Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

Abstract

Relativamente células estaminais somáticas quiescentes apoiar a renovação celular ao longo da vida, na maioria dos tecidos adultos. As células estaminais neurais no cérebro de mamíferos adultos está restrita a dois nichos neurogénicos específicos: a zona subgranular do giro dentado no hipocampo e na zona ventricular-subventricular (V-SVZ; também denominada zona subependimal ou SEZ) nas paredes das laterais ventrículos. O desenvolvimento de estratégias de transferência in vivo de genes para as populações de células estaminais adultas (isto é, as do cérebro de mamíferos), resultando em expressão a longo termo de transgenes desejados nas células-tronco e a sua descendência resultante é uma ferramenta importante na investigação biomédica e biotecnológica corrente. Aqui, um método direto in vivo é apresentado para a modificação genética estável de células do rato adulto V-SVZ que se aproveita da infecção independente do ciclo celular por LVs ea citoarquitetura altamente especializada do nicho V-SVZ. Especificamente, o protocolo atual envolvems a injecção do LVS vazio (controlo) ou LVs que codificam as cassetes de expressão de transgenes específica para qualquer um do próprio V-SVZ, para o direccionamento in vivo de todos os tipos de células no nicho, ou para o lúmen do ventrículo lateral, para o direccionamento de ependimária células única. As cassetes de expressão são, em seguida, integrado no genoma das células transduzidas e proteínas fluorescentes, também codificados pelo LVS permitir a detecção das células transduzidas para a análise dos efeitos dependentes do nicho de células autónomos e não autónomos, em células marcadas e os seus progênie.

Introduction

A zona ventricular-subventricular murino (V-SVZ), nas paredes do ventrículo lateral de frente para o corpo estriado, é uma região germinal muito activa, na qual um processo contínuo de replicação de células progenitoras e diferenciação resulta na produção persistente de bolbo olfactivo (OB ) interneurônios e oligodendrócitos corpo caloso ^1. A geração ao longo da vida destas células parece ser apoiada pela presença nesta região de células neurais estaminais (NCCC, também chamado células B1), que expressam a proteína ácida fibrilar glial antigénio astrócitos (GFAP) e a haste marcadores celulares, tais como a nestina, Id1 e Sox2 ^2. GFAP-expressando células B1 gerar células (TAP) (células C), que expressam fatores de transcrição Dlx2 trânsito ampliando progenitor (distal-less homeobox 2) e Ascl1 (mamíferos achaete-Schute homólogo 1) e se dividem rapidamente algumas vezes antes de dar lugar a neuroblastos que migram (células a) ou oligodendroblasts ^3. Recém-gerado prolifneuroblasts operatória migrar anteriormente, formando o fluxo migratório rostral (RMS) para o OB, onde eles integrar o granular e camadas glomerular como interneurônios inibitórios diferenciados. A migração de jovens oligodendroblasts passar para o CC, onde eles se tornam células imaturas NG2-positiva que continuam a dividir localmente ou se diferenciar em oligodendrócitos myelinating maduros ^1,4.

células B1, que derivam de células gliais radiais fetais, retêm a morfologia alongada e polarizada de seus antecessores e exibem uma relação altamente especializada, com o seu nicho. Eles abrangem entre a ependyma que alinha o ventrículo e da rede de vasos sanguíneos que irrigam o nicho V-SVZ. O pequeno processo apical das células intercala B1 entre ependimócitos multiciliated e termina em um único cílio primária não-móveis, ao passo que o seu processo basal estende longas distâncias para abordar o plexo vascular planar que irriga este nicho final no blamina asal dos capilares do plexo ^2,5-8.

A maneira mais confiável para distinguir B1-NSCs a partir de astrócitos não-neurogênicas, que também são GFAP ^+, no nicho V-SVZ intacto é baseado em preparações com parede lateral do ventrículo e sua análise por microscopia confocal 3-D de toda a montar depois imunocoloração para GFAP para rotular o processo apical fina B1-NSC, β-catenina para delinear as membranas celulares, e ambos os γ-tubulina como um marcador de corpos basais cilial ou acetilado α-tubulina para rotular a extensão de cada cílio ^5,8. Observações destas montagens inteiras-a partir da superfície do ventrículo indicaram que as células ependimais e B1 estão dispostas em "" cata-ventos ^5, em que os processos apicais uniciliated de um ou vários GFAP ⁺ B1 células são cercadas por uma roseta de células ependimais multiciliated.

A morfologia característica de células B1 correlaciona-se com a evidência experimental indicating que os vasos sanguíneos / células endoteliais e ventriculares líquido cefalorraquidiano (LCR) constituem fontes reguladas de sinais solúveis que agem em NSCs ^2,6,9-11. Na superfície ventricular, homot�ica e interações APICO-lateral heterotípicos envolvendo células ependimárias e B1 incluem junções apertadas e junções aderentes ^5,12. Além disso, as moléculas de adesão implicados nos complexos juncionais entre as células B1 e ependimais, tais como N-caderina e V-CAM, têm sido mostrados para regular não só o posicionamento altamente organizada de B1 no nicho V-SVZ, mas também a sua quiescência ^{12 , 13.} A monocamada de células ependimária-B1 parece actuar como uma barreira de difusão, permitindo o fluxo regulado de água e pequenas moléculas a partir do CSF, mas restringindo a passagem de grandes proteínas intercelular ^10,11. A evidência experimental indica que o cílio apical de células B1 singularmente posicionada poderia desempenhar um papel como um sensor de sinalização polipeptídeos presentes no CSF ^2,5-7. Células ependimais são, por si só, também uma fonte de sinais solúveis e ligadas à membrana, com um papel na regulação do comportamento NSC ^14,15.

Rastreáveis ​​nucleósidos, tais como bromo-desoxiuridina (BrdU), ou retrovírus têm sido amplamente utilizados para marcar células progenitoras, incluindo as NSC, in vivo. No entanto, estes métodos não são ideais para o rastreio destino a longo prazo em virtude dos sinais de BrdU diluído através de divisões celulares utilizadas e retrovírus parecem ter como alvo, preferencialmente, de forma transiente células, devido à sua exigência de proliferação celular para a transdução ^16,17 amplificar. Para examinar NSC fisiologia in vivo, incluindo interações com componentes de nicho, é fundamental estabelecer um método para rotular e rastrear células raramente se dividem, como B1-NSCs são em grande parte de repouso e as suas células ependimárias vizinhos Nunca dividir em condições fisiológicas ^3. Aqui, mostramos que vetores de lentivírus (VEs) permitir a marca de gene de alta eficiênciação e modificação de longo prazo de NSC adultas e células ependimais que não se dividem, devido razoavelmente mais a sua capacidade para transduzir e a integrar-se no genoma das células alvo de um modo independente do ciclo celular. Além disso, mostramos como a rota de entrega e viral título de ajuda para transduzir especificamente células ependimárias, mas não células B1 permitindo assim a análise dos efeitos, ependimárias dependente de nicho no NSC.

Protocol

ÉTICA DECLARAÇÃO: Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da Universidade de Valência, em conformidade com a Directiva Europeia 2010/63 / UE.

1. Geração de LV para In Vivo Marcação Estudos (veja a Figura 1-A)

CUIDADO: O procedimento aqui descrito é o nível de biossegurança 2, portanto, executar todos os procedimentos a seguir em uma capa de risco biológico. Garantir que o pessoal de investigação são devidamente qualificados e treinados em todos os procedimentos. Usar equipamento de protecção pessoal, incluindo vestido, luvas duplas e proteção ocular adequada. Finalmente, completamente descontaminar todas as ferramentas e superfícies que poderiam ter estado em contacto com vírus de acordo com práticas de instalação de desinfecção aprovados (limpando com 70% de etanol, 10% de água sanitária e / ou autoclavagem).

1. Produção de LV em embrionárias humanas células de rim 293T
   1. Comece este protocolo, preparando DNA puro para transfecção. Preparar e purificar cada plasmídeo com um duplo grad CsClcentrifugação tário ou outros métodos de coluna disponíveis comercialmente produzindo DNA livre de endotoxina. Neste protocolo temos usado o vetor plasmídeo de transferência pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre. Recomendados plasmídeos de empacotamento principais são pMDLg / pRRE e pRSV.REV e envelope plasmídeo pMD2G ^13,18,19.
   2. Vinte e quatro horas antes da transfecção, a placa 5 x 10 ⁶ em células 293T de Iscove modificado por Dulbecco Médio (IMDM) (ver Tabela de Materiais) num prato de plástico de 10 cm de modo a obter uma cultura de cerca de 1/4 a 1/3 para confluentes transfecção. Incubar a 37 ° C num incubador humidificado numa atmosfera de 5-7% de CO _2.
   3. Substituir o meio com frescos média 2 horas antes da transfecção.
   4. Em uma mistura estéril tubo de microcentrífuga de 1,5 ml 10 ng do plasmídeo vector de transferência (contendo o ADNc do transgene ou a shRNA a ser entregue) com 2,5 ug do pRSV.REV e 5 ug dos plasmídeos de empacotamento pMDLg / pRRE, e 3.5 & #181; g do plasmídeo envelope pMD2G. Perfaz-se a solução de plasmídeo para um volume final de 450 ul com tampão de 0,1 x TE (ver Tabela de Materiais) / dH ₂ 0 (2: 1). Em seguida adicionar 50 uL de 2,5 _M de CaCl2.
   5. Forma-se o precipitado por adição gota a gota de 500 ul de 2x o salina tamponada com HEPES (HBS, ver Tabela de Materiais) para a solução de DNA-CaCl-TE mistura 500 ul de ₂ aquando da mistura à velocidade máxima.
   6. Adicionar o precipitado às células 293T imediatamente. Agite suavemente a placa para misturar. Devolver as células para a incubadora e alterar a forma 14-16 h após a transfecção.
   7. Recolher os sobrenadantes das células 30 horas após alterar a mídia. Filtrar o sobrenadante através de um filtro de nitrocelulose de 0,22 um poro e proceder à concentração.
2. Concentração do LVS
   1. Concentra-se o meio condicionado por ultracentrifugação a 50000 xg (19000 rpm, com rotor de ultracentrífuga SW-28) para doish à temperatura ambiente (RT) em um tubo de rotor cónico de 30 ml de polipropileno transparente.
      Nota: Utilize adaptadores de ultracentrífuga para tubos de rotores cônicos (ver tabela de Materiais).
   2. Descartar o sobrenadante por decantação e voltar a suspender as pelotas em um pequeno volume (200 mL ou menos, se apenas uma centrifugação é realizada) de tampão de fosfato salino (PBS; ver Tabela de Materiais). Então pipeta cima e para baixo cerca de 20 vezes.
   3. Reunir as suspensões e concentra-se novamente por ultracentrifugação, também a 50000 x g (23000 rpm com SW-55 de rotor de ultracentrífuga) durante 2 horas à temperatura ambiente. Use polipropileno tubos de rotores transparente com um volume nominal de 5 ml (ver Tabela de Materiais).
   4. Ressuspender o sedimento final em um volume muito pequeno (ou 1/500 1/1000 do volume inicial de meio) de PBS estéril e agitar numa roda rotativa durante 1 h à TA. Dividir em pequenas alíquotas (5-20 uL) e freeze-las a -80 ° C.
   5. Tratar todos os tubos vazios com lixívia a 10% antes de descartar.
3. Lentivirus titulação utilizando Citometria de Fluxo
   1. O dias antes, a placa 5 ⁴ x 10 células HeLa por poço em placas de seis cavidades de cultura de tecido em 2 ml de meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) (ver Tabela de Materiais). Incubar a 37 ° C num incubador humidificado numa atmosfera de 5-7% de CO ₂ durante 24 horas.
   2. No dia da titulação, descongelar uma parte alíquota do estoque virai e preparar diluições em série, a partir de 10 ^{-3 a} 10 ^-8, em DMEM.
      1. Para fazer isso, tomar um prato de 24 cavidades e adicionar 2 ml de DMEM para o primeiro poço e 1,8 ml com os seguintes poços. Em seguida, adicionar à primeira cavidade 2 ul do estoque virai concentrada (para uma diluição final de 1: 1000 ou 10 ^-3).
      2. Após pipetagem várias vezes para misturar bem a solução, alteração ponta e transferir 200 ul da diluição de 10 ^-3para o segundo poço. Repetir o processo em série nos seguintes poços até à diluição de ¹⁰ ~ 8 é feita.
   3. Tome células HeLa banhados no dia anterior da incubadora. Cuidadosamente remova o meio de poços. Adicionar 1 ml de cada diluição virai, juntamente com 1 ml de 8 mg / ml de brometo de hexadimetrina aos poços contendo células HeLa. Agite suavemente a placa para misturar.
      Nota: O brometo de Hexadimetrina é adicionado para aumentar a adsorção de vírus para as células em cultura.
   4. Devolver as células para a incubadora e para permitir que a infecção prosseguir durante 72 horas. Depois disso, retirar o meio, lavar as células uma vez com PBS e adicionar 200 ul de tripsina-EDTA (ver Tabela de Materiais) para cada poço.
   5. Após 5 min a 37 ° C, adicionar 2 ml de PBS a cada poço e de colheita de células em tubos de citometria de fluxo.
   6. Centrifuga-se a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante.
   7. Ressuspender o sedimento com 1 ml de fixação solutiem (1% electrões formaldeído microscopia grau e soro fetal de bovino a 2% em PBS), em seguida, os tubos vortex.
   8. Analisar as células num citómetro de fluxo usando uma atmosfera de árgon a 488 nm-ionlaser a 15 mW de potência.
   9. Configurar o instrumento com a configuração padrão: frente-dispersão (FS), side-dispersão (SS) e de fluorescência para GFP (525/40 nm). Select gating população de células em um FS vs. SS ponto de excluir agregados de células e de detritos. Recolha de fluorescência em escala logarítmica. Calcular o número de células GFP ⁺ em cada amostra.
   10. Calcular vector título usando a seguinte fórmula:% de GFP ⁺ / 100 x Número de células infectadas x factor de diluição (FD) = unidades de transdução (TU) / ml.

Figura 1: Representação esquemática das diferentes partes do procedimento (a), a parte 1 do t.ele protocolo: geração do LVS para estudos de marcação in vivo, a partir da transfecção de células HEK293T com plasmídeos apropriados para gerar os LVS da determinação do título de vírus por citometria de fluxo utilizando a fórmula indicada. Os nomes dos plasmídeos e os rotores de centrifugadoras são indicados. (B e c) Parte 2 do protocolo: a injeção estereotáxica de LVs. "B" representa um exemplo de uma escala de Vernier, um dispositivo que faz parte de instrumentos estereotáxica e serve para medições finas. Como um exemplo, as setas indicam 4.23 cm. Uma escala Vernier é usado para determinar as coordenadas na antero-posterior (AP), médio-lateral (ML) e dorso-ventral eixo (DV) como mostrado para um top-view (esquerda) e para um corte sagital (direita ) do cérebro. "C" indica a posição do bregma como a intersecção entre as suturas sagital e coronal. LVs são injectados utilizando uma seringa. (D) desenhos esquemáticos mostrando como o i cérebros processadas para análise. Os dois hemisférios são separados e cada um é dividido em dois blocos. Bloco de "a", que contém os OBS, é produzida por um corte coronal ao nível de AP imediatamente posterior à junção de OB com o telencéfalo (bregma 2,46 milímetros; ver Paxinos' Atlas para referência). Bloco de "b" é produzida por dois cortes coronais, uma ao nível imediatamente anterior à aspecto mais rostral do corpo caloso (bregma 1,7 mm) e um segundo no nível da junção dos dois ventrículos laterais (bregma -0,22 milímetros). GL, camada glomerular; GCL, camada de células granulares; st, estriado; cc, corpo caloso; ac, comissura anterior; lv, ventrículo lateral.

2. Injecção estereotáxica de LV no estriado beira / V-SVZ ou no ventrículo lateral (ver Figura 1b)

1. Preparação
   1. Esterilizar uma seringa de capacidade de 5 mL com uma agulha de calibre 33 através da pulverização para baixo e o corpo da agulha com etanol a 70% com o êmbolotirou todo o caminho. Repetidamente aspirar etanol a partir de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e ejetá-lo todo o caminho várias vezes, e lave a seringa cuidadosamente com água esterilizada depois. Coloque a seringa com segurança de lado na capa de cultura e deixe-a secar.
   2. Prepare um recipiente de resíduos de risco biológico com 10% de água sanitária para um volume adequado para imersão de todos os resíduos deste processo (geralmente 200 ml em um recipiente de 500 ml).
   3. Preparar e pré-aquecer a cama de água C 37 ° enchendo um saco de armazenamento plástico lacrado com água e aquecimento para 37 ° C. Isso permitirá que os ratos a recuperar a seguir à injecção.
   4. Remover os estoques virais de -80 ° C congelador armazenamento 1 h antes de iniciar as injecções e colocar o frasco numa roda rotativa à temperatura ambiente. Após o descongelamento, manter o estoque viral no gelo durante o tempo das injeções. Antes da injecção estereotáxica de LV, diluir as reservas virais concentrados para 10 ⁶ TU / mL utilizando PBS na capa de cultura.
   5. Higienizar a área seleccionada para a realização da cirurgia com 70% de etanol.
2. A microinjecção de LV
   1. Selecione e esterilizar instrumentos necessários para cirurgia (bisturi, broca, e pequenas pinças).
   2. Anestesiar um rato de 6-8 semanas de idade, por via intraperitoneal (ip) injecção de uma mistura veterinário-supervisionado de cetamina e medetomidina. Pesar cada animal e cada dose de 50-75 mg de cetamina, com 0,5-1 mg e medetomidina por kg de peso corporal do rato (cerca de 100-125 ul da cetamina / medetomidina solução de trabalho por ratinho).
   3. Avaliar o plano anestésico por beliscar a ponta dos pés, cauda ou orelha e garantir que o animal não mostra nenhuma reação.
   4. Uma vez que o mouse é anestesiado, injetar butorfanol por via subcutânea na dose final de 0,4-0,5 mg por kg de peso do mouse para minimizar a dor pós-cirúrgica.
   5. Raspar a área entre as orelhas e desinfectar a pele usando um iodoforo tal como iodopovidona ou 70% de etanol. Limpar com algodão estérilaplicadores -tipped. Tenha cuidado para não molhar excessivamente o animal, pois isso pode agravar a hipotermia.
   6. Colocar o animal em decúbito ventral em um quadro estereotáxico e fixar cuidadosamente a cabeça usando as barras de ouvido e o apoio paladar do aparelho. Mantenha o mouse com um conjunto almofada de aquecimento a 37 ° C e aplique o lubrificante oftálmica para os olhos.
   7. Faça uma longa incisão de 1 cm na pele da cabeça longitudinalmente utilizando um bisturi, e suavemente retrair a pele para expor o crânio usando uma pinça fina.
   8. Limpe cuidadosamente a superfície do osso com um aplicador com ponta de algodão estéril. Limpar o osso do crânio exposto de qualquer tecido remanescente.
   9. Montar a seringa esterilizada no dispositivo estereotáxico com o porta-seringa.
   10. Mover o eixo de suporte de seringa x, y e z até que a ponta da agulha da seringa é posicionado sobre a bregma, o ponto de articulação onde a sutura sagital (longitudinal e medial) é intersectada por perpendicularmente da sutura coronária (Figure 1b). Certifique-se de que a posição "zero" do eixo dorso-ventral (DV) é a superfície do crânio em bregma.
   11. Mover a seringa para as coordenadas x e y de destino (ver Quadro 1 e Figura 1b).

Região de injecção	coordenadas
	Antero-posterior (AP)	Medio-lateral (ML)	Dorso-ventral (DV)
SEZ fronteira / striatum	+0,6 mm	+1,2 mm	-3.0 mm
ventrículo lateral	-0.3 mm	+1.0 mm	-2.6 mm

Tabela 1: coordenadas estereotáxica para o noprojecções. para o AP e o eixo ML, coordenadas x e y são dadas como uma distância (em mm) a partir da bregma. "-" Indica "no sentido posterior". Para o DV coordenadas "zero", é a superfície do crânio em bregma e o ponto de coordenadas DV indicar a distância (em mm) para baixo a partir deste ponto.

12. Anotar a x, y e z coordenadas de destino em escala vernier de modo a ser capaz de voltar para o local de injecção mais tarde. Mark osso nas coordenadas X e y usando uma caneta cirúrgica.
13. Mover a seringa para fora da área de trabalho.
14. Utilizando uma broca eléctrica fazer um orifício no crânio com cuidado para não danificar o cérebro. Não perfure a superfície pial, pois isso pode danificar a superfície do cérebro.
15. Carregar a seringa com 1 ul da solução virai ⁶ 10 TU / mL. Use uma agulha chanfrada afiada calibre 33 cuja ponta tem um ângulo de 10-12 °. Posicionar a agulha da seringa em um ang 90 °le em relação à superfície do cérebro.
16. Mova a seringa de volta para o local da injecção e movê-lo para baixo até que a ponta toca a superfície pial.
17. Penetrar no cérebro com a seringa para a coordenada z no eixo DV.
18. libertar lentamente a suspensão virai, a uma velocidade de 0,2 ul / min, a fim de minimizar os danos para o tecido cerebral devido à pressão do fluido em excesso.
19. Esperar por 5-10 min para minimizar o refluxo de suspensão viral e, em seguida, retirar a seringa muito lentamente. Blot qualquer excesso de líquido que podem aparecer na superfície como um resultado da retracção da seringa usando um laboratório limpar e colocá-lo imediatamente no recipiente de resíduos segurança biológica contendo lixívia.
20. Levar o animal para fora do set estereotáxica, coloque-o em uma almofada quente, e fechar a ferida usando adesivo de pele. Reverter a sedação usando 0,1-1,0 mg / kg de peso corporal atipamezol.
21. Injectar Bupenorphrine por via subcutânea numa dose final de 0,1 mg por kg de peso do rato a cada 12 horas,começando 4 horas após a administração do analgésico butorfanol curta duração.
22. Colocar o animal em uma gaiola individualizado com uma almofada quente e acompanhar de perto até que o mouse se recupera da anestesia. Coloque um saco de hidrogel na gaiola para ajudar o hidrato de animais após a recuperação.
23. Eliminar todos os resíduos contaminados com bio na alienação de branqueamento de risco biológico líquido. Limpe a seringa por aspiração e de ejeção de etanol e enxaguar com água. Desinfectar a área, o conjunto estereotáxico eo material cirúrgico que tem sido utilizado com água sanitária e 70% de etanol.
24. Mantenha camundongos injetados isoladas no Nível de Biossegurança 2 sala de durante 24-48 h, após o que pode ser transferido para uma instalação de alojamento convencional

3. Análise histológica

1. Perfusão, coleta de tecido e corte
   1. Profundamente anestesiar os ratos usando uma mistura supervisionado-veterinária do medetomidine e cetamina (avaliar o plano anestésico por beliscar a tOES, cauda ou orelha), tal como descrito antes.
   2. Transcardialmente perfundir os ratos com 25 ml de solução salina seguido por 75 mL de PFA a 4% em STP à mesma velocidade ^17.
   3. Extrai-se a pós-cérebro e corrigi-lo por imersão em pelo menos 10 vezes o seu volume de frio PFA a 4% em STP durante 1-16 horas (maiores tempos de pós-fixação pode diminuir a imunorreactividade de alguns antigénios). Lavar a fundo as PFA restante com PB.
   4. Cortar o cérebro seguindo as indicações da Figura 1d e cola o bloco resultante para o titular de uma vibratome utilizando cianoacrilato.
   5. Colete 30 cortes coronais em série um de espessura usando um vibratome. Armazenar as fatias de cérebro em placas de 24 poços múltiplos com PB a 4 ° C. Para evitar a contaminação, 0,05% de azida de sódio pode ser adicionado à solução de PB.
2. A imuno-histoquímica
   1. Incubar as secções de flutuação livre em tampão de bloqueio (PB com azida de sódio a 0,05%, 1% de glicina, soro de cabra normal a 5%, e 0,1% Tritem relação a X-100) durante 1 h à TA com agitação suave numa plataforma oscilante.
   2. Cuidadosamente remover o tampão de bloqueio com uma pipeta, adicionar uma diluição adequada de anticorpo primário de coelho anti-GFP (ver Tabela de Materiais) em tampão de bloqueio e incubar tecido com esta diluição durante 48 h a 4 ° C com agitação suave.
   3. Lavar a solução de anticorpo primário um mínimo de 3 vezes com PB, uma lavagem a cada 10 min.
   4. Incubar as secções de flutuação livre com uma diluição adequada de anticorpos secundários conjugados com fluoróforo) em solução de bloqueio (ver Tabela de Materiais) durante 1 h à temperatura ambiente e agitação suave. Proteger as seções de luz directa durante a incubação.
   5. Lavar a solução de anticorpo secundário com PB, 3 vezes, uma vez a cada 10 min, e contracoloração do tecido por incubação das secções com DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) a 1 mg / ml em água, durante 5 min. Lavar a solução DAPI por lavagem duas vezes e rapidamente with de água.
   6. Delicadamente, coloque as seções sobre uma lâmina de microscópio usando um pincel fino. Pour algumas gotas de meio de montagem para preparações fluorescentes (ver Tabela de Materiais) sobre o tecido e coloca cuidadosamente uma lamela por cima, a verificação de que a solução de montagem é correctamente distribuído sobre toda a superfície e que não há bolhas. Aperte suavemente para baixo a lamela para drenar o excesso de meio de montagem.
   7. Quando a solução de montagem seca (2-16 hr), analisar a amostra por microscopia confocal de varrimento laser com o laser de 488 nm.

Representative Results

Sistema de entrega de genes mediada por LV pode ser utilizado para a longo prazo na transdução in vivo de células do ratinho adulto V-SVZ, permitindo que o seu controle e modificação genética durante a proliferação, a migração ea diferenciação. A infecção e a expressão são altamente eficazes e produzem numerosas células que podem ser facilmente distinguidos entre outras células não-infectadas por a expressão do repórter incluídos. Temos, assim, muito visualizado células transduzidas com GFP repórteres fluorescentes, dirigido pelo promotor de fosfoglicerato-quinase expressa ubiquamente, mas outros repórteres ou marcas de proteína também pode ser utilizada. Nós usam rotineiramente anticorpos para GFP em vez de confiar na detecção direta da emissão repórter, uma vez que produz um sinal fluorescente forte. Além disso, os cérebros podem ser dissecados frescos e imersos em fixador mas muito melhores resultados são obtidos por perfusão transcardial.

Purificada, ações vetor concentrados lentamente estão injected sob orientação estereotáxico para o V-SVZ no seu limite com o estriado (Figuras 2a, b). Dois meses após a injecção, numerosas células GFP ⁺ foram encontradas no V-SVZ e num raio de aproximadamente 1 milímetros a partir do local de injecção (Figuras 2a, b). Infecção no LVS resulta na transdução de todos os tipos de células do V-SVZ e a expressão do repórter por células ependimais LVs indica que também pode ter como alvo de forma eficiente (Figura 2c; ver também ¹⁵⁾ não estão em divisão de células. Padrão de etiquetagem da GFP no V-SVZ foi semelhante à encontrada após 2 semanas ^18. Nenhum sinal de reacção de tecido, no entanto, era detectável em 2 meses após a injecção, uma vez que o período de tempo permite a recuperação do tecido da lesão infligida pela cirurgia. Durante o período de dois meses, as células infectadas TAP progredir para A-neuroblastos que migram para fora da zona para o OB. Como esse processo leva apenas alguns dias ^3, a presença de GFP⁺ Neuroblastos na RMS de 60 dias após a infecção indica que LVs também alvo neurogênica B1-NSC (Figura 2d). A transdução de B1, C e A as células no momento da injecção rendimentos GFP ⁺ interneurónios no OB (Figura 2E).

A injecção de um pequeno volume de título elevado concentrada existências em LV ventrículo lateral os resultados na infecção de ependimócitos única (Figuras 2F-H). A maioria das células ependimais, que contêm a proteína de ligação S100β cálcio, expressa o repórter após apenas 15 dias de infecção (Figura 2i). Em contraste com a injecção no SVZ V-limite / estriatal, não há células GFP ⁺ foram observadas subependymally localizado ou na RMS ou OB usando este procedimento (Figuras 2 h, j). Ambos os tipos de infecções pode ser analisada em secções através do V-SVZ como explicado. Eles também podem ser analisados ​​em preparações da saída de ventilação laterais inteiro de montagemparede ricle (ver protocolo no ^8).

Recentemente, descreveu como N-caderina adesão célula-célula mediada de células B1 para ependimócitos regula sua quietude. Temos usado o procedimento descrito aqui para entregar LVs que transportam caderina construções dominantes-negativos que resultaram na inativação de N-caderina. Nós demonstramos que a perda de N-caderina nas NSC e células ependimais ou em células ependimais só promoveu um aumento no número e no ciclo celular de entrada de NSC como resultado da ruptura das interacções célula-célula homotípicas (Figuras 3a, b; veja ^15).

Figura 2: Detecção de Repórter por imunof luorescência em secções de ratinhos injectados (a) Representação esquemática do nicho adulto zona sub-ventricular.. A simplificação do componen celularts do nicho é retratado. células B1 são polarizados e exibem uma relação especializada, com o nicho. Eles abrangem entre a ependyma que alinha o ventrículo e da rede de vasos sanguíneos que irrigam o nicho V-SVZ. A pequena processo apical das células B1 intercala entre ependimócitos multiciliated e termina num cílio primária não-móveis, enquanto que o seu processo basal estende-se para se aproximar do plexo vascular planar que irriga neste nicho terminando na lâmina basal dos capilares do plexo. derivados de células B1 são progenitores intermediários que proliferam activamente nos arredores de vasos sanguíneos e migram cadeias de neuroblastos para com os bulbos olfatórios em contato com astrócitos de nicho. (B) Representação esquemática de uma secção coronal através de um hemisfério que mostra o nível de injecção e a posição da agulha da seringa para injecções na fronteira V-SVZ / estriado. (C) micrografia tirada ao mesmo nível mostrado na STA esquemáticainada com DAPI (cinza; à esquerda) e para a imunodetecção da GFP; 60 dias após a injecção (verde à direita). As linhas ponteadas indicam os limites do corpo caloso. (D) Maior ampliação de uma detecção de imunofluorescência de o repórter GFP injectado na vizinhança V-SVZ fronteira ou estriado de uma secção coronal através da V-SVZ. As linhas ponteadas indicam os limites do V-SVZ. Note-se que muitas células são infectadas no nicho V-SVZ. Células ependimárias pode ser reconhecido como células cúbicas limitantes do lúmen ventrículo. (E) Imunofluorescência para GFP (verde) e o marcador de neuroblastos PSZ-MACN (vermelho). Note-se a presença de células duplamente positivas, indicando que a geração de neuroblastos de NSC que foram infectados 60 dias antes. setas brancas apontam para neuroblastos. As inserções correspondem à região delimitada dentro do quadrado branco. (F) Representação esquemática de uma secção coronal através de um hemisfério que mostra o nível de injecção e a posição dea agulha da seringa para injecções no ventrículo lateral. (G) micrografia tirada ao mesmo nível mostrado no esquema coradas com DAPI (em cinzento; esquerda) e para a imunodetecção de GFP (no verde, para a direita) 15 dias após a injecção. As linhas ponteadas indicam os limites do corpo caloso. (H) Maior ampliação de uma detecção de imunofluorescência de o repórter GFP injectado no ventrículo em uma secção coronal através da V-SVZ. As linhas ponteadas indicam os limites do V-SVZ. Note-se que apenas as células ependimais estão infectados. (I - j) Imunofluorescência para GFP e o marcador de células ependimária S100β. Note-se a presença de numerosas células duplamente positivas ao longo da dorsal (i) e ventral (J) V-SVZ. seta aponta a um astrócito no parênquima do estriado, também marcado com S100β. k. Secção coronal através da OB coradas com DAPI (cinza; à esquerda) e imunodetecção de GFP (green; direita) na região delimitada pela quadrado branco de 60 dias após a injeção V-SVZ / striatum. Observe numerosos neurónios marcados. (L) secção coronal através da OB coradas com DAPI (cinza; à esquerda) e imunodetecção de GFP (em verde; à direita) região delimitada pelo quadrado branco de 45 dias após a injeção ventrículo lateral. Observe que não há neurônios OB marcados. cx, córtex cerebral; lv, ventrículo lateral; str, estriado; GL, camada glomerular; GCL, camada de células granulares; MCL, camada de células mitral. Barras de escala: C, G = 500 mm; d, e, HJ = 10 um; KL = 250 um; 100 um.

Figura 3:. NSCs adultas proliferam de forma mais activa quando eles se separam de seu nicho (a) Micrografia confocal de seções através do V-SVZ de ratos que receberam injeções do estriado de LVs vazias (painel superior) ou LVs carrying uma construção dominante-negativo caderina (painel inferior), imunocoradas para a detecção da GFP repórter LV (verde), o marcador de GFAP NSC (vermelho), o marcador do ciclo celular Ki67 (ciano), e DAPI (azul) 60 dias depois as infecções. painéis independentes para cada marcador são mostrados (cinza; à direita). (B) Micrografia confocal de secções através do V-SVZ de ratos que receberam injecções de LVs vazios (painel superior) ou LVs que transportam uma construção de caderina dominante-negativa (painel inferior) no ventrículo lateral imunocoradas para a detecção do repórter GFP LV (verde), o marcador GFAP NSC (vermelho), o marcador do ciclo celular Ki67 (ciano) e DAPI (azul), 15 dias após a infecção. painéis independentes para cada marcador são mostrados (cinza; à direita). setas brancas apontam para / GFP células positivas duplas GFAP e setas brancas apontam at / Ki67 / GFP células positivas triplos GFAP cujos núcleos em ambos os casos são indicados por um asterisco amarelo. A análise quantitativa indicou mais NSCs ciclismo quando o N-cadníveis Herin foram diminuídos nos próprios ou apenas em células ependimárias ¹⁵ NSC. Escala: 10 um.

Discussion

LVs oferecer vantagens importantes sobre outros sistemas virais para a modificação genética de adultos NSCs ^16,18. entrega estereotáxica de lentivírus para o nicho V-SVZ representa um método eficiente para identificar e rastrear raramente dividindo B1-NSC superar as limitações de outros métodos vulgarmente utilizados tais como BrdU, que se dilui depois de múltiplas divisões celulares, ou retrovírus, que apenas células alvo que estão a proliferar no momento da aplicação. LVS juntamente com adenovírus, pode infectar as células, independentemente do seu estado de ciclismo e isto é especialmente relevante para as células que não fazem ciclo, tais como as células ependimais, ou são relativamente quiescente, e assim dividem raramente, como NSC adulto ^16,18. Os transgenes tornar-se integrado de forma estável e expressou com alta eficiência, permitindo a caracterização morfológica de células transduzidas e seus descendentes.

NSCs são abrigados em um nicho altamente especializado com células vizinhastais como ependimais vasculares ou células, bem como a sua própria descendência da célula, criando assim um ambiente fortemente regulamentada ^2. Como muitos NSC fetais, células B1 encontram-se ao lado do ventrículo e do ventrículo contactar o respectivo fluido através de processos apicais pequenas, que acabam em um único cílio primário não-móveis imerso no ventrículo CSF ¹ (Figura 2a). Esta organização detalhada pode ser explorada para visar especificamente células ependimais ou todas as células no nicho através do controlo da titulação e entrega área viral. Aderentes e junções apertadas em epitélios polarizadas foram mostrados para impedir a entrada de vírus estranhos em células e tecidos, por vezes, devido à localização restrita de receptores de entrada viral (por exemplo, receptores CAR) nos complexos juncionais. Perturbação de adesão intercelular, portanto, favorece a infecção por diferentes tipos de vírus, incluindo o lentivírus (LV). Curiosamente, LVs foram mostrados para interromper complexos juncionais quando utilizadaem concentrações elevadas no epitélio pulmonar ^20-23. Isto poderia explicar os relatórios anteriores de infecções de B1-NSC por LVs injectadas no ventrículo lateral ^24.

Desde B1-NSC produzir progénie que migram anteriormente e dorsalmente, as células positivas para GFP podem ser encontrados em todos os níveis de RMS, bem como no corpo caloso OB e onde eles terminalmente diferenciar em neurónios e os oligodendrócitos, respectivamente. No entanto, nós não usamos a expressão repórter para determinar os efeitos da modificação genética nas taxas de neurogênese ou oligodendrogenesis. Por um lado, o corpo caloso está no caminho do percurso da agulha e, por conseguinte, algumas células que apareça marcados podem ser o resultado de uma infecção directa durante o processo de injecção. Por outro lado, porque todos os tipos de células do V-SVZ podem ser infectados, não é possível distinguir se os neurónios rotulados OB são o resultado de uma modificação genética nas células B1 ou seu progderivados enitor. No caso das experiências em que apenas o epêndima é infectadas, células B1 e sua descendência não são marcados com o repórter e, por conseguinte, a neurogénese ou oligodendrogenesis não pode ser rastreada. No entanto, pode-se tirar vantagem de retenção de BrdU para analisar B1-NSC neurogénese dependente para o OB ou oligodendrogenesis ao corpo caloso, bem como a actividade proliferativa das divisórias NSC-se lentamente no V-SVZ de ratinhos infectados. Por exemplo, os ratos podem ser injectados com BrdU seguindo os protocolos anteriormente publicados ^{17 10} dias após a infecção com as SVL e deixada a sobreviver durante 21 dias. Detecção de BrdU no OB caloso / corpus pode então ser usada para determinar a taxa de neurogénese / oligodendrogenesis, enquanto que a retenção de BrdU no V-SVZ pode ser tomado como uma estimativa do número de células ^B1-13 activadas.

O processo descrito aqui pode ser utilizado para a expressão de genes de interesse para o ganho-de-função exexperi- mas também pode ser utilizado para a entrega de construções com base em silenciamento de interferência de ARN ou para a entrega de recombinase cre constrói para inactivar germinativas floxed alelos transmitidos nas células V-SVZ. Além disso, esta técnica pode também ser empregue para edição genoma mediada por CRISPR se a injecção de ARN de orientação Lentivírus único é utilizado em associação com um Rosa26 Cas9 rato batendo-Cre dependente ^25.

Passo crítico. 1: produção e manipulação lentivírus in vivo aplicações de transferência de genes no LVS em áreas específicas do cérebro requerem preparações de vector de título elevado, uma vez que somente volumes muito pequenos pode ser injectado estereotaxicamente o sem danificar o tecido cerebral. preparações lentivirais precisa de ser purificado e concentrado antes de injecção de forma eficiente para o cérebro devido ao fato de que LVs são geradas em sistemas de co-transf ecção transientes. O procedimento aqui descrito é o nível de biossegurança 2, portanto, todos os procedimentos querequerem a manipulação do vírus são efectuados em instalações BSL2. pessoal de investigação devem ser devidamente qualificados e treinados em todos os procedimentos. Além disso, a cirurgia deve ser realizada por investigadores bem treinados seguintes rotinas aprovadas pelas autoridades locais para o bem-estar animal, e deve ser feito sob condições assépticas com instrumentos esterilizados adequadamente no nível de biossegurança 2 áreas. cuidados adequados pré-operatório e pós-operatório dos animais deve ser realizada e deve estar em conformidade com as práticas médicas e de enfermagem veterinários estabelecidos. Mais especificamente, todas as precauções devem ser tomadas para minimizar a dor e estresse infligido ao animal, incluindo a administração de anestesia e analgesia. Cada passo sobre a utilização de vírus em animais deve ser autorizada pelas autoridades institucionais e executada de acordo com os regulamentos locais. equipamento de protecção individual deve também ser usado, incluindo um vestido, luvas duplas e proteção ocular adequada. barbatanaaliado, todas as ferramentas e superfícies que poderiam ter estado em contacto com vírus deve ser completamente descontaminado de acordo com as facility's aprovados práticas de desinfecção (limpando com 70% de etanol, 10% de água sanitária e / ou autoclavagem).

Na nossa experiência, o método de transfecção de fosfato de cálcio é uma técnica muito eficiente e barata de introdução de ADN em células 293T. reagentes de transfecção de ADN comerciais No entanto, também pode ser utilizado, conforme o protocolo do fabricante neste passo. Este protocolo é otimizado para a recolha do sobrenadante viral em 30 horas após a substituição da mídia sobre as células 293T. sobrenadante Lentivirus também podem ser recolhidas 24 e 48 horas após a substituição da mídia. No entanto, em nossa experiência uma única coleção em 30 horas produz um lentivírus vetor de alta titulação.

Passo crítico 2: exemplo prático dos cálculos do título de vector utilizando a fórmula:% de GFP ⁺ / 100 x Número de células infectadas x diluição factor (FD) = unidades de transdução (TU) / ml. Neste exemplo, 5 x 10 ⁴ células (293T) foram semeadas no dia anterior permitindo a transdução de células 10 ^5. Depois de obtida a% de células transduzidas utilizando citometria de fluxo, tal como descrito no protocolo, dois valores de células transduzidas são escolhidos para os cálculos, os quais correspondem às diluições em que a transdução é nem saturado, nem muito baixo. Por exemplo: Factor de diluição ¹⁰ -6 deu 8,08% de células infectadas, e factor de diluição 10 ^-5 produzir um células 61,78% infectado. O título é a média dos valores prestados a partir da aplicação da fórmula utilizando os valores das células transduzidas e o seu correspondente factor de diluição. Neste exemplo:

Titer para o factor de diluição = 10 ^-6 (8,08 / 100) x 100.000 x 10 ⁶ = 8,08 · ⁹ 10 TU / ml

Titer para o factor de diluição 10 ^-5 = (61,78 / 100) x 100.000 x 10 ⁵= 6,178 · ⁹ 10 TU / ml

Média = [(8,08 + 6,178) / 2] · 10 ⁹ = 7.1 x 10 ⁹ TU / ml

passo crítico 3: injecção estereotáxica. O método aqui descrito baseia-se na utilização de baixos volumes de títulos elevados de LVs entrega estereotaxicamente guiado em locais específicos. As coordenadas estereotáxica dadas neste protocolo foram estabelecidas para ratos C57 / BL6 e pode não ser adequado para outras linhagens de camundongos. coordenadas estereotáxica deve ser determinado para cada estirpe e idade usando um corante como verde rápido antes do experimento. Para fazer isto, o corante é injectado e depois o rato é sacrificado, o cérebro é extraído e congelado durante 1 hrat -20 ° C. Uma vez que o cérebro é endurecida, que pode ser cortado com uma lâmina no local da injecção e observados sob um microscópio de dissecção para determinar se o local de injecção é optimizada para fins experimentais específicos.

passo críticotempos pós-sobrevivência: 4. vezes para a sobrevivência post será diferente, dependendo do local da injecção. Um tempo de sobrevivência a longo prazo permite que o tecido cerebral para se recuperar da lesão de injeção e, mais importante, as células observadas nas RMS e OB, após 60 dias são derivados da relação de repouso B1-NSC. Injeções no ventrículo lateral não prejudicar fisicamente o V-SVZ. Por isso, um período de 15 dias é suficiente para assegurar a expressão dos transgenes por células ependimais.

passo crítico 5: tempos pós-fixação. Excesso de pós-fixação do tecido cerebral pode gerar mascaramento de alguns antigénios, devido à actividade de ligação cruzada dos reagentes, tais como paraformaldeído. Estes são bons a preservar a estrutura da célula, mas podem reduzir a antigenicidade de algumas proteínas como a reticulação pode obstruir a ligação para os epitopos de anticorpos. técnicas de recuperação de antigénios pode ser necessário, especialmente se houver um tempo de incubação longo de fixação ou, se uma elevada percentagem de reticulação fixative é usado. Alternativamente, períodos mais curtos de pós-fixação de um RH têm-se revelado insuficiente no nossa experiência para manter a estrutura do tecido, bem como assegurar uma boa antigenicidade dentro das células, sem o uso de procedimentos de antigénio baixando.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	358126	25 mm x 89 mm
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326819	13 mm x 51 mm
Ultracentrifuge adapters	Beckman Coulter	358156
6-well plate	SPL	PLC-30006
24-well plate	SPL	PLC-30024
10 cm dish	SPL	PLC-20101	100 x 20 style
FACS tubes	Afora	DE400800	12 mm x 75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter	BD	340626	30 µm
Nitrocellulose filter	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm
Flow cytometer	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Steritop filter	Biofil	FPE-204-500	0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid	Addgene	#12251	Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid	Addgene	#12253	Core packaging plasmid
pMD2G plasmid	Addgene	#12259	Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid	Addgene	#12252	Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2x HBS			0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock solution at 100x, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10x.
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate	Life technologies	11360-039	Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Without calcium chloride and magnesium chloride, 10x, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1x PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	H9268	Powder. Prepare a 1,000x stock solution at 8 mg/ml in dHO
Paraformaldehyde EM grade 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument	NeuroLab, Leica	39463001	http://www.leicabiosystems.com/
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor	NeuroLab, Leica	39462950
Syringe holder	KD Scientific	KDS-311-CE
33 gauge syringe	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
Electric drill	Fine Science Tool	98096
Thermal blanket	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Comercial solution at 1 mg/ml.
Ketamine	Merial	Imalgene 500	Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture			Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topical skin adhesive
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11 cm x 21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Surgical marker pen	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant		SICCAFLUID	0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine	Betadine	694109.6	10% povidone-iodine
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Scalp vein set	Vygon V-green	70246.05T	25 G, 30 cm tube length
Vibratome	Leica	VT1000
Confocal microscope	Olympus	FluoView FV10i
Hot plate	Tehtnica	SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB)			0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution			0.9% NaCl in dH2O
Superglue	LOCTITE	767547
Sodium azide	Panreac	122712.1608
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normal goat serum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergent
Anti-GFP rabbit antibody	ROCKLAND	600-401-215	Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular probes	A-21206	Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mounting medium for fluorescent preparations