mg / ml en agua durante 5 min. Lavar la solución DAPI enjuagando dos veces el ingenio y rápidamenteh de agua.
- Con cuidado, coloque las secciones sobre un portaobjetos de microscopio utilizando un pincel fino. Verter unas gotas de medio de montaje para las preparaciones fluorescentes (véase la Tabla de Materiales) sobre el tejido y se coloca cuidadosamente un cubreobjetos en la parte superior, la comprobación de que la solución de montaje se distribuye correctamente sobre toda la superficie y no hay burbujas. Apriete suavemente hacia abajo el cubreobjetos para drenar el exceso de medio de montaje.
- Cuando la solución de montaje se seca (2-16 hr), analizar la muestra por microscopía confocal de barrido láser con el láser de 488 nm.
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Representative Results
Sistema de entrega de genes mediada por LV se puede utilizar para el largo plazo en la transducción in vivo de células de la V-SVZ de ratón adulto, lo que permite su seguimiento y la modificación genética durante la proliferación, migración y diferenciación. La infección y la expresión son muy eficaces y producen numerosas células que se pueden distinguir fácilmente entre otras células no infectadas por la expresión del reportero incluido. Hasta ahora hemos visualizado células transducidas con GFP reporteros fluorescentes, dirigido por el promotor de la fosfoglicerato quinasa de expresión ubicua, pero otros reporteros o etiquetas de proteínas también se puede utilizar. Utilizamos rutinariamente anticuerpos para GFP en lugar de depender de la detección directa de la emisión reportero, ya que produce una señal fluorescente fuerte. Por otra parte, el cerebro pueden ser diseccionados frescos y se sumergieron en fijador pero mucho mejores resultados se obtienen por perfusión transcardial.
Purificada, reservas de vectores concentrados son lentamente injected bajo guía estereotáxica en el V-SVZ en su límite con el cuerpo estriado (Figuras 2a, b). Dos meses después de la inyección, se encontró que numerosas células GFP + en el V-SVZ y en un radio aproximado 1 mm desde el lugar de la inyección (Figuras 2a, b). La infección con LVs resultados en la transducción de todos los tipos de células en el V-SVZ y la expresión del reportero por células ependimarias indica que LVs también puede orientar de manera eficiente células que no se dividen (figura 2c; véase también 15). Patrón de GFP-etiquetado en el V-SVZ era similar a la encontrada después de 2 semanas 18. No hay señales de reacción de los tejidos, sin embargo, era detectable a los 2 meses después de la inyección ya que el largo período permite la recuperación de los tejidos de la lesión infligida por la cirugía. Durante el período de dos meses, las células infectadas TAP avanzan en A-neuroblastos que migran fuera de la zona hacia el OB. Debido a que este proceso tarda sólo unos pocos días 3, la presencia de GFP+ Neuroblastos en el RMS de 60 días después de la infección indica que también se dirigen a LV B1-NSC neurogénica (Figura 2d). La transducción de B1, C, y A células en el momento de la inyección de los rendimientos de GFP + interneuronas en el OB (Figura 2e).
La inyección de un volumen pequeño de alto título concentra las poblaciones de baja tensión en los resultados del ventrículo lateral en la infección de ependymocytes solamente (Figuras 2f-h). La mayoría de las células ependimarias, que contienen la proteína de unión de calcio S100β, expresan el reportero después de sólo 15 días a partir de la infección (Figura 2i). En contraste con la inyección en la SVZ-V límite / estriatal, no hay células GFP + se observaron subependymally encuentran o en las RMS o OB utilizando este procedimiento (Figuras 2 h, j). Ambos tipos de infecciones pueden ser analizados en las secciones a través de la V-SVZ como se ha explicado. También se pueden analizar en todo el montaje de preparaciones de la ventilación lateralricle pared (véase el protocolo de 8).
Recientemente, hemos descrito la forma de N-cadherina adhesión célula-célula mediada por células de B1 a ependymocytes regula su quiescencia. Hemos utilizado el procedimiento descrito aquí para entregar LVs que llevaban cadherina construcciones dominantes negativos que dieron como resultado la inactivación de N-cadherina. Hemos demostrado que la pérdida de N-cadherina en los NSCs y células ependimarias o en células ependimarias solamente promueve un aumento en el número y el ciclo celular de entrada de NSCs como resultado de la interrupción de las interacciones célula-célula homotípicas (figuras 3a, b; ver 15).
Figura 2: Detección de Reportero por inmunofluorescencia en secciones de ratones inyectados (a) Representación esquemática del nicho de zona sub-ventricular adulto.. Una simplificación de la Componen celularts del nicho se representa. células B1 están polarizados y exhiben una relación especial con el nicho. Ellos abarcan entre el epéndimo, que se alinea el ventrículo y la red de vasos sanguíneos que irrigan el nicho V-SVZ. El pequeño proceso apical de las células se intercala entre B1 ependymocytes multiciliated y termina en un solo cilio primario no móvil, que en los procesos basales se extiende a acercarse al plexo vascular plana que irriga este nicho que termina en la lámina basal de los capilares del plexo. derivados de células B1 son progenitores intermedios que proliferan activamente en los alrededores de los vasos sanguíneos y la migración de las cadenas de neuroblastos hacia los bulbos olfatorios en contacto con astrocitos de nicho. (B) Representación esquemática de una sección coronal a través de un hemisferio que muestra el nivel de la inyección y la posición de la aguja de la jeringa para inyecciones en el / frontera V-SVZ cuerpo estriado. (C) La micrografía tomada en el mismo nivel que se muestra en el esquema stained con DAPI (gris; izquierda) y para la inmunodetección de GFP (verde; derecha) 60 días después de la inyección. Las líneas de puntos indican los límites del cuerpo calloso. (D) Mayor aumento de la detección de inmunofluorescencia del reportero GFP se inyecta en la zona V-SVZ o borde estriado en una sección coronal a través del V-SVZ. Las líneas de puntos indican los límites de la V-SVZ. Tenga en cuenta que muchas células se infectan en el nicho V-SVZ. Las células ependimarias pueden ser reconocidas como células cúbicas que limitan el lumen ventrículo. (E) La inmunofluorescencia para GFP (verde) y el marcador de neuroblast PSZ-NCAM (rojo). Obsérvese la presencia de células doblemente positivas, lo que indica la generación de neuroblastos de NSCs que se infectaron 60 días antes. puntas de flechas blancas señalan los neuroblastos. Inserciones corresponden a la región encerrada dentro de la casilla blanca. (F) Representación esquemática de una sección coronal a través de un hemisferio que muestra el nivel de la inyección y la posición dela aguja de la jeringa para inyección en el ventrículo lateral. (G) Micrografía tomada en el mismo nivel que se muestra en el esquema se tiñeron con DAPI (en gris; izquierda) y para la inmunodetección de GFP (en verde; derecha) 15 días después de la inyección. Las líneas de puntos indican los límites del cuerpo calloso. (H) Mayor aumento de la detección de inmunofluorescencia del reportero GFP se inyecta en el ventrículo en una sección coronal a través del V-SVZ. Las líneas de puntos indican los límites de la V-SVZ. Tenga en cuenta que sólo las células ependimarias están infectadas. (I - j) La inmunofluorescencia para GFP y el marcador de células ependimarias S100β. Obsérvese la presencia de numerosas células doblemente positivas a lo largo de la dorsal (i) y ventral (j) V-SVZ. punta de flecha en un astrocito en el parénquima estriatal, también etiquetados con S100β. k. Corte coronal a través del OB teñidas con DAPI (gris; izquierda) y la inmunodetección de GFP (GREen; la derecha) en la región encerrada por el cuadrado blanco de 60 días después de una inyección V-SVZ / cuerpo estriado. Observe numerosas neuronas marcadas. (L) Corte coronal a través del OB teñidas con DAPI (gris; izquierda) y la inmunodetección de GFP (en verde; derecha) región encerrada por el cuadrado blanco de 45 días después de una inyección ventrículo lateral. Observe que no hay neuronas marcadas OB. cx, corteza cerebral; lv, ventrículo lateral; str, cuerpo estriado; GL, la capa glomerular; GCL, capa de células granulares; MCL, capa de células mitral. Las barras de escala: C, G = 500 micras; d, e, hj = 10 m; kl = 250 micras; 100 micras.
Figura 3:. NSCs adultas proliferan más activamente cuando se desprenden de su nicho (a) Micrografías confocales de secciones a través de la V-SVZ de ratones que recibieron inyecciones estriatales de LVs vacíos (panel superior) o LV carrying un constructo dominante negativo cadherina (panel inferior), inmunotinción para la detección de la GFP reportero LV (verde), el GFAP marcador NSC (rojo), el marcador del ciclo celular Ki67 (cian) y DAPI (azul) 60 días después de las infecciones. se muestran los paneles independientes para cada marcador (gris; derecha). (B) Micrografías confocales de secciones a través de la V-SVZ de ratones que recibieron inyecciones de LVs vacíos (panel superior) o LVs que llevan una construcción de cadherina dominante negativo (panel inferior) en el ventrículo lateral inmunotinción para la detección de la GFP reportero LV (verde), el marcador GFAP NSC (rojo), el marcador del ciclo celular Ki67 (cian), y DAPI (azul), 15 días después de las infecciones. se muestran los paneles independientes para cada marcador (gris; derecha). Las flechas blancas indican en las células doble positivas GFAP / GFP y puntas de flechas blancas señalan en / Ki67 / GFP células positivas triples GFAP cuyos núcleos en ambos casos se indican con un asterisco amarillo. El análisis cuantitativo indica más NSC bicicleta cuando el N-cadHERIN niveles se redujeron en los mismos o sólo en las células ependimarias 15 NSC. Escala: 10 micras.
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Discussion
VL ofrecen importantes ventajas frente a otros sistemas virales para la modificación genética de las células madre neurales adultas 16,18. la administración estereotáxica de lentivirus con el nicho V-SVZ representa un método eficiente para etiquetar y rastrear con poca frecuencia dividiendo B1-NSCs superar las limitaciones de otros métodos usados comúnmente, tales como BrdU, que se diluye después de múltiples divisiones celulares, o retrovirus, que sólo las células diana que están proliferando en el momento de la aplicación. LV, junto con los adenovirus, puede infectar las células con independencia de su estado de ciclismo y esto es especialmente relevante para las células que no lo hacen ciclo, tales como las células ependimarias, o son relativamente quiescente, y por lo tanto rara vez se dividen, como adultos NSC 16,18. Los transgenes se vuelven integrado de forma estable y se expresan con alta eficiencia que permite la caracterización morfológica de las células transducidas y su progenie.
NSC se albergaron en un nicho altamente especializado con las células vecinastales como las células ependimarias o vasculares, así como su propia progenie celular creando así un ambiente estrechamente regulado 2. Al igual que muchas células madre neurales fetales, células B1 se encuentran junto al ventrículo y el ventrículo en contacto con su fluido a través de procesos apicales pequeños, que terminan en un solo cilio primario no móvil sumergido en el líquido cefalorraquídeo ventricular 1 (Figura 2a). Esta organización detallada puede ser explotado para dirigirse específicamente a células ependimarias o todas las células en el nicho a través del control de la zona título y la entrega viral. Adherentes y uniones estrechas en los epitelios polarizados se han demostrado para obstaculizar la entrada de virus extraños en células y tejidos, a veces debido a la ubicación restringido de receptores de la entrada del virus (es decir, receptores CAR) en los complejos de unión. Rotura de la adhesión intercelular, por lo tanto favorece la infección por diferentes tipos de virus, incluyendo el lentivirus (LV). Curiosamente, LVs han demostrado que alteran complejos de unión cuando se usaen altas concentraciones en el epitelio pulmonar 20-23. Esto podría explicar los informes anteriores de las infecciones de B1-NSCs por LVs inyectados en el ventrículo lateral 24.
Desde B1-NSC producir una progenie que migran en sentido anterior y dorsal, células GFP-positivas se pueden encontrar en todos los niveles de la RMS, así como en el OB y del cuerpo calloso en los que se diferencian terminalmente en neuronas y oligodendrocitos, respectivamente. Sin embargo, no utilizamos la expresión del indicador para determinar los efectos de la modificación genética sobre las tasas de neurogénesis o oligodendrogenesis. Por un lado, el cuerpo calloso está en la trayectoria de la pista de la aguja y, por lo tanto, algunas células que aparecen marcado puede ser el resultado de una infección directa durante el proceso de inyección. Por otra parte, debido a todos los tipos de células en el V-SVZ pueden ser infectados que no es posible distinguir si las neuronas OB etiquetados son el resultado de una modificación genética en las células B1 o su progderivados enitor. En el caso de los experimentos en los que está infectado sólo el epéndimo, células B1 y su progenie no están etiquetados con el reportero y por lo tanto la neurogénesis o oligodendrogenesis no pueden ser rastreados. Sin embargo, se puede tomar ventaja de la retención de BrdU para analizar B1-NSC neurogénesis dependiente a la OB o oligodendrogenesis al cuerpo calloso, así como la actividad proliferativa de lentamente se dividen NSCs en la V-SVZ de los ratones infectados. Por ejemplo, los ratones se puede inyectar con BrdU siguiendo los protocolos publicados anteriormente 17 10 días después de la infección con los LVs y permitido sobrevivir durante 21 días. Detección de BrdU en el cuerpo calloso OB / corpus puede utilizarse entonces para determinar la tasa de neurogénesis / oligodendrogenesis, mientras que la retención de BrdU en el V-SVZ puede ser tomado como una estimación del número de células activadas B1 13.
El procedimiento descrito aquí se puede utilizar para la expresión de genes de interés para los ex ganancia de funciónexperimentos pero también puede ser utilizado para la entrega de constructos de silenciación basado en la interferencia de ARN o para la entrega de recombinasa cre construye para inactivar la línea germinal alelos floxed de transmisión en las células V-SVZ. Además, esta técnica también se podría emplear para la edición genoma CRISPR mediada si la inyección de ARN de guía de lentivirus de un solo se utiliza en combinación con un Cre-dependiente Rosa26 Cas9 ratón knockin 25.
Paso crítico 1:. Producción y manipulación lentivirus in vivo aplicaciones de transferencia de genes con LVs en áreas específicas del cerebro requieren preparaciones de vector de título alto, ya que sólo volúmenes muy pequeños pueden ser inyectadas estereotáxicamente sin dañar el tejido cerebral. preparaciones lentivirales necesitan ser purificados y eficiente concentrado antes de la inyección en el cerebro debido al hecho de que LVs se generan en los sistemas de co-transfección transitoria. El procedimiento descrito en este documento es de bioseguridad de nivel 2, por lo tanto, todos los procedimientos querequiere la manipulación de virus se llevan a cabo en las instalaciones de BSL2. necesitan ser calificado y entrenado apropiadamente en todos los procedimientos de personal investigador. Además, la cirugía debe ser realizada por los investigadores completamente entrenados siguientes rutinas aprobados por las autoridades locales para el bienestar de los animales, y debe realizarse en condiciones asépticas con instrumentos esterilizados adecuadamente en el nivel de bioseguridad 2 zonas. atención adecuada pre-operatorio y post-operatorio de los animales debe ser llevada a cabo y debe estar en conformidad con las prácticas médicas y de enfermería veterinarios establecidos. Más específicamente, todas las precauciones deben ser tomadas para minimizar el dolor y el estrés causado al animal incluyendo la administración de la anestesia y la analgesia. Cada paso en relación con el uso de virus en los animales debe ser autorizado por las autoridades institucionales y realizado de acuerdo con las regulaciones locales. Equipo de protección personal también debe ser usado, incluyendo una bata, guantes dobles y protección adecuada para los ojos. Aletaaliado, todas las herramientas y las superficies que podrían haber estado en contacto con los virus deben descontaminarse a fondo de acuerdo con las prácticas de desinfección aprobados facility's (frotando con etanol al 70%, el 10% de lejía y / o tratamiento en autoclave).
En nuestra experiencia, el método de transfección con fosfato de calcio es una técnica muy eficiente y barata de introducir ADN en células 293T. reactivos de transfección de ADN Sin embargo comerciales también pueden ser utilizados según el protocolo del fabricante en este paso. Este protocolo se ha optimizado para la recogida del sobrenadante viral a 30 horas después de la sustitución de medios de las células 293T. lentiviral sobrenadante también se pueden recoger 24 y 48 horas después de la sustitución de los medios. Sin embargo, en nuestra experiencia de una sola colección a 30 horas produce un vector de lentivirus alto título.
Paso crítico 2: ejemplo práctico de los cálculos del vector título utilizando la fórmula:% GFP + / 100 x número de células infectadas dilución x factor (DF) = unidades de transducción (UT) / ml. En este ejemplo, 5 x 10 4 células (293T) se siembran el día anterior que permite la transducción de 10 5 células. Después de obtener el% de células transducidas usando citometría de flujo como se describe en el protocolo, dos valores de las células transducidas se eligen para los cálculos, los de que se corresponden con las diluciones en el que no es ni la transducción saturada ni demasiado bajo. Por ejemplo: Factor de dilución 10 -6 dió 8,08% de células infectadas, y el factor de dilución 10 -5 rendimiento de un 61.78% de células infectadas. El título es el promedio de los valores prestados de la aplicación de la fórmula utilizando los valores de las células transducidas y su correspondiente factor de dilución. En este ejemplo:
Titer para el factor de dilución 10 -6 = (8,08 / 100) x 100 000 x 10 6 = 8,08 · 10 9 TU / ml
Titer para el factor de dilución 10 -5 = (61,78 / 100) x 100 000 x 10 5= 6,178 · 10 9 TU / ml
Media = [(8,08 + 6,178) / 2] · 10 9 = 7,1 · 10 9 TU / ml
paso crítico 3: inyección estereotáxica. El método descrito aquí se basa en el uso de bajos volúmenes de altos títulos de LVs entrega estereotáxicamente guiada en lugares específicos. Las coordenadas estereotáxica dadas en este protocolo se han establecido para los ratones C57 / BL6 y pueden no ser apropiados para otras cepas de ratón. estereotáxica coordenadas deben ser determinados para cada cepa y edad utilizando un tinte verde rápido como antes del experimento. Para ello, el medio de contraste se inyecta y después se sacrificó el ratón, el cerebro se extrae y se congeló durante 1 HRAT -20 ° C. Una vez que se ha endurecido el cerebro, que puede ser cortado con una cuchilla en el sitio de la inyección y se observó bajo un microscopio de disección para determinar si el lugar de la inyección está optimizado para fines experimentales específicos.
paso críticomomentos después de la supervivencia: 4. tiempos de supervivencia post serán diferentes dependiendo del sitio de la inyección. Un tiempo de supervivencia a largo plazo permite que el tejido cerebral se recupere de la lesión por inyección y, más importante aún, las células observadas en el RMS y OB después de 60 días son los derivados de la relación de reposo B1-NSC. Las inyecciones en el ventrículo lateral no dañan físicamente el V-SVZ. Por lo tanto, un período de 15 días es suficiente para asegurar la expresión de los transgenes por células ependimarias.
paso fundamental 5: tiempos posteriores a la fijación. El exceso de post-fijación del tejido cerebral puede generar enmascaramiento de algunos antígenos, debido a la actividad de reticulación de los reactivos, tales como paraformaldehído. Estos son buenos en la preservación de la estructura celular, pero pueden reducir la antigenicidad de algunas proteínas como la reticulación puede obstruir la unión a los epítopos de anticuerpos. técnicas de recuperación de antígeno pueden ser necesarios, sobre todo si hay un tiempo de incubación largo fijación o si un alto porcentaje de reticulación fixative se utiliza. Alternativamente, períodos más cortos de post-fijación de 1 hr han demostrado ser suficiente en nuestra experiencia para mantener la estructura del tejido, así como garantizar una buena antigenicidad dentro de las células sin el uso de procedimientos de Recuperación de antígeno.
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Disclosures
Todas las manipulaciones se realizan en una sala de nivel de bioseguridad 2. los animales protocolos fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Valencia y eran todos, de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63 / UE.
Acknowledgments
Reconocemos la ayuda de MJ Palop y el apoyo técnico de la SCSIE de la Universidad de Valencia. Agradecemos también a Antonia Follenzi para comentarios y discusión del manuscrito votos. Si se soporta por la Fundación Botín, por Banco Santander a través de su División Global Santander Universidades, y por subvenciones de la Generalitat Valenciana (Programa Prometeo, ACOMP, y la CIIU) y el Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED y RETIC Tercel) . Este trabajo fue apoyado también por BFU2010-21823 y RETIC Tercel subvenciones del MINECO y el Consejo Europeo de Investigación (ERC) 2012-STG (260511- PD-HUMMODEL) a AC BM-P. es el beneficiario de una beca FPI español del MINECO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1: Generation of LV for in vivo delivery. | |||
| Equipment: | |||
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XL-100K | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-28 | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-55 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 358126 | 25 mm x 89 mm |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | 13 mm x 51 mm |
| Ultracentrifuge adapters | Beckman Coulter | 358156 | |
| 6-well plate | SPL | PLC-30006 | |
| 24-well plate | SPL | PLC-30024 | |
| 10 cm dish | SPL | PLC-20101 | 100 x 20 style |
| FACS tubes | Afora | DE400800 | 12 mm x 75 mm, 5 ml |
| Cup sterile FACS filter | BD | 340626 | 30 µm |
| Nitrocellulose filter | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm |
| Flow cytometer | BD | LSR Fortessa | Blue laser 488 nm |
| Steritop filter | Biofil | FPE-204-500 | 0.22 µm |
| Reagents: | |||
| pMDLg/pRRE plasmid | Addgene | #12251 | Core packaging plasmid |
| pRSV.REV plasmid | Addgene | #12253 | Core packaging plasmid |
| pMD2G plasmid | Addgene | #12259 | Envelope plasmid |
| pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid | Addgene | #12252 | Transfer vector plasmid |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowest | L0101-500 | For HeLa cell culture |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Life technologies | 12440-053 | For 293T cell culture |
| Tris-EDTA (TE) | Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6, DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered | ||
| 2x HBS | 0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530). | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | Stock solution at 100x, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10x. |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100 | Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM. |
| Sodium pyruvate | Life technologies | 11360-039 | Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM. |
| GlutaMAX Supplement | Life technologies | 35050-061 | Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | Without calcium chloride and magnesium chloride, 10x, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1x PBS in cell culture grade water. |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | H9268 | Powder. Prepare a 1,000x stock solution at 8 mg/ml in dH |
| Paraformaldehyde EM grade 16% | EM Sciences | 15710 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle. | |||
| Equipment: | |||
| Vernier stereotaxic instrument | NeuroLab, Leica | 39463001 | http://www.leicabiosystems.com/ |
| Cunningham mouse and neonatal rat adaptor | NeuroLab, Leica | 39462950 | |
| Syringe holder | KD Scientific | KDS-311-CE | |
| 33 gauge syringe | Hamilton | P/N 84851/00 | #85RN |
| Electric drill | Fine Science Tool | 98096 | |
| Thermal blanket | Ufesa | AL5512/01 | 230-240 V, 100-110 W, type C_AL01 |
| Shaver | Jata | MP373N | Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03. |
| Reagents: | |||
| Medetomidine | Esteve | DOMTOR | Comercial solution at 1 mg/ml. |
| Ketamine | Merial | Imalgene 500 | Comercial solution at 50 mg/ml |
| Medetomidina/ketamine mixture | Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight | ||
| Butorphanol | Pfizer | Torbugesic | Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution. |
| Atipamezole | Esteve | Antisedan | Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia. |
| 0.9% saline solution | Braun | 13465412 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | Topical skin adhesive |
| HydroGel | Clear H2O | 70-01-5022 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | 11 cm x 21 cm |
| Bleach/Virkon | Dupont | ||
| Surgical marker pen | Staedler | 313-9 | Permanent lumocolor |
| Ophthalmic lubricant | SICCAFLUID | 0.5 g/dosis, carbomer 974P | |
| Povidone-iodine | Betadine | 694109.6 | 10% povidone-iodine |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 3: Histological analysis. | |||
| Equipment: | |||
| Automatic peristaltic pump | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07524-55 | Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V |
| Pump head | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07518-00 | Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor |
| Silicone tube | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-96410-16 | Platinum L/S 16 |
| Scalp vein set | Vygon V-green | 70246.05T | 25 G, 30 cm tube length |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Confocal microscope | Olympus | FluoView FV10i | |
| Hot plate | Tehtnica | SHP-10 | |
| Reagents: | |||
| Phosphate buffer (PB) | 0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4 | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Panreac | 141451.1211 | Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB. |
| Saline solution | 0.9% NaCl in dH2O | ||
| Superglue | LOCTITE | 767547 | |
| Sodium azide | Panreac | 122712.1608 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100 | |
| Normal goat serum | Millipore | S30-100 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Detergent |
| Anti-GFP rabbit antibody | ROCKLAND | 600-401-215 | Use at a 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular probes | A-21206 | Use at a 1:750 dilution |
| 6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C. |
| Fluoromount-G | EM Sciences | 17984-25 | Mounting medium for fluorescent preparations |
References
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