Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

Abstract

Relatief rustige somatische stamcellen ondersteunen levenslange celvernieuwing in de meeste volwassen weefsels. Neurale stamcellen in de hersenen volwassen zoogdieren zijn beperkt tot twee specifieke neurogene niches: de subgranulaire zone van de dentate gyrus in de hippocampus en de ventriculaire-subventriculaire zone (V-SVZ, ook wel subependymal zone of SEZ) in de wanden van de laterale ventrikels. De ontwikkeling van in vivo genoverdracht-strategieën voor volwassen stamcellen populaties (dwz die van de hersenen van zoogdieren) resulterend in lange termijn expressie van transgenen in de gewenste stamcellen en hun nakomelingen afkomstig is een cruciale rol spelen bij huidig ​​biomedisch en biotechnologisch onderzoek. Hier wordt een directe in vivo methode gepresenteerd voor de stabiele genetische modificatie van volwassen muizen V-SVZ cellen die gebruik maakt van de celcyclus-onafhankelijke infectie door LVs en de zeer gespecialiseerde cytoarchitecture van de V-SVZ niche. In het bijzonder, het huidige protocol te betrekkens de injectie van lege LVs (controle) of LVs codeert specifieke transgene expressiecassettes in hetzij de V-SVZ zelf, voor de in vivo targeting van alle cellen in de nis of in de laterale ventrikel lumen, voor het richten van ependymale alleen cellen. Expressiecassettes worden vervolgens geïntegreerd in het genoom van de getransduceerde cellen en fluorescerende eiwitten, eveneens gecodeerd door de LVs, zodat de detectie van de getransduceerde cellen voor de analyse van cel autonome als niet-autonome, niche-afhankelijke effecten van de gelabelde cellen en hun nakomelingen.

Introduction

De muizen ventriculaire-subventriculaire zone (V-SVZ), in de wanden van de laterale ventrikel tegenover het striatum, is een zeer actief germinale gebied waarin een continu proces van voorlopercellen celdeling en differentiatie leidt tot de aanhoudende productie van bulbus olfactorius (OB ) interneuronen en corpus callosum oligodendrocyten ^1. De levenslange genereren van deze cellen blijkt te worden door de aanwezigheid in deze regio van neurale stamcellen (NSC's; ook wel B1 cellen), waarbij de astrocytaire antigeen glia fibrillair zuur eiwit (GFAP) tot expressie en stamcel markers zoals nestine, Id1 en Sox2 ^2. GFAP expressie B1 cellen genereren transit versterken voorlopercellen (TAP) cellen (C-cellen), die tot expressie transcriptiefactoren Dlx2 (distale-less homeobox 2) en Ascl1 (zoogdieren Achaete-Schute homoloog 1) en verdeel snel een paar keer voordat ze aanleiding geven te migreren neuroblasts (A-cellen) of oligodendroblasts ^3. Nieuw-gegenereerde ProlifERATIVE neuroblasts migreren naar voren, de vorming van de rostrale migratiestroom (RMS) aan de OB, waar ze te integreren in de granulaire en glomerulaire lagen zo gedifferentieerd remmende interneuronen. Migreren jonge oligodendroblasts verplaatsen naar de CC, waar ze worden onvolwassen NG2-positieve cellen die nog steeds lokaal splitsen of te differentiëren tot rijpe myeliniserende oligodendrocyten ^1,4.

B1 cellen, die afkomstig zijn van foetale radiale gliale cellen behouden langwerpig en gepolariseerde morfologie van hun voorgangers en vertonen een zeer gespecialiseerde relatie met hun niche. Omspant tussen de ependyma welke lijnen de ventrikel en het netwerk van bloedvaten die de V-SVZ niche irrigeren. De kleine apicale proces van B1 cellen intercalaten onder multiciliated ependymocytes en eindigt in een enkele niet-beweeglijke primaire cilium, terwijl hun basale proces strekt zich lange afstanden naar de vlakke vasculaire plexus dat deze niche einde bevloeit in de b benaderenasal lamina van de plexus haarvaten ^2,5-8.

De meest betrouwbare manier om B1-NSCs onderscheiden van niet-neurogene astrocyten, die ook GFAP ^+, in het intacte V-SVZ niche in gehele-mount preparaten van de ventrikel zijwand en de analyse van 3-D confocale microscopie na immunokleuring voor GFAP de dunne B1-NSC apicale proces, β-catenine label celmembranen af te bakenen, en ofwel γ-tubuline als een marker van cilial basale organen of geacetyleerde α-tubuline om het etiket van de omvang van elk cilium ^5,8. Opmerkingen van deze hele mounts van de ventriculaire oppervlak hebben aangegeven dat B1 en ependymale cellen zijn opgesteld in "vuurraderen" ^5, waarbij de uniciliated apicale processen van één of meer GFAP ⁺ B1 cellen worden omringd door een rozet van multiciliated ependymale cellen.

De karakteristieke morfologie van B1 cellen correleert met experimenteel bewijs indicating die de bloedvaten / endotheelcellen en ventriculaire cerebrospinale vloeistof (CSF), vormen geregeld bronnen van oplosbare signalen die op NSC ^2,6,9-11. Bij de ventriculaire oppervlak, homotypische en heterotypische apico-laterale interacties van ependymale en B1 cellen omvatten krappe kruispunten en adherens kruispunten ^5,12. Bovendien adhesiemoleculen betrokken bij de junctionele complexen tussen B1 en ependymale cellen, zoals N-cadherine en V-CAM, is aangetoond dat niet alleen de zeer georganiseerde positionering van B1 regelen de V-SVZ niche, maar ook hun rust ^{12 , 13.} De ependymale-B1 cel monolaag lijkt te werken als een diffusiebarrière waardoor de afgestelde stroom van water en kleine moleculen uit de CSF, maar beperkt de doorgang van grote intercellulaire eiwitten ^10,11. Experimenteel bewijs geeft aan dat de unieke positie B1 cel apicale cilium een rol kunnen spelen als een sensor van signalering Polypeptiden aanwezig in de CSF ^2,5-7. Ependymale cellen zijn op zich een bron van oplosbare en membraangebonden signalen met een rol in de regulatie van NSC gedrag ^14,15.

Traceerbaar nucleosiden, zoals broom- deoxyuridine (BrdU) of retrovirussen zijn op grote schaal gebruikt om progenitorcellen, waaronder NSCs label in vivo. Deze werkwijzen zijn niet optimaal voor de lange termijn gebeurt tracing omdat BrdU signalen verdund door herhaalde celdelingen en retrovirussen lijken preferentieel richten tijdelijk amplificeren van cellen als gevolg van de eis van celproliferatie voor transductie ^16,17. Om NSC fysiologie in vivo, met inbegrip van interacties met niche componenten te onderzoeken, is het cruciaal om een methode om te labelen en te traceren zelden delende cellen, zoals B1-NSCs zijn grotendeels rustig en hun naburige ependymale cellen nooit verdelen onder fysiologische omstandigheden ³ vast te stellen. Hier laten we zien dat lentivirale vectoren (LVs) zorgen voor high-efficiency-gen marking en langdurige wijziging van volwassen NSCs en niet-delende ependymale cellen, vanwege meest redelijk om hun vermogen te transduceren en te integreren in het genoom van de doelcellen in een celcyclus-onafhankelijke manier. Verder tonen we aan hoe de route van aflevering en virale titer hulp specifiek transduceren ependymale cellen, maar niet B1 cellen waardoor de analyse van niche-afhankelijke, ependymale effecten op NSC toestaan.

Protocol

ETHIEK STATEMENT: Dit protocol volgt het dier zorg richtlijnen van de Universiteit van Valencia in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63 / EU.

1. Generatie van LV voor in vivo Markering Studies (zie figuur 1a)

LET OP: De procedure hier beschreven is bioveiligheidsniveau 2, dus het uitvoeren van de volgende procedures in een biohazard kap. Ervoor te zorgen dat onderzoek personeel voldoende gekwalificeerd en opgeleid in alle procedures. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder toga, dubbele handschoenen en geschikte oogbescherming. Tot slot grondig ontsmet alle gereedschappen en oppervlakken die in contact komen met virussen kunnen zijn volgens de goedgekeurde faciliteit desinfectie praktijken (door af te vegen met 70% ethanol, 10% bleekmiddel en / of behandeling in een autoclaaf).

1. Productie van LV in humane embryonale nier 293T-cellen
   1. Begin dit protocol door het opstellen van zuiver DNA voor transfectie. Voor te bereiden en te zuiveren elk plasmide door dubbel CsCl gradseerde centrifugeren of andere commercieel verkrijgbare kolom methoden waardoor endotoxine-vrij DNA. In dit protocol hebben we gebruik gemaakt van de overdracht vector plasmide pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre. Aanbevolen kern verpakking plasmiden pMDLg / pRRE en pRSV.REV en envelop plasmide pMD2G ^13,18,19.
   2. Vierentwintig uur voor transfectie, plaat 5 x 10 ⁶ 293T cellen in Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM) (zie Tabel Materials) in een 10 cm plastic schaaltje om een ongeveer 1/4 tot 1/3 confluente cultuur te verkrijgen transfectie. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde incubator in een atmosfeer van _5-7% CO2.
   3. Vervang het medium door vers medium 2 uur voor de transfectie.
   4. In steriele 1,5 ml microcentrifugebuis mengeling 10 ug plasmide transfervector (die het cDNA van het transgen of shRNA te leveren) met 2,5 ug van het pRSV.REV en 5 ug van het pMDLg / pRRE verpakking plasmiden en 3,5 & #181, g van de envelop plasmide pMD2G. Uitmaken van het plasmide oplossing tot een eindvolume van 450 gl met TE-buffer 0,1x (zie tabel of Materials) / dH ₂ 0 (2: 1). Voeg vervolgens 50 pl 2,5 M _CaCl2.
   5. Vorm het precipitaat door druppelsgewijze toevoeging van 500 ul van de 2x Hepes gebufferde zoutoplossing (HBS, zie Tabel Materials) oplossing van 500 gl _TE-DNA-CaCl2 mengsel terwijl vortexen op volle snelheid.
   6. Voeg het neerslag aan de 293T cellen onmiddellijk. Zwenk de plaat te mengen. De terugkeer van de cellen naar de incubator en verander het medium 14-16 uur na transfectie.
   7. Verzamel de cel supernatanten 30 uur na het veranderen van de media. Filter bovenstaande vloeistof door een 0,22 pm porie nitrocellulose filter en overgaan tot concentratie.
2. Concentratie van LVs
   1. Concentreer het geconditioneerde medium door ultracentrifugatie bij 50.000 xg (19.000 rpm met SW-28 ultracentrifuge rotor) voor 2uur bij kamertemperatuur (RT) in een 30 ml polypropyleen conische rotor transparante buis.
      Opmerking: Gebruik ultracentrifuge adapters voor conische rotor buizen (zie tabel of Materials).
   2. Gooi de supernatanten door decanteren en resuspendeer de pellets in een klein volume (200 gl of minder als één wordt gecentrifugeerd) fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS, zie tabel of Materials). pipet dan op en neer ongeveer 20 keer.
   3. Verzamel de suspensies en opnieuw geconcentreerd door ultracentrifugatie, ook bij 50.000 x g (23.000 rpm met SW-55 ultracentrifuge rotor) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Gebruik polypropyleen transparant rotor buizen met een nominaal volume van 5 ml (zie tabel of Materials).
   4. Resuspendeer de uiteindelijke pellet in een zeer klein volume (1/500 en 1/1000 van het uitgangsvolume medium) steriel PBS en schud op een roterend wiel gedurende 1 uur bij KT. Opgesplitst in kleine hoeveelheden (5-20 pi) en fReeze ze bij -80 ° C.
   5. Behandel alle lege buizen met 10% bleekmiddel voor weggooien.
3. Lentivirale titratie met flowcytometrie
   1. De dag voor, plaat 5 x 10 ⁴ HeLa-cellen per putje in 6-well weefselkweek platen in 2 ml gemodificeerd Eagle's Medium Dulbecco's (DMEM) (zie tabel of Materials). Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde incubator in een atmosfeer van 5-7% _CO2 gedurende 24 uur.
   2. Op de dag van titratie ontdooien een monster van de virale voorraad bereiden seriële verdunningen van 10 tot 10 ^{-3 -8,} in DMEM.
      1. Hiervoor neem een ​​24-wells plaat en voeg 2 ml DMEM aan het eerste putje en 1,8 ml van de volgende putjes. Voeg dan aan het eerste putje 2 pi van het geconcentreerde virale voorraad (tot een uiteindelijke verdunning van 1: 1000 of 10 ^-3).
      2. Na pipetteren een paar keer om goed te mengen de oplossing, verandering tip en de overdracht van 200 ul van de 10 ^-3 verdunningde tweede put. Herhaal de procedure serieel de volgende putjes tot 10 ^-8 verdunning gemaakt.
   3. Neem HeLa-cellen vergulde de vorige dag uit de incubator. Haal medium uit putten. Voeg 1 ml van elke virale verdunning met 1 ui van 8 mg / ml hexadimethrinebromide de HeLa-cellen bevattende putjes. Zwenk de plaat te mengen.
      Opmerking: hexadimethrinebromide toegevoegd aan de virusadsorptie verhogen om de cellen in kweek.
   4. Zet de cellen in de incubator en laat de infectie verlopen gedurende 72 uur. Daarna verwijdert het medium, was de cellen eenmaal met PBS en voeg 200 ul trypsine-EDTA (zie tabel of Materials) aan elk putje.
   5. Na 5 minuten bij 37 ° C, voeg 2 ml PBS aan elk putje en oogst cellen in flowcytometrie buizen.
   6. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuig de supernatant.
   7. Resuspendeer de pellet met 1 ml van de vaststelling van solutiop (1% formaldehyde elektronenmicroscopie ruw en 2% foetaal runderserum in PBS), vervolgens vortex de buizen.
   8. Analyseer de cellen in een stroomcytometer onder toepassing van een 488 nm argon-ionlaser bij 15 mW vermogen.
   9. Stel het instrument met de standaard configuratie: forward-scatter (FS), side-verstrooiing (SS), en fluorescentie voor GFP (525/40 nm). Selecteer cel populatie gating in een FS vs. SS puntdiagram naar cel aggregaten en puin uit te sluiten. Verzamel fluorescentie in logaritmische schaal. Bereken het aantal GFP ⁺ cellen in elk monster.
   10. Bepalen vector titer met de volgende formule:% GFP ⁺ / 100 x aantal cellen geïnfecteerd x verdunningsfactor (DF) = transducerende eenheden (TU) / ml.

Figuur 1: Schematische voorstelling van de verschillende onderdelen van de procedure (a) deel 1 t.Hij protocol: generatie LVs voor in vivo labeling studies, de transfectie van HEK293T cellen met plasmiden geschikt om de LVs de bepaling van de virustiter te genereren door flowcytometrie met de aangegeven formule. De namen van de plasmiden en de centrifugerotoren aangegeven. (B en c) Deel 2 van het protocol: stereotaxische injectie van LVs. "B" toont een voorbeeld van een Vernier schaal een inrichting die onderdeel is van stereotaxische instrumenten en dient voor fijne metingen. Als voorbeeld, de pijlen 4,23 cm. Een Vernier schaal wordt gebruikt om de coördinaten in de antero-posterieure (AP), medio-laterale (ML) en dorso-ventrale (DV) as als getoond een bovenaanzicht (links) en een sagittale doorsnede recht bepalen ( ) van de hersenen. "C" geeft de positie van bregma als de snijlijn tussen de sagittale en coronale hechtingen. LVs worden geïnjecteerd met een spuit. (D) schematische tekeningen tonen hoe de hersenen is bewerkt voor analyse. De twee hersenhelften worden gesplitst en elk verdeeld in twee blokken. Block "a", die de OB, wordt geproduceerd door een coronale snede op de AP-niveau direct posterior aan de OB kruising met de telencephalon (bregma 2,46 mm, zie Paxinos' Atlas voor een referentie). Block "b" wordt geproduceerd door twee coronale snedes ter hoogte anterieure de rostrale aspect van het corpus callosum (bregma 1,7 mm) en een tweede ter hoogte van het kruispunt van de twee laterale ventrikels (bregma -0,22 mm). GL, glomerulaire laag; GCL, korrel cellaag; st, striatum; cc, corpus callosum; ac, commissura anterior; lv, laterale ventrikel.

2. Stereotaxische Injectie van LV in de V-SVZ / striatum Border of in de laterale ventrikel (zie figuur 1b)

1. Voorbereiding
   1. Steriliseren een 5 ul capaciteit spuit met een 33 gauge naald door het sproeien beneden het lichaam en naald met 70% ethanol met de plunjertrok alles uit de weg. Herhaaldelijk aspireren ethanol uit een 1,5 ml microcentrifugebuis en werpen het helemaal uit meerdere malen, en spoel de spuit grondig met steriel water achteraf. Plaats de spuit veilig opzij in de cultuur motorkap en laat ze drogen.
   2. Bereid een biologisch gevaarlijk afval container met 10% bleekwater naar een geschikt volume voor immersie van alle afval van deze procedure (in het algemeen 200 ml in een container 500 ml).
   3. Bereiden en verwarm een ​​37 ° C waterbed vult een afsluitbare plastic zak met water en warmen tot 37 ° C. Dit zal toelaten muizen om te herstellen na de injectie.
   4. Verwijder virale voorraden van -80 ° C vriezer bewaren 1 uur voor aanvang van de injecties en plaats de flacon op een draaiend wiel bij RT. Na ontdooien behouden de virale voorraden op ijs in de tijd van de injecties. Vóór de stereotaxische injectie van LV verdunnen geconcentreerde virale voorraden 10 ⁶ TU / ul PBS gebruik in de cultuur kap.
   5. Ontsmetten de voor het uitvoeren van de operatie met 70% ethanol gebied.
2. Micro-injectie van LV
   1. Selecteer en steriliseren van instrumenten die nodig zijn voor de operatie (scalpel, boren, en kleine pincet).
   2. Verdoven een 6-8 weken oude muis door intraperitoneaal (ip) het injecteren van een veterinair begeleid mengsel van ketamine en medetomidine. Weeg elk dier en dosering elk met 50-75 mg ketamine en 0,5-1 mg medetomidine per kg lichaamsgewicht van de muis (ongeveer 100-125 pl van ketamine / medetomidine werkoplossing per muis).
   3. Beoordeel de verdoving vliegtuig door knijpen de tenen, staart of oor en ervoor te zorgen dat het dier vertoont geen reactie.
   4. Zodra de muis verdoofd, butorfanol injecteren subcutaan toegediend in een uiteindelijke dosis van 0,4-0,5 mg per kg muis gewicht postoperatieve pijn te minimaliseren.
   5. Scheer het gebied tussen de oren en desinfecteren van de huid met een jodofoor zoals iodopovidone of 70% ethanol. Reinigen met behulp van steriele katoen-tipped applicators. Wees voorzichtig niet om het dier te natte als dit onderkoeling kan verergeren.
   6. Plaats het dier in buikligging op een stereotaxische frame en zorgvuldig vast het hoofd met behulp van het oor bars en het gehemelte ondersteuning van het apparaat. Houd de muis met een verwarmingselement ingesteld op 37 ° C en oogheelkundige smeermiddel op de ogen.
   7. Maak een 1 cm lange incisie op de hoofdhuid in de lengte met behulp van een scalpel, en zachtjes trekken van de huid aan de schedel bloot te leggen met behulp van fijne pincet.
   8. Reinig voorzichtig het bot oppervlak met een steriel wattenstaafje. Reinig de blootgestelde schedel bot van de resterende weefsel.
   9. Monteer de gesteriliseerde spuit op de stereotactische apparaat met behulp van de spuit houder.
   10. Verplaats de spuitvergrendeling x, y en z-as totdat de punt van de naald wordt op het bregma, de samenhang punt waar het sagittale (langs- en mediale) hechtdraad loodrecht doorsneden door de coronale hechtdraad (Figure 1b). Zorg ervoor dat de "nul" positie van de dorso-ventrale (DV) as is op de schedel oppervlak op bregma.
   11. Verplaats de spuit aan de x en y coördinaten aankomst (zie tabel 1 en figuur 1b).

Regio van de injectie	coördinaten
	Antero-posterior (AP)	Mediolaterale (ML)	Dorso-ventrale (DV)
SEZ / striatum grens	0,6 mm	1,2 mm	-3,0 mm
laterale ventrikel	-0,3 mm	1,0 mm	-2,6 mm

Tabel 1: stereotaxische coördinaten van de inuitsteeksels. Voor de AP en ML as, x en y coördinaten worden gegeven als een afstand (in mm) vanaf bregma. geeft "richting posterior" - "". Voor de coördinaten DV "nul" is het oppervlak van de schedel bij bregma punt en DV coördinaten geven de afstand (in mm) beneden vanaf dit punt.

12. Annoteren x, y en z coördinaten bestemming bij de Vernier schaal om te kunnen terugkeren naar de injectieplaats komen later. Markeer het bot aan de x en y-coördinaten met een chirurgische markeerstift.
13. Beweeg de spuit uit de buurt van het werkgebied.
14. Met een elektrische boor een gat op de schedel niet zorgvuldig naar de hersenen aantasten. Raak de pial oppervlak niet boren, omdat dit de hersenen oppervlak kunnen beschadigen.
15. Plaats de spuit met 1 pl van de 10 ⁶ TU / ul virale oplossing. Gebruik een 33 gauge scherpe schuine naald wiens tip heeft een hoek van 10-12 °. Plaats de naald op een 90 ° angle opzichte van het hersenoppervlak.
16. Beweeg de spuit terug naar de plaats van injectie en verplaats het naar beneden totdat de tip de pial oppervlak raakt.
17. Doordringen in de hersenen met de spuit om de z-coördinaat in de DV as.
18. Rustig uit virale suspensie met een snelheid van 0,2 ul / min, om schade aan het hersenweefsel die worden veroorzaakt door overmatige fluïdumdruk.
19. Wacht tot 5-10 minuten naar het terugstromen van virale suspensie te minimaliseren en vervolgens terug te trekken de spuit heel langzaam. Blot overtollige vloeistof die aan het oppervlak kan verschijnen als gevolg van het terugtrekken van de spuit met een klinisch veeg en plaats deze direct in de bleekbevattende bioveiligheid afvalcontainer.
20. Neem het dier uit de stereotaxische set, leg het op een warme pad, en sluit de wond met behulp van huidlijm. Keer de sedatie met behulp van 0,1-1,0 mg / kg lichaamsgewicht atipamezol.
21. Injecteren Bupenorphrine subcutaan bij een uiteindelijke dosis van 0,1 mg per kg muis gewicht om de 12 uur,beginnend 4 uur na de toediening van de kortdurende Butorphanol pijnstiller.
22. Plaats het dier in een individuele kooi met een warme pad en op de voet totdat de muis herstelt van anesthesie. Plaats een zak van hydrogel in de kooi van het dier hydraat na herstel te stimuleren.
23. Gooi alle bio-afval en het bleekwater biohazard beschikking. Maak de spuit door aspiratie en uitwerpen van ethanol en spoelen met water. Ontsmet het gebied, de stereotactische set en de chirurgische materiaal dat is gebruikt met bleekmiddel en 70% ethanol.
24. Houd geïnjecteerde muizen die in het bioveiligheidsniveau 2 ruimte voor 24-48 uur, waarna ze kunnen worden overgebracht naar een conventionele behuizing faciliteit

3. Histologische analyse

1. Perfusie weefsel verzamelen, en snijden
   1. Diep verdoven de muizen met behulp van een veterinaire toezicht mengsel van medetomidine en ketamine (beoordelen van de verdoving vliegtuig door knijpen de toes, staart of oren), zoals eerder beschreven.
   2. Transcardially perfuseren de muizen met 25 ml zoutoplossing, gevolgd door 75 ml van 4% PFA in PB in hetzelfde tempo ^17.
   3. Pak de hersenen en na oplossen door onderdompeling in ten minste 10 maal zijn volume aan koude 4% PFA in PB gedurende 1-16 h (toename na fixatietijden kan de immunoreactiviteit van bepaalde antigenen verminderen). Was grondig de resterende PFA met PB.
   4. Snijd de hersenen volgende indicaties van figuur 1d en lijm de resulterende blok aan de houder van een vibratome met behulp van cyanoacrylaat.
   5. Verzamel 30 urn dikke seriële coronale secties met behulp van een vibratome. Bewaar de hersenen plakjes in 24-putjes en met PB bij 4 ° C. Om besmetting te voorkomen, kan 0,05% natriumazide aan de PB-oplossing worden toegevoegd.
2. immunohistochemie
   1. Incubeer de vrij zwevende gedeelten in blokkerende buffer (PB met 0,05% natriumazide, 1% glycine, 5% normaal geitenserum en 0,1% Triton X-100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden in een schudplatform.
   2. Haal de blokkerende buffer met een pipet, voeg een geschikte verdunning van anti-GFP konijn primaire antilichaam (zie tabel van Materialen) in het blokkeren van buffer en incubeer weefsel met deze verdunning gedurende 48 uur bij 4 ° C onder voorzichtig schudden.
   3. Wegwassen primaire antilichaamoplossing minste 3 maal met PB, een wasbeurt elke 10 min.
   4. Incubeer de vrij zwevende gedeelten met een verdunning van fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen) in blokkeeroplossing (zie tabel of Materials) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en voorzichtig schudden. Bescherm de secties van direct licht tijdens de incubatie.
   5. Wegwassen secundaire antilichaamoplossing met PB, 3 maal eens 10 min, en tegenkleuring het weefsel door incuberen van de secties met DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool) en 1 mg / ml in water gedurende 5 minuten. Afwassen de DAPI oplossing door spoelen twee keer en snel with water.
   6. Plaats voorzichtig de secties op een microscoopglaasje met een fijne kwast. Giet een paar druppels fixeermiddel voor fluorescerende preparaten (zie tabel of Materials) over het weefsel voorzichtig plaats een dekglaasje geplaatst en controleer of de bevestigingsoplossing juiste verdeling over het gehele oppervlak en er geen luchtbellen. Knijp voorzichtig naar beneden het dekglaasje om het overtollige montage medium af te voeren.
   7. Wanneer de bevestigingsoplossing uitdroogt (2-16 uur), analyseren monster door confocale laser scanning microscopie met de 488 nm laser.

Representative Results

LV-gemedieerde genafgifte kan worden gebruikt voor de lange termijn in vivo transductie van cellen in volwassen muizen V-SVZ, waardoor hun tracking en genetische modificatie tijdens proliferatie, migratie en differentiatie. De infectie en de expressie zijn zeer effectief en geven talrijke cellen die gemakkelijk onderscheiden onder andere niet-geïnfecteerde cellen kunnen worden door de expressie van het opgenomen. We hebben tot dusver gevisualiseerd cellen getransduceerd met GFP fluorescente reporters, dankzij de alom tot expressie fosfoglyceraatkinase promoter, maar andere reporters of eiwit tags kunnen ook worden gebruikt. We routinematig gebruik van antilichamen tegen GFP in plaats van te vertrouwen op de directe detectie van de reporter-emissie, zoals het een sterker fluorescent signaal oplevert. Bovendien kan de hersenen worden vers uitgesneden en ondergedompeld in fixeermiddel maar veel betere resultaten worden verkregen door transcardial perfusie.

Gezuiverde, geconcentreerde vector voorraden langzaam injected onder stereotaxische leiding in de V-SVZ aan zijn grens met het striatum (figuren 2a, b). Twee maanden na de injectie werden verschillende GFP ⁺ cellen in de V-SVZ en in een ongeveer 1 mm radius van de injectieplaats (figuren 2a, b). Infectie met LVs resulteert in de transductie van alle cellen in de V-SVZ en expressie van het van ependymale cellen aangeeft dat LVs ook efficiënt richten niet-delende cellen (figuur 2c; zie ook ^15). GFP-markeringspatroon in de V-SVZ was vergelijkbaar met die na 2 weken ^18. Geen teken van weefselreactie was echter detecteerbaar 2 maanden na injectie omdat de lange periode maakt het herstel van het weefsel van de schade veroorzaakt door de operatie. Gedurende de periode van twee maanden, geïnfecteerde cellen TAP vooruitgang in A-neuroblasts die migreren van de zone in de richting van de OB. Omdat dit proces neemt slechts een paar dagen ^3, de aanwezigheid van GFP⁺ Neuroblasts in de RMS 60 dagen na de infectie geeft aan dat LVs ook gericht neurogene B1-NSC (figuur 2d). De transductie van B1, C, A en cellen op het moment van injectie opbrengsten GFP ⁺ interneuronen in de OB (figuur 2e).

Injectie van een klein volume van hoge titer geconcentreerd LV bestanden in de laterale ventrikel leidt tot infectie van ependymocytes alleen (figuren 2f-h). De meeste ependymale cellen, die het calcium bindend eiwit S100β bevatten drukken de verslaggever na slechts 15 dagen na infectie (figuur 2i). In tegenstelling tot injectie in de V-SVZ / striatale grens werden geen GFP ⁺ cellen waargenomen subependymally wel in het RMS of OB deze procedure (figuur 2h, j). Beide soorten infecties kunnen worden geanalyseerd doorsneden door de V-SVZ zoals uitgelegd. Ze kunnen ook worden geanalyseerd geheel-mount preparaten van de laterale openingricle wand (zie protocol ⁱⁿ 8).

Onlangs hebben we beschreven hoe N-cadherine-gemedieerde cel-cel adhesie van cellen aan B1 ependymocytes regelt hun rust. We hebben de procedure hier beschreven LVs dragen cadherine dominant-negatieve constructen die resulteerde in inactivatie van N-cadherine leveren gebruikt. We hebben aangetoond dat het verlies van N-cadherine in de NSCs en ependymale cellen of in ependymale cellen alleen gestimuleerd een toename van het aantal en de celcyclus van NSC als gevolg van de verstoring van homotypische cel-cel interacties (figuren 3a, b; zie ^15).

Figuur 2: Reporter detectie door immunofluorescentie in delen van geïnjecteerde muizen (a) Schematische weergave van de volwassen sub- ventriculaire zone niche.. Een vereenvoudiging van de cellulaire components van de niche is afgebeeld. B1 cellen zijn gepolariseerd en vertonen een speciale relatie met de niche. Omspant tussen de ependyma welke lijnen de ventrikel en het netwerk van bloedvaten die de V-SVZ niche irrigeren. De kleine apicale Werkwijze B1 cellen intercalaten onder multiciliated ependymocytes en eindigt in een onbeweeglijk primaire cilium, terwijl hun basale proces zich uitstrekt tot de vlakke vasculaire plexus dat niche eindigt in de basale lamina van de plexus capillairen bevloeit benaderen. B1 celderivaten zijn tussenliggende voorlopers die actief prolifereren in de omgeving van bloedvaten en migreren ketens van neuroblasts richting reukkwabben in contact met niche astrocyten. (B) Schematische voorstelling van een coronale doorsnede door een hemisfeer waarin de omvang van de injectie en de positie van de naald voor injecties in de V-SVZ / striatum grens. (C) Microfoto die op hetzelfde niveau in de schema stained met DAPI (grijs, links) en voor de immunodetectie van GFP (groen, rechts) 60 dagen na de injectie. De gestippelde lijnen geven de grenzen van het corpus callosum. (D) Hogere vergroting van een immunofluorescentie detectie van de GFP reporter geïnjecteerd in de V-SVZ omgeving of striatum grens in een coronale doorsnede door de V-SVZ. De stippellijnen geven de grenzen van de V-SVZ. Merk op dat veel cellen geïnfecteerd in de V-SVZ niche. Ependymale cellen kunnen worden herkend als kubische cellen beperking van de ventrikel lumen. (E) Immunofluorescentie voor GFP (groen) en de neuroblast marker PSZ-NCAM (rood). Let op de aanwezigheid van dubbel positieve cellen, met vermelding van de generatie van neuroblasts van NSC, dat 60 dagen eerder zijn besmet. White pijlpunten wijzen op neuroblasts. Insets overeen met het gebied omsloten door de witte vierkant. (F) Schematische voorstelling van een coronale doorsnede door een hemisfeer waarin de omvang van de injectie en de positie vande naald voor injectie in de laterale ventrikel. (G) Microfoto die op hetzelfde niveau in de schematische gekleurd met DAPI (grijs, links) en voor de immunodetectie van GFP (groen, rechts) 15 dagen na de injectie. De gestippelde lijnen geven de grenzen van het corpus callosum. (H) Hogere vergroting van een immunofluorescentie detectie van de GFP reporter geïnjecteerd in de hartkamer in een coronale doorsnede door de V-SVZ. De stippellijnen geven de grenzen van de V-SVZ. Merk op dat alleen ependymale cellen worden besmet. (I - j) Immunofluorescentie voor GFP en de ependymale cel marker S100β. Let op de aanwezigheid van talrijke dubbel positieve cellen langs de dorsale (i) en ventrale (j) V-SVZ. Pijlpunt wijst naar een astrocyten in het striatale parenchym, ook gelabeld met S100β. k. Coronale doorsnede door het OB gekleurd met DAPI (grijs, links) en immunodetectie van GFP (GREnl; rechts) in het gebied omsloten door de witte vierkante 60 dagen na een V-SVZ / striatum injectie. Let op tal van gelabelde neuronen. (L) coronale doorsnede door de OB gekleurd met DAPI (grijs, links) en immunodetectie van GFP (in groen, rechts) gebied omsloten door de witte vierkante 45 dagen na een laterale ventrikel injectie. Merk op dat er geen OB neuronen gelabeld. cx, cerebrale cortex; lv, laterale ventrikel; str, striatum; GL, glomerulaire laag; GCL, korrel cellaag; MCL, mijtervormige cellaag. Schaal bars: C, G = 500 urn; d, e, hj = 10 micrometer; kl = 250 pm; 100 urn.

Figuur 3:. Volwassen NSCs woekeren actiever als ze los van hun niche (a) confocale microfoto van doorsneden door de V-SVZ van muizen die striatum injecties gekregen van lege LVs (bovenste paneel) of LVs Carrying een dominant-negatieve cadherine construct (onderste paneel), immunostained voor de detectie van de LV verslaggever GFP (groen), de NSC marker GFAP (rood), de celcyclus merker Ki67 (cyaan) en DAPI (blauw) 60 dagen na infecties. Onafhankelijke panelen voor elke markering worden weergegeven (grijs, rechts). (B) confocale microfoto van doorsneden van de V-SVZ van muizen die injecties van lege LVs (bovenste paneel) of LVs die een dominant-negatief cadherine construct (onderste paneel) in de laterale ventrikel immuno voor de detectie van de LV reporter GFP ontvangen (groen), de NSC marker GFAP (rood), de celcyclus merker Ki67 (cyaan) en DAPI (blauw), 15 dagen na de infectie. Onafhankelijke panelen voor elke markering worden weergegeven (grijs, rechts). Witte pijlen wijzen op GFAP / GFP dubbele positieve cellen en witte pijlen wijzen op GFAP / Ki67 / GFP triple positieve cellen, waarvan de kernen in beide gevallen worden aangegeven door een gele sterretje. Kwantitatieve analyse gaf meer fietsen NSC toen de N-cadHerin niveaus werden verlaagd in de NSCs zelf of slechts ependymale cellen ^15. Scale: 10 urn.

Discussion

LVs bieden belangrijke voordelen boven andere virale systemen voor de genetische modificatie van volwassen NSC ^16,18. Stereotaxische levering van lentivirussen de V-SVZ niche vertegenwoordigt een efficiënte methode te labelen en te traceren zelden delen B1-NSC overwinnen van de beperkingen van andere gebruikelijke werkwijzen zoals BrdU, die verdund na meerdere celdelingen of retrovirus, die op doelcellen die prolifererende op het moment van toepassing. LVs, alsmede adenovirussen kunnen cellen ongeacht hun positie fietsen infecteren en dit is vooral relevant voor cellen die geen cyclus niet, zoals ependymale cellen, of relatief rustende en dus zelden delen, zoals volwassen NSC ^16,18. De transgenen stabiel geïntegreerd raken en expressie met hoge efficiency waardoor morfologische analyse van getransduceerde cellen en hun nageslacht.

NSCs worden gekoesterd in een zeer gespecialiseerde niche met naburige cellenzoals ependymale of vasculaire cellen en hun nageslacht cel waardoor een strak gereguleerde omgeving ^2. Zoals vele foetale NSC, B1 cellen liggen naast de ventrikel en het ventrikel contact met de vloeistof door kleine apicale processen die eindigen in één onbeweeglijk primaire cilium ondergedompeld in de ventriculaire liquor ¹ (figuur 2a). Deze gedetailleerde organisatie kan worden benut om specifiek te richten ependymale cellen of alle cellen in de nis door de beheersing van de virale titer en leveringsgebied. Adherens en tight junctions in gepolariseerd epithelia is aangetoond dat vreemde virussen in cellen en weefsels belemmeren soms vanwege het beperkte plaats van virale binnenkomst receptoren (bijv CAR receptoren) in de junctionele complexen. Verstoring van intercellulaire adhesie is daarom voor infectie door verschillende virussen, waaronder het lentivirus (LV). Interessant is dat is aangetoond dat LVs junctionele complexen verstoren bij gebruikbij hoge concentraties in longepitheel ^20-23. Dit kan eerdere verslagen infecties van B1-NSC door LVs geïnjecteerd in het laterale ventrikel ²⁴ te verklaren.

Aangezien B1-NSC nageslacht dat ventraal en dorsaal migreren produceren, kan GFP-positieve cellen te vinden op alle niveaus van de RMS en de OB en corpus callosum waar terminaal differentiëren in neuronen en oligodendrocyten, respectievelijk. Dat doen we echter geen gebruik van de reporter uitdrukking om de effecten van de genetische modificatie op de tarieven van de neurogenese of oligodendrogenesis te bepalen. Enerzijds het corpus callosum in de baan van de naald spoor en daarom kunnen sommige cellen die verschijnen gelabeld gevolg van een directe infectie tijdens de injectie proces. Anderzijds, omdat alle typen cellen in de V-SVZ kan worden besmet is het niet mogelijk te onderscheiden of de gelabelde neuronen OB zijn het gevolg van een genetische modificatie in de B1 cellen of hun progEnitor derivaten. Bij experimenten waarin enkel de ependyma besmet worden B1 cellen en hun nageslacht niet voorzien van de reporter en dus neurogenese of oligodendrogenesis onvindbaar. Men kan echter gebruik maken van BrdU retentie analyseren B1-NSC afhankelijke neurogenese de OB of oligodendrogenesis het corpus callosum en de proliferatieve activiteit van langzaam delende NSC in de V-SVZ van de geïnfecteerde muizen. Bijvoorbeeld kunnen de muizen worden geïnjecteerd met BrdU volgende eerder gepubliceerde protocollen ¹⁷ 10 dagen na infectie met de LVs en liet men 21 dagen overleven. BrdU detectie in de OB / corpus callosum kan vervolgens worden gebruikt om de snelheid van neurogenese / oligodendrogenesis bepalen, terwijl BrdU retentie in de V-SVZ kan worden als een schatting van het aantal geactiveerde cellen ^B1-13.

De hier beschreven werkwijze kan worden toegepast voor de expressie van genen van belang voor gain-of-function experiments maar kan ook worden gebruikt voor het verrichten van stilmaakconstructen basis van RNA interferentie of bij het doorvoeren van cre-recombinase constructen tot kiemlijn uitgezonden floxed allelen geïnactiveerd in de V-SVZ cellen. Daarnaast kan deze techniek ook worden gebruikt voor CRISPR gemedieerde genoom bewerking als injectie van lentivirus-single guide RNA wordt gebruikt in combinatie met een Cre-afhankelijke Rosa26 Cas9 knockin muis ^25.

Kritische stap 1:. Lentivirus productie en manipulatie in vivo genoverdracht toepassingen met LVs in specifieke hersengebieden vereisen hoge titer vector preparaten, omdat slechts zeer geringe volumes stereotaxically kunnen worden geïnjecteerd zonder schade aan het hersenweefsel. Lentivirale preparaten moeten gezuiverd en efficiënt geconcentreerd voor injectie in de hersenen als gevolg van het feit dat LVs worden opgewekt in transiënte cotransfectie systemen. De hierin beschreven werkwijze is bioveiligheidsniveau 2, dus alle procedures dievereisen manipulatie van virussen uitgevoerd BSL2 faciliteiten. Onderzoek personeel moet voldoende gekwalificeerd en opgeleid in alle procedures. Bovendien moet een operatie worden uitgevoerd door volledig opgeleide onderzoekers volgende routines door de plaatselijke autoriteiten voor het welzijn van dieren goedgekeurd en moeten onder aseptische omstandigheden met de juiste instrumenten gesteriliseerd worden gedaan in bioveiligheidsniveau 2 gebieden. Adequate pre-operatieve en post-operatieve zorg van de dieren moeten worden uitgevoerd en moeten in overeenstemming zijn met de gevestigde medische en verpleegkundige diergeneeskundige praktijken. Meer in het bijzonder moeten alle voorzorgen worden genomen om de pijn en stress toegebracht aan het dier, waaronder toediening van anesthesie en analgesie minimaliseren. Elke stap met betrekking tot het gebruik van virussen bij dieren moet worden goedgekeurd door de institutionele autoriteiten en uitgevoerd in overeenstemming met de plaatselijke regelgeving. Persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gedragen, met inbegrip van een toga, dubbele handschoenen en geschikte oogbescherming. Vinbondgenoot, moeten alle gereedschappen en oppervlakken die in contact zijn geweest met virussen grondig worden ontsmet volgens de goedgekeurde desinfectie praktijken (door af te vegen met 70% ethanol, 10% bleekmiddel en / of behandeling in een autoclaaf) facility's.

In onze ervaring, de calciumfosfaat transfectie methode is een zeer efficiënte en goedkope techniek voor het introduceren van DNA in 293T cellen. Echter commerciële DNA transfectie reagentia kunnen ook worden gebruikt volgens het protocol van de fabrikant in deze stap. Dit protocol is geoptimaliseerd voor het verzamelen van het virale supernatant bij 30 uren na vervanging van de media 293T cellen. Lentivirale bovenstaande kan ook worden verzameld 24 en 48 uur na de media vervangen. Echter, in onze ervaring een collectie van 30 uur levert een high-titer lentivirus vector.

Kritische stap 2: praktisch voorbeeld van de berekeningen van de vector titer met behulp van de formule:% GFP ⁺ / 100 x aantal cellen geïnfecteerd x verdunning factor (DF) = transducerende units (TU) / ml. In dit voorbeeld worden 5 x 10 ⁴ cellen (293T) gisteren geënt waardoor de transductie van 10 ⁵ cellen. Na raadpleging% getransduceerde cellen met flowcytometrie zoals beschreven in het protocol, worden twee waarden van getransduceerde cellen gekozen voor de berekeningen, die overeenstemmen met de verdunningen waarbij transductie niet verzadigde niet te laag. Bijvoorbeeld: Verdunningfactor 10 ^-6 opbrengst 8,08% cellen die geïnfecteerd zijn, en verdunning factor 10 ^-5 opbrengst van een 61,78% geïnfecteerde cellen. De titer is het gemiddelde van de waarden weergegeven van de toepassing van de formule met de waarden van de getransduceerde cellen en de bijbehorende verdunningsfactor. In dit voorbeeld:

Titer voor de verdunning factor 10 ^-6 = (8,08 / 100) x 100.000 x ¹⁰ 6 = 8,08 · ¹⁰ 9 TU / ml

Titer voor de verdunning factor 10 ^-5 = (61,78 / 100) x 100.000 x 10 ⁵= 6,178 · ¹⁰ 9 TU / ml

Gemiddeld = [(8,08 + 6,178) / 2] · ¹⁰ 9 = 7,1 · ¹⁰ 9 TU / ml

Kritische stap 3: stereotaxische injectie. De hier beschreven methode berust op het gebruik van kleine hoeveelheden hoge titers van LVs stereotaxically geleid plaatsing in specifieke locaties. De stereotaxische coördinaten vermeld in dit protocol zijn vastgesteld voor de C57 / BL6 muizen en is mogelijk niet geschikt voor andere muizenstammen zijn. Stereotaxische coördinaten moeten worden bepaald voor elke stam en leeftijd met behulp van een kleurstof zoals fast groen voorafgaand aan het experiment. Om dit te doen, is de kleurstof ingespoten en na de muis wordt opgeofferd, wordt de hersenen verwijderd en ingevroren voor 1 hrat -20 ° C. Zodra de hersenen is uitgehard kan worden gesneden met een mes op de plaats van de injectie en waargenomen onder een stereomicroscoop om te bepalen of de injectie is geoptimaliseerd voor specifieke experimentele doeleinden.

kritische stap4: post-survival tijden. Post-survival tijden zullen verschillen afhankelijk van de plaats van injectie. Een lange-termijn overleving laat hersenweefsel te herstellen van de laesie injectie en, nog belangrijker, cellen waargenomen in de RMS en OB na 60 dagen zijn derivaten van de relatieve rustende B1-NSC. Injecties in de laterale ventrikel niet fysiek schadelijk voor de V-SVZ. Daarom gedurende 15 dagen voldoende is om expressie van de transgenen verzekeren door ependymale cellen.

Kritische stap 5: post-fixatie tijden. Overmatig post-fixatie van het hersenweefsel kunnen maskeren van bepaalde antigenen genereren, vanwege de verknoping activiteit van de reagentia, zoals paraformaldehyde. Deze zijn goed behoud celstructuur, maar kan de antigeniciteit van sommige eiwitten als verknoping te verminderen kan antilichaambinding aan de epitopen belemmeren. Antigeenterugtrekking technieken vereist, vooral wanneer er een lange incubatietijd fixatie of een hoog percentage verknopen fixative wordt gebruikt. Als alternatief hebben kortere na fixatie van 1 uur voldoende onze ervaring om de structuur van het weefsel te handhaven en voor een goede antigeniciteit in de cellen zonder het gebruik van antigeen ophalen procedures bewezen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	358126	25 mm x 89 mm
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326819	13 mm x 51 mm
Ultracentrifuge adapters	Beckman Coulter	358156
6-well plate	SPL	PLC-30006
24-well plate	SPL	PLC-30024
10 cm dish	SPL	PLC-20101	100 x 20 style
FACS tubes	Afora	DE400800	12 mm x 75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter	BD	340626	30 µm
Nitrocellulose filter	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm
Flow cytometer	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Steritop filter	Biofil	FPE-204-500	0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid	Addgene	#12251	Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid	Addgene	#12253	Core packaging plasmid
pMD2G plasmid	Addgene	#12259	Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid	Addgene	#12252	Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2x HBS			0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock solution at 100x, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10x.
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate	Life technologies	11360-039	Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Without calcium chloride and magnesium chloride, 10x, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1x PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	H9268	Powder. Prepare a 1,000x stock solution at 8 mg/ml in dHO
Paraformaldehyde EM grade 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument	NeuroLab, Leica	39463001	http://www.leicabiosystems.com/
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor	NeuroLab, Leica	39462950
Syringe holder	KD Scientific	KDS-311-CE
33 gauge syringe	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
Electric drill	Fine Science Tool	98096
Thermal blanket	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Comercial solution at 1 mg/ml.
Ketamine	Merial	Imalgene 500	Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture			Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topical skin adhesive
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11 cm x 21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Surgical marker pen	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant		SICCAFLUID	0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine	Betadine	694109.6	10% povidone-iodine
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Scalp vein set	Vygon V-green	70246.05T	25 G, 30 cm tube length
Vibratome	Leica	VT1000
Confocal microscope	Olympus	FluoView FV10i
Hot plate	Tehtnica	SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB)			0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution			0.9% NaCl in dH2O
Superglue	LOCTITE	767547
Sodium azide	Panreac	122712.1608
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normal goat serum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergent
Anti-GFP rabbit antibody	ROCKLAND	600-401-215	Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular probes	A-21206	Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mounting medium for fluorescent preparations