Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

तंत्रिका के विश्लेषण के लिए वयस्क माउस वी SVZ में कोशिकाओं की स्थिर और कुशल आनुवंशिक संशोधन स्टेम सेल स्वायत्त और गैर स्वायत्त प्रभाव

Published: February 17, 2016 doi: 10.3791/53282
Automatic Translation
1, 2,3, 4,5, 2,3
1Cell Division and Cancer Group, Spanish National Cancer Research Centre (CNIO), 2Centro de Investigaciones Biomédicas en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED), 3Departmento de Biologìa Celular, Universidad de Valencia, 4Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona (IBUB), 5Department of Molecular and Translational Medicine, Fibroblast Reprogramming Unit, University of Brescia

Abstract

अपेक्षाकृत मौन दैहिक स्टेम कोशिकाओं सबसे वयस्क ऊतकों में जीवन भर सेल नवीकरण समर्थन करते हैं। वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को दो विशिष्ट तंत्रिकाजन्य niches के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं: हिप्पोकैम्पस में दांतेदार गाइरस और वेंट्रिकुलर-subventricular क्षेत्र के subgranular क्षेत्र, पार्श्व की दीवारों में (वि SVZ भी subependymal जोन या सेज कहा जाता है) निलय। वयस्क स्टेम सेल आबादी के लिए इन विवो जीन स्थानांतरण रणनीतियों के विकास (यानी स्तनधारी मस्तिष्क के उन) स्टेम कोशिकाओं में वांछित transgenes की लंबी अवधि के अभिव्यक्ति और उनके ली गई संतान है, जिसके परिणामस्वरूप वर्तमान जैव चिकित्सा और जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण उपकरण है। इधर, एक प्रत्यक्ष इन विवो विधि वयस्क माउस वी SVZ कोशिकाओं के स्थिर आनुवंशिक संशोधन कि LVS द्वारा कोशिका चक्र स्वतंत्र संक्रमण और वी SVZ आला के अति विशिष्ट cytoarchitecture का लाभ लेता है के लिए प्रस्तुत किया है। विशेष रूप से, वर्तमान प्रोटोकॉल शामिलखाली LVS (नियंत्रण) या LVS या तो वी SVZ ही में विशिष्ट transgene अभिव्यक्ति कैसेट एन्कोडिंग का इंजेक्शन है, आला में कोशिकाओं के सभी प्रकार के vivo को निशाना बनाने के लिए, या पार्श्व वेंट्रिकल लुमेन में, ependymal को निशाना केवल कोशिकाओं। अभिव्यक्ति कैसेट तो transduced कोशिकाओं और फ्लोरोसेंट प्रोटीन, भी LVS द्वारा इनकोडिंग के जीनोम में एकीकृत कर रहे हैं, की अनुमति देने के लेबल की कोशिकाओं और सेल में स्वायत्त और गैर-स्वायत्त, आला-निर्भर प्रभाव के विश्लेषण के लिए transduced कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उनके संतान।

Introduction

murine वेंट्रिकुलर-subventricular क्षेत्र (वि SVZ), पार्श्व वेंट्रिकल स्ट्रिएटम का सामना करना पड़ की दीवारों में, एक बहुत सक्रिय कीटाणु क्षेत्र है जिसमें घ्राण बल्ब की लगातार उत्पादन में पूर्वज सेल प्रतिकृति और भेदभाव परिणामों की एक निरंतर प्रक्रिया (ओबी ) इन्तेर्नयूरोंस और महासंयोजिका oligodendrocytes 1। है, जो astrocytic प्रतिजन glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) को व्यक्त करने और इस तरह के nestin, ID1 के रूप में सेल स्टेम मार्कर, इन कोशिकाओं के आजीवन पीढ़ी तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (बी 1 कोशिकाओं को भी बुलाया एनएससी) के इस क्षेत्र में मौजूदगी से समर्थन किया जाना प्रतीत होता है और Sox2 2। GFAP व्यक्त बी 1 कोशिकाओं पारगमन पूर्वज amplifying (नल) कोशिकाओं (सी कोशिकाओं), जो व्यक्त प्रतिलेखन कारक Dlx2 उत्पन्न (डिस्टल-कम homeobox 2) और Ascl1 (स्तनधारी achaete-schute Homolog 1) और तेजी से एक बार कुछ विभाजित करने से पहले वे जन्म दे पलायन neuroblasts (ए कोशिकाओं) या oligodendroblasts 3 करने के लिए। prolif नव जनितerative neuroblasts पूर्व की ओर पलायन, ओ, जहां वे बारीक और भेदभाव निरोधात्मक interneurons के रूप में glomerular परतों में एकीकृत करने के लिए व्याख्यान चबूतरे प्रवासी धारा (आरएमएस) के गठन। प्रवास के लिए जाते युवा oligodendroblasts सीसी, जहां वे अपरिपक्व NG2 पॉजिटिव कोशिकाओं है कि स्थानीय स्तर पर विभाजित या परिपक्व myelinating oligodendrocytes 1,4 में अंतर करने के लिए जारी बनने के लिए ले जाते हैं।

बी 1 कोशिकाओं है, जो भ्रूण के रेडियल glial कोशिकाओं से निकाले जाते हैं, अपने पूर्ववर्तियों की लम्बी और ध्रुवीकृत आकृति विज्ञान को बनाए रखने और अपने आला के साथ एक उच्च स्तरीय विशेषज्ञ रिश्ते दिखा रहे हैं। वे ependyma जो लाइनों वेंट्रिकल और रक्त वाहिकाओं है कि वी SVZ आला सिंचाई के नेटवर्क के बीच अवधि। multiciliated ependymocytes के बीच बी 1 कोशिकाओं intercalates के छोटे शिखर प्रक्रिया और, एक भी गैर गतिशील प्राथमिक बरौनी में समाप्त होता है, जबकि उनके बेसल प्रक्रिया लंबी दूरी फैली तलीय संवहनी जाल है कि ख में इस जगह को समाप्त सिंचाई के दृष्टिकोण के लिएजाल केशिकाओं 2,5-8 की asal पटल।

बाद माउंट पूरे 3-डी confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा वेंट्रिकल पार्श्व दीवार की तैयारियों और उनके विश्लेषण गैर तंत्रिकाजन्य astrocytes, जो भी कर रहे हैं GFAP + बरकरार वी SVZ आला में से B1-एनएससी भेद करने के लिए सबसे विश्वसनीय तरीका पर आधारित है GFAP के लिए immunostaining कोशिका झिल्ली को चित्रित करने के लिए पतली B1-एनएससी शिखर प्रक्रिया, β-catenin लेबल, और cilial बेसल निकायों या acetylated α ट्यूबिलिन के एक मार्कर प्रत्येक बरौनी 5.8 की हद लेबल करने के रूप में या तो γ ट्यूबिलिन करने के लिए। निलय सतह से इन पूरे आरोह की टिप्पणियों से संकेत दिया है कि बी 1 और ependymal कोशिकाओं "पिनव्हील" 5, जिसमें एक या कई GFAP + B1 कोशिकाओं के uniciliated शिखर प्रक्रियाओं multiciliated ependymal कोशिकाओं की एक थाली से घेर लिया जाता है में व्यवस्थित कर रहे हैं।

बी 1 कोशिकाओं की विशेषता आकृति विज्ञान प्रयोगात्मक सबूत के साथ संबद्ध मैंकि रक्त वाहिकाओं / endothelial कोशिकाओं ndicating और मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) वेंट्रिकुलर गठन एनएससी 2,6,9-11 पर अभिनय घुलनशील संकेतों के सूत्रों विनियमित। निलय सतह, homotypic और heterotypic apico पार्श्व ependymal और बी 1 कोशिकाओं को शामिल बातचीत पर तंग जंक्शनों और adherens जंक्शनों 5,12 शामिल हैं। इसके अलावा, इस तरह के आसंजन अणुओं एन cadherin और वी कैमरा के रूप में बी 1 और ependymal कोशिकाओं के बीच जंक्शनल परिसरों में फंसा, वि SVZ आला में बी 1 की न केवल अत्यधिक आयोजित स्थिति को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन यह भी उनकी निष्क्रियता 12 13। Ependymal-B1 सेल monolayer एक प्रसार बाधा सीएसएफ से पानी और छोटे अणुओं की विनियमित प्रवाह की अनुमति है, लेकिन बड़े प्रोटीन 10,11 के कहनेवाला पारित होने को सीमित करने के रूप में कार्य करने के लिए प्रकट होता है। प्रयोगात्मक सबूत इंगित करता है कि विशिष्ट रूप से तैनात बी 1 सेल शिखर बरौनी सीएसएफ 2 में मौजूद polypeptides संकेत के एक संवेदक के रूप में एक भूमिका निभा सकता है,5-7। Ependymal कोशिकाओं रहे हैं, असल में, एनएससी व्यवहार 14,15 के नियमन में एक भूमिका के साथ घुलनशील और झिल्ली ही सीमित संकेतों की भी एक स्रोत है।

ऐसे ब्रोमो-डिऑक्सीयूरिडीन (BrdU), या रेट्रोवायरस के रूप में मिल न्यूक्लियोसाइड, व्यापक रूप से, एनएससी सहित पूर्वज कोशिकाओं, लेबल को विवो में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन तरीकों क्योंकि BrdU संकेतों दोहराया कोशिका विभाजन और रेट्रोवायरस के माध्यम से पतला रियायत के पारगमन के लिए 16,17 सेल प्रसार की उनकी आवश्यकता के कारण कोशिकाओं amplifying क्षणिक निशाना बनाने के लिए दिखाई लंबी अवधि के भाग्य ट्रेसिंग के लिए इष्टतम नहीं कर रहे हैं। विवो में एनएससी शरीर क्रिया विज्ञान, आला घटकों के साथ बातचीत सहित जांच करने के लिए, लेबल और शायद ही कभी विभाजित कोशिकाओं का पता लगाने, के रूप में बी 1-एनएससी काफी हद तक मौन हैं और उनके पड़ोसी ependymal कोशिकाओं शारीरिक शर्तों 3 के तहत विभाजित कभी नहीं करने के लिए एक विधि की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम बताते हैं कि lentiviral वैक्टर (LVS) उच्च दक्षता जीन मार्क के लिए अनुमतिआईएनजी और वयस्क एनएससी और गैर विभाजित ependymal कोशिकाओं की लंबी अवधि के संशोधन, कारण transduce करने के लिए और एक सेल चक्र-स्वतंत्र तरीके से लक्ष्य कोशिकाओं के जीनोम में एकीकृत करने के लिए उनकी क्षमता के लिए सबसे उचित। इसके अलावा, हम कैसे वितरण और वायरल अनुमापांक मदद के मार्ग विशेष जिससे आला-निर्भर, एनएससी पर ependymal प्रभाव के विश्लेषण की अनुमति बी 1 कोशिकाओं ependymal कोशिकाओं transduce करने के लिए, लेकिन नहीं दिखा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नैतिकता वक्तव्य: इस प्रोटोकॉल जानवरों की देखभाल यूरोपीय निर्देश 2010/63 / यूरोपीय संघ के अनुपालन में वालेंसिया के विश्वविद्यालय के दिशा-निर्देशों का पालन करती है।

1. में विवो के लिए एल.वी. की पीढ़ी अध्ययन अंकन (चित्रा 1 ए देखें)

चेतावनी: प्रक्रिया यहाँ बताया जैव सुरक्षा स्तर 2, इसलिए एक biohazard हुड में सभी निम्नलिखित प्रक्रियाओं का प्रदर्शन है। सुनिश्चित करें कि अनुसंधान कर्मियों उचित योग्य और सभी प्रक्रियाओं में प्रशिक्षित कर रहे हैं। गाउन, डबल दस्ताने और उपयुक्त आंखों की सुरक्षा सहित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, पहनें। अंत में, अच्छी तरह से (70% इथेनॉल, 10% ब्लीच और / या autoclaving से पोंछते द्वारा) सभी उपकरण और सतहों है कि वायरस के संपर्क में अनुमोदित सुविधा कीटाणुशोधन प्रथाओं के अनुसार हो सकता था शुद्ध करना।

  1. मानव भ्रूण गुर्दे 293T कोशिकाओं में एल.वी. का उत्पादन
    1. अभिकर्मक के लिए शुद्ध डीएनए तैयार करके इस प्रोटोकॉल की शुरुआत करें। तैयार है और डबल CsCl ग्रैड द्वारा प्रत्येक प्लाज्मिड शुद्धient centrifugation या अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्तंभ endotoxin मुक्त डीएनए उपज तरीकों। इस प्रोटोकॉल में हम हस्तांतरण वेक्टर प्लाज्मिड pRRL-पाप-PPT.PGK.EGFP.Wpre इस्तेमाल किया है। अनुशंसित कोर पैकेजिंग plasmids / pMDLg pRRE और pRSV.REV कर रहे हैं और लिफाफा प्लाज्मिड pMD2G 13,18,19।
    2. अभिकर्मक पहले चौबीस घंटा, Iscove संशोधित Dulbecco के मध्यम (IMDM) में प्लेट 5 एक्स 10 6 293T कोशिकाओं एक 10 सेमी प्लास्टिक पकवान में आदेश के लिए एक लगभग 1/4 1/3 के लिए मिला हुआ संस्कृति प्राप्त करने के लिए (सामग्री की तालिका देखें) अभिकर्मक। 5-7% सीओ 2 के माहौल में एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. अभिकर्मक से पहले ताजा माध्यम 2 घंटा के साथ मध्यम बदलें।
    4. एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब मिश्रण में 10 हस्तांतरण वेक्टर प्लाज्मिड की माइक्रोग्राम pRSV.REV के 2.5 माइक्रोग्राम और / pMDLg pRRE पैकेजिंग प्लास्मिड के 5 माइक्रोग्राम, और 3.5 के साथ (transgene की सीडीएनए या shRNA युक्त वितरित किया जाना है) #181; लिफाफा प्लाज्मिड pMD2G जी। 0.1x ते बफर के साथ 450 μl के अंतिम मात्रा को प्लाज्मिड समाधान श्रृंगार (सामग्री की तालिका देखें) / DH 2 0 (2: 1)। फिर 2.5 एम 2 CaCl के 50 μl जोड़ें।
    5. 2x Hepes खारा बफर के 500 μl के dropwise अलावा द्वारा वेग फार्म जबकि पूरी गति से vortexing 500 μl डीएनए ते 2 CaCl मिश्रण करने के लिए समाधान (एचबीएस, सामग्री की तालिका देखें)।
    6. तुरंत 293T कोशिकाओं को वेग जोड़ें। धीरे थाली मिश्रण करने के लिए ज़ुल्फ़। इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें और अभिकर्मक के बाद मध्यम 14-16 मानव संसाधन बदल जाते हैं।
    7. मीडिया बदलने के बाद सेल supernatants 30 मानव संसाधन ले लीजिए। 0.22 सुक्ष्ममापी ताकना nitrocellulose फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर और एकाग्रता के लिए आगे बढ़ें।
  2. LVS की एकाग्रता
    1. 2 के लिए 50,000 XG (दप-28 ultracentrifuge रोटर के साथ 19,000 आरपीएम) पर ultracentrifugation द्वारा वातानुकूलित माध्यम ध्यान लगाओएक 30 मिलीलीटर polypropylene पारदर्शी शंक्वाकार रोटर ट्यूब में कमरे के तापमान (आरटी) में मानव संसाधन।
      नोट: शंक्वाकार रोटर ट्यूबों के लिए उपयोग ultracentrifuge एडाप्टर (सामग्री की तालिका देखें)।
    2. Decanting द्वारा supernatants त्यागें और एक छोटी मात्रा (200 μl या उससे कम है, तो केवल एक ही centrifugation किया जाता है) फॉस्फेट बफर खारा में छर्रों resuspend (पीबीएस; सामग्री की तालिका देखें)। तब विंदुक ऊपर और नीचे के बारे में 20 बार।
    3. निलंबन और पूल में 50,000 एक्स जी (दप-55 ultracentrifuge रोटर के साथ 23,000 आरपीएम) कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ultracentrifugation द्वारा फिर से ध्यान केंद्रित है, भी। 5 मिलीलीटर की एक मामूली मात्रा के साथ polypropylene पारदर्शी रोटर ट्यूब का उपयोग करें (सामग्री की तालिका देखें)।
    4. बाँझ पीबीएस की एक बहुत छोटी मात्रा (1/500 या 1 / मध्यम से शुरू की मात्रा 1000) में अंतिम गोली Resuspend और आरटी पर 1 घंटे के लिए एक घूर्णन पहिया पर हिला। छोटे aliquots (5-20 μl) और एफ में विभाजितउन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर reeze।
    5. discarding से पहले 10% ब्लीच के साथ सभी खाली नलियों समझो।
  3. Lentiviral अनुमापन से फ्लो का प्रयोग
    1. एक दिन पहले, थाली 5 एक्स 10 4 हेला 2 मिलीलीटर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं (सामग्री की तालिका देखें)। 24 घंटे के लिए 5-7% सीओ 2 के माहौल में एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. अनुमापन के दिन, वायरल शेयर के एक विभाज्य पिघलना और, 10 -8 करने के लिए धारावाहिक dilutions तैयार DMEM में 10 -3 से।
      1. ऐसा करने के लिए, एक 24 अच्छी तरह से थाली ले और निम्न वेल्स को पहले अच्छी तरह से करने के लिए DMEM के 2 मिलीलीटर और 1.8 मिलीलीटर जोड़ें। तब (: 1000 या 10 -3 की 1 एक अंतिम कमजोर पड़ने के लिए) केंद्रित वायरल शेयर के 2 μl पहले अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ें।
      2. कई बार pipetting अच्छी तरह समाधान, परिवर्तन टिप मिश्रण और 10 -3 कमजोर पड़ने के 200 μl हस्तांतरण करने के बाददूसरे को अच्छी तरह से करने के लिए। निम्नलिखित कुओं में क्रमानुसार प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक 10 -8 कमजोर पड़ने से बना है।
    3. हेला कोशिकाओं इनक्यूबेटर से एक दिन पहले चढ़ाया ले लो। ध्यान से कुओं से मध्यम निकालें। हेला सेल युक्त कुओं के लिए 8 मिलीग्राम / एमएल hexadimethrine ब्रोमाइड के 1 μl के साथ मिलकर प्रत्येक वायरल कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे थाली मिश्रण करने के लिए ज़ुल्फ़।
      नोट: Hexadimethrine ब्रोमाइड संस्कृति में कोशिकाओं को वायरस सोखना बढ़ाने के लिए कहा है।
    4. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें और संक्रमण के 72 घंटे के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं। उसके बाद, मध्यम हटाने पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने और trypsin-EDTA के 200 μl जोड़ने के प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से (सामग्री की तालिका देखें)।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के बाद, ट्यूब प्रवाह cytometry में अच्छी तरह से प्रत्येक और फसल कोशिकाओं को पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
    6. पर आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x जी अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    7. soluti फिक्सिंग के 1 मिलीलीटर के साथ गोली Resuspend(1% formaldehyde इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रेड और पीबीएस में 2% भ्रूण गोजातीय सीरम) पर है, तो नलियों भंवर।
    8. 15 मेगावाट बिजली में एक 488 एनएम आर्गन-ionlaser का उपयोग कर कोशिकामापी एक प्रवाह में कोशिकाओं का विश्लेषण।
    9. मानक विन्यास के साथ साधन सेट करें: आगे-बितर (एफएस), पक्ष तितर बितर (एसएस), और प्रतिदीप्ति GFP के लिए (525/40 एनएम)। बनाम एसएस डॉट साजिश एक एफएस में चयन सेल की आबादी gating सेल समुच्चय और मलबे को बाहर करने के लिए। लघुगणक पैमाने में प्रतिदीप्ति लीजिए। प्रत्येक नमूने में GFP + कोशिकाओं की संख्या की गणना।
    10. निम्न सूत्र का उपयोग वेक्टर अनुमापांक की गणना:% + GFP / 100 संक्रमित एक्स कमजोर पड़ने कारक कोशिकाओं (डीएफ) की संख्या x = transducing इकाइयों (टीयू) / मिलीलीटर।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रक्रिया के विभिन्न भागों की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (एक) टी के भाग 1।वह प्रोटोकॉल: इन विवो लेबलिंग की पढ़ाई के लिए LVS, उचित plasmids के साथ HEK293T कोशिकाओं के अभिकर्मक से की पीढ़ी वायरस अनुमापांक के निर्धारण के लिए LVS प्रवाह ने संकेत सूत्र का उपयोग cytometry उत्पन्न करते हैं। plasmids और सेंट्रीफ्यूज रोटार के नाम संकेत कर रहे हैं। (ख और ग) प्रोटोकॉल के भाग 2: LVS की stereotaxic इंजेक्शन। "बी" एक वर्नियर पैमाने पर, एक युक्ति है कि stereotaxic उपकरणों का हिस्सा है और ठीक मापन के लिए कार्य करता है के लिए एक उदाहरण दर्शाया गया है। एक उदाहरण के रूप में, तीर 4.23 सेमी संकेत मिलता है। एक वर्नियर पैमाने (सही Antero पीछे में निर्देशांक (एपी), Medio पार्श्व (माले), और dorso उदर (डीवी) धुरी के रूप में एक (बाएं) शीर्ष देखने के लिए दिखाया गया है और एक बाण अनुभाग के लिए निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है ) मस्तिष्क की। "सी" बाण और राज्याभिषेक टांके बीच चौराहे के रूप में पर्वबिन्दु की स्थिति को इंगित करता है। LVS एक सिरिंज का उपयोग इंजेक्शन हैं। (घ) योजनाबद्ध चित्र दिखा कैसे मस्तिष्क मैंविश्लेषण के लिए कार्रवाई कर रहा है। दो गोलार्द्धों विभाजित कर रहे हैं और हर एक के दो ब्लॉकों में बांटा गया है। ब्लॉक 'ए', ओ बीएस युक्त, एपी स्तर पर एक राज्याभिषेक कटौती से उत्पादन किया जाता है तुरंत telencephalon साथ ओबी जंक्शन पश्च (पर्वबिन्दु 2.46 मिमी, एक संदर्भ के लिए Paxinos' एटलस देखें)। ब्लॉक 'बी' के दो राज्याभिषेक कटौती, के स्तर पर एक बस महासंयोजिका के सबसे व्याख्यान चबूतरे वाला पहलू के लिए पूर्वकाल (1.7 मिमी शीर्षस्थान) और दो ​​पार्श्व निलय के जंक्शन के स्तर पर एक दूसरे से एक द्वारा निर्मित है (पर्वबिन्दु -.22 मिमी)। जीएल, glomerular परत; GCL, दाना सेल परत; अनुसूचित जनजाति, स्ट्रिएटम; सीसी, महासंयोजिका; एसी, पूर्वकाल संयोजिका; एल.वी., पार्श्व वेंट्रिकल।

वी-SVZ / स्ट्रिएटम सीमा में या पार्श्व वेंट्रिकल में एल.वी. 2. stereotaxic इंजेक्शन (देखें चित्र 1 बी)

  1. तैयारी
    1. सवार के साथ शरीर और 70% इथेनॉल के साथ सुई नीचे छिड़काव द्वारा एक 33 गेज सुई के साथ एक 5 μl क्षमता सिरिंज जीवाणुरहितसभी तरह से बाहर खींच लिया। बार बार एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब से इथेनॉल aspirate और इसे बाहर बेदखल सभी तरह कई बार, और बाद में बाँझ पानी से अच्छी तरह कुल्ला सिरिंज। सिरिंज संस्कृति हुड में सुरक्षित रूप से एक तरफ रखें और यह शुष्क करने की अनुमति देते हैं।
    2. इस प्रक्रिया से सभी कचरे के विसर्जन के लिए एक उपयुक्त मात्रा करने के लिए 10% ब्लीच के साथ एक biohazard अपशिष्ट कंटेनर तैयार (आम तौर पर एक 500 मिलीलीटर कंटेनर में 200 मिलीलीटर)।
    3. तैयार है और पानी के साथ एक sealable प्लास्टिक भंडारण बैग भरने और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए यह वार्मिंग से एक 37 डिग्री सेल्सियस waterbed पहले से गरम। यह चूहों इंजेक्शन के बाद ठीक करने के लिए अनुमति देगा।
    4. इंजेक्शन शुरू करने से पहले -80 से वायरल शेयरों हटाये डिग्री सेल्सियस फ्रीजर भंडारण 1 घंटा और आरटी पर एक घूर्णन पहिया पर शीशी जगह है। विगलन के बाद, इंजेक्शन के समय के दौरान बर्फ पर वायरल शेयर बनाए रखें। एल.वी. की stereotaxic इंजेक्शन से पहले, 10 6 टीयू केंद्रित वायरल शेयरों पतला / संस्कृति हुड में पीबीएस का उपयोग μl।
    5. क्षेत्र में 70% इथेनॉल के साथ सर्जरी प्रदर्शन के लिए चुना साफ करता।
  2. एल.वी. के microinjection
    1. का चयन करें और सर्जरी (छुरी, ड्रिल, और छोटे चिमटी) के लिए आवश्यक उपकरणों बाँझ।
    2. intraperitoneally (आईपी) द्वारा एक 6-8 सप्ताह पुरानी माउस anesthetize ketamine और medetomidine के एक पशु चिकित्सा देखरेख मिश्रण इंजेक्शन। प्रत्येक जानवर के वजन और 50-75 मिलीग्राम ketamine और माउस शरीर के वजन के प्रति किलो 0.5-1 मिलीग्राम medetomidine (ketamine के 100-125 के आसपास μl / medetomidine माउस प्रति समाधान काम कर रहे) के साथ प्रत्येक खुराक।
    3. पैर की उंगलियों, पूंछ या कान बन्द रखो और यह सुनिश्चित करना है कि पशु कोई प्रतिक्रिया से पता चलता द्वारा संवेदनाहारी विमान का आकलन करें।
    4. एक बार माउस anesthetized है, किलो वजन माउस शल्य चिकित्सा के बाद दर्द को कम करने के प्रति 0.4-0.5 मिलीग्राम की एक खुराक पर अंतिम butorphanol subcutaneously इंजेक्षन।
    5. कान के बीच क्षेत्र दाढ़ी और जैसे iodopovidone या 70% इथेनॉल एक iodophor का उपयोग कर त्वचा कीटाणुरहित। बाँझ कपास का उपयोग कर शुद्ध-tipped applicators। सावधान रहो, जरूरत से ज्यादा पशु गीला करने के लिए नहीं के रूप में इस हाइपोथर्मिया बढ़ा सकते हैं।
    6. प्रवण स्थिति में जानवर एक stereotaxic फ्रेम पर रखें और ध्यान से कान सलाखों और तंत्र के तालू समर्थन का उपयोग कर सिर को ठीक। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग पैड सेट के साथ माउस रखें और आंखों को नेत्र स्नेहक लागू होते हैं।
    7. सिर की त्वचा पर एक 1 सेमी लंबा चीरा longitudinally एक छुरी का उपयोग कर, और धीरे ठीक चिमटी का उपयोग कर खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए त्वचा वापस लेना।
    8. ध्यान से एक बाँझ कपास इत्तला दे दी applicator के साथ हड्डी सतह को साफ। किसी भी शेष ऊतक के संपर्क में खोपड़ी की हड्डी को साफ।
    9. स्टीरियोटैक्टिक डिवाइस सिरिंज धारक के प्रयोग पर निष्फल सिरिंज माउंट।
    10. (जब तक सिरिंज सुई की नोक शीर्षस्थान, संयोजन बिंदु है जहां बाण (अनुदैर्ध्य और औसत दर्जे का) सिवनी लंबरूप राज्याभिषेक सिवनी द्वारा intersected है पर तैनात है सिरिंज धारक एक्स, वाई और जेड अक्ष ले जाएँ Figurई 1 बी)। सुनिश्चित करें शीर्षस्थान पर खोपड़ी की सतह पर है कि "शून्य" dorso उदर (डीवी) अक्ष की स्थिति।
    11. एक्स और वाई निर्देशांक गंतव्य के लिए सिरिंज ले जाएँ (1 टेबल और चित्रा 1 बी देखें)।
इंजेक्शन के क्षेत्र निर्देशांक
Antero पीछे (एपी) Medio पार्श्व (माले) Dorso उदर (डीवी)
सेज / स्ट्रिएटम सीमा 0.6 मिमी 1.2 मिमी -3.0 मिमी
पार्श्व वेंट्रिकल -0.3 मिमी +1.0 मिमी -2.6 मिमी

तालिका 1: Stereotaxic में लिए निर्देशांकjections। एपी और एमएल अक्ष, एक्स और वाई निर्देशांक के लिए शीर्षस्थान से एक दूरी (मिमी में) के रूप में दिया जाता है। "-" इंगित करता है "पीछे की ओर"। के लिए डीवी निर्देशांक "शून्य" पर्वबिन्दु बिंदु पर खोपड़ी की सतह है और डीवी निर्देशांक दूरी (मिमी) से संकेत मिलता है इस बिंदु से नीचे।

  1. एनोटेट एक्स, वाई और जेड गंतव्य आदेश को वापस इंजेक्शन साइट पर बाद में आने के लिए सक्षम होने के लिए वर्नियर पैमाने में समन्वय करता है। मार्क एक शल्य मार्कर पेन का उपयोग कर एक्स और वाई निर्देशांक में हड्डी।
  2. सिरिंज कार्य क्षेत्र से दूर ले जाएँ।
  3. का उपयोग करते हुए एक इलेक्ट्रिक ड्रिल खोपड़ी पर एक छेद ध्यान से नहीं कर मस्तिष्क को नुकसान पहुंचा है। pial सतह ड्रिल के रूप में यह मस्तिष्क की सतह को नुकसान हो सकता मत करो।
  4. 10 6 टीयू / μl वायरल समाधान के 1 μl के साथ सिरिंज लोड। एक 33 गेज तेज beveled सुई जिसका टिप 10-12 डिग्री के कोण है का प्रयोग करें। एक 90 डिग्री आंग में सिरिंज सुई की स्थितिLe मस्तिष्क की सतह के संबंध में।
  5. सिरिंज वापस इंजेक्शन की साइट के लिए ले जाने और इसे नीचे ले जाने के लिए जब तक टिप pial सतह को छूता है।
  6. Z करने के लिए सिरिंज के साथ मस्तिष्क घुसना में डीवी अक्ष समन्वय।
  7. धीरे-धीरे वायरल निलंबन, आदेश मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान को कम करने के लिए अत्यधिक तरल पदार्थ दबाव की वजह से रिलीज 0.2 μl / मिनट की दर से।
  8. 5-10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें वायरल निलंबन की backflow को कम करने के लिए और फिर सिरिंज वापस लेना बहुत धीरे धीरे। तरल के किसी भी अतिरिक्त है कि सिरिंज और एक प्रयोगशाला का उपयोग कर पोंछ के त्याग का एक परिणाम के रूप में सतह पर दिखाई दे सकते ब्लीच युक्त जैव सुरक्षा अपशिष्ट कंटेनर में तुरंत जगह दाग।
  9. stereotaxic सेट से बाहर पशु ले लो, एक गर्म पैड पर यह जगह है, और त्वचा के घाव चिपकने का उपयोग बंद कर दें। बेहोश करने की क्रिया 0.1-1.0 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन का उपयोग कर atipamezole उल्टा।
  10. subcutaneously 0.1 मिलीग्राम प्रति किलो माउस वजन हर 12 घंटा के अंतिम खुराक पर Bupenorphrine इंजेक्षन,कम समय तक चलने Butorphanol एनाल्जेसिक के प्रशासन के बाद 4 घंटा शुरू।
  11. एक गर्म पैड के साथ एक व्यक्तिगत पिंजरे में पशु रखें और जब तक माउस संज्ञाहरण से ठीक बारीकी से निगरानी। हाइड्रोजेल से एक बैग पिंजरे में जगह वसूली के बाद पशु हाइड्रेट मदद करने के लिए।
  12. तरल ब्लीच Biohazard निपटान में सभी जैव दूषित कचरे के निपटान। आकांक्षा और इथेनॉल के इंजेक्शन सिरिंज से साफ करें और पानी से कुल्ला। क्षेत्र, stereotaxic सेट और सर्जिकल सामग्री है कि ब्लीच और 70% इथेनॉल के साथ इस्तेमाल किया गया है कीटाणुरहित।
  13. 24-48 घंटा जिसके बाद वे एक पारंपरिक आवास सुविधा को हस्तांतरित किया जा सकता है के लिए जैव सुरक्षा स्तर 2 कमरे में अलग इंजेक्शन चूहों रखें

3. histological विश्लेषण

  1. छिड़काव, ऊतक संग्रह है, और सेक्शनिंग
    1. गहरा medetomidine और ketamine के एक पशु चिकित्सा देखरेख के मिश्रण का प्रयोग चूहों चतनाशून्य (टी pinching द्वारा संवेदनाहारी विमान का आकलनOES, पूंछ या कान), के रूप में पहले का वर्णन किया।
    2. Transcardially एक ही दर 17 में पंजाब में 4% की 75 मिलीलीटर पीएफए ​​के द्वारा पीछा खारा समाधान के 25 मिलीलीटर के साथ चूहों छिड़कना।
    3. मस्तिष्क निकालें और यह 1-16 मानव संसाधन (बढ़ा पोस्ट-निर्धारण बार कुछ एंटीजन की immunoreactivity कम हो सकती है) के लिए पंजाब में ठंड 4% पीएफए ​​की इसकी मात्रा कम से कम 10 बार में डुबो कर के बाद तय कर लो। पंजाब के साथ अच्छी तरह से शेष पीएफए ​​धो लें।
    4. चित्रा 1 डी के संकेत के बाद मस्तिष्क में कटौती और एक vibratome cyanoacrylate का उपयोग करने का धारक के परिणामस्वरूप ब्लॉक गोंद।
    5. 30 माइक्रोन मोटी सीरियल राज्याभिषेक एक vibratome का उपयोग वर्गों लीजिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब के साथ 24 multiwell प्लेटों में मस्तिष्क स्लाइस स्टोर। प्रदूषण को रोकने के लिए, 0.05% सोडियम azide पीबी समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है।
  2. immunohistochemistry
    1. 0.05% सोडियम azide, 1% ग्लाइसिन, 5% सामान्य बकरी सीरम के साथ बफर (पंजाब को रोकने में मुक्त अस्थायी वर्गों सेते हैं, और 0.1% TritX-100) कोमल एक कमाल मंच में झटकों के साथ आरटी पर 1 के लिए पर।
    2. ध्यान से, एक विंदुक के साथ अवरुद्ध बफर हटाने अवरुद्ध बफर में विरोधी GFP खरगोश प्राथमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका देखें) का एक उपयुक्त कमजोर पड़ने जोड़ें और कोमल झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए यह कमजोर पड़ने के साथ ऊतक सेते हैं।
    3. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान पंजाब के साथ 3 बार की एक न्यूनतम, एक धोने हर 10 मिनट से धो लें।
    4. समाधान को रोकने में fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का एक उपयुक्त कमजोर पड़ने के साथ मुक्त अस्थायी वर्गों) सेते (आरटी और कोमल झटकों पर 1 घंटे के लिए सामग्री की तालिका देखें)। ऊष्मायन के दौरान प्रत्यक्ष प्रकाश से वर्गों को सुरक्षित रखें।
    5. पंजाब, 3 बार बार हर 10 मिनट के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान से धो लें और वर्गों 5 मिनट के लिए पानी में 1 मिलीग्राम / एमएल DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) के साथ incubating द्वारा ऊतक counterstain। दो बार और जल्दी से बुद्धि rinsing द्वारा DAPI समाधान से धो लेंज पानी।
    6. धीरे ठीक एक पेंट ब्रश का उपयोग कर एक खुर्दबीन स्लाइड पर वर्गों जगह है। (सामग्री की तालिका देखें) फ्लोरोसेंट की तैयारी के लिए बढ़ते मध्यम ऊतक से अधिक की कुछ बूँदें डालो और ध्यान से शीर्ष पर एक coverslip जगह, जाँच है कि बढ़ते समाधान सही ढंग से पूरी सतह पर वितरित किया जाता है और वहाँ कोई बुलबुले हैं। धीरे coverslip बढ़ते मध्यम से अधिक के निकास के लिए नीचे निचोड़।
    7. जब बढ़ते समाधान (2-16 एचआर) बाहर सूख जाता है, 488 एनएम लेजर के साथ लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा नमूना विश्लेषण।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एल.वी. की मध्यस्थता जीन वितरण प्रणाली वयस्क माउस वी SVZ में कोशिकाओं की विवो पारगमन में लंबी अवधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रसार, प्रवास और भेदभाव के दौरान उनके ट्रैकिंग और आनुवंशिक संशोधन की इजाजत दी। संक्रमण और अभिव्यक्ति अत्यधिक प्रभावी रहे हैं और कई कोशिकाओं है कि अभिव्यक्ति के द्वारा अन्य गैर संक्रमित कोशिकाओं के बीच आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता का रिपोर्टर शामिल निकलेगा। हम इस प्रकार अब तक GFP फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ transduced कोशिकाओं, सर्वत्र व्यक्त phosphoglycerate काइनेज प्रमोटर द्वारा संचालित कल्पना की है, लेकिन अन्य पत्रकारों या प्रोटीन टैग भी इस्तेमाल किया जा सकता है। हम नियमित बजाय रिपोर्टर उत्सर्जन यह एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत पैदावार के रूप में की प्रत्यक्ष पता लगाने पर भरोसा कर के GFP के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करें। इसके अलावा, दिमाग ताजा विच्छेदित किया जा सकता है और लगानेवाला में डूब लेकिन ज्यादा बेहतर परिणाम transcardial छिड़काव द्वारा प्राप्त कर रहे हैं।

शुद्ध, केंद्रित वेक्टर शेयरों मैं धीरे धीरे रहे हैंस्ट्रिएटम के साथ अपनी सीमा में वी-SVZ में stereotaxic मार्गदर्शन में njected (आंकड़े 2A, बी)। दो महीने इंजेक्शन के बाद, कई GFP + कोशिकाओं वी SVZ में और इंजेक्शन साइट से लगभग 1 मिमी त्रिज्या में पाए गए (आंकड़े 2A, बी)। वी-SVZ और ependymal कोशिकाओं द्वारा रिपोर्टर की अभिव्यक्ति में कोशिकाओं के सभी प्रकार के पारगमन में LVS परिणामों के साथ संक्रमण का संकेत है कि LVS भी कुशलता से गैर विभाजित कोशिकाओं (चित्रा -2 सी; भी 15 देखें) लक्षित कर सकते हैं। वी-SVZ में GFP लेबलिंग पैटर्न 2 हफ्तों के बाद पाया गया कि 18 के समान था। ऊतक प्रतिक्रिया के कोई संकेत नहीं है, तथापि, इंजेक्शन पोस्ट 2 महीने में पहचाने जाने के बाद से लंबी अवधि की चोट की सर्जरी के कारण से ऊतकों की वसूली की अनुमति देता है। दो महीने की अवधि के दौरान, संक्रमित कोशिकाओं को एक नल-neuroblasts है कि बाहर ओबी की ओर पलायन क्षेत्र में प्रगति। क्योंकि इस प्रक्रिया में केवल कुछ ही दिनों के 3, GFP की उपस्थिति लेता हैसंक्रमण के बाद यह संकेत करता है कि LVS भी तंत्रिकाजन्य B1-एनएससी (चित्रा 2 डी) को लक्षित आरएमएस 60 दिनों में neuroblasts +। बी 1, सी के पारगमन, और ओबी (चित्रा 2 ई) में इंजेक्शन पैदावार + GFP इन्तेर्नयूरोंस के समय में एक कोशिकाओं।

उच्च अनुमापांक की एक छोटी मात्रा इंजेक्शन ependymocytes केवल (आंकड़े 2 एफ एच) के संक्रमण में पार्श्व वेंट्रिकल परिणामों में एल.वी. शेयरों में ध्यान केंद्रित किया। अधिकांश ependymal कोशिकाओं है, जो कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन S100β, होते संक्रमण (चित्रा 2i) से केवल 15 दिनों के बाद संवाददाता व्यक्त करते हैं। वी-SVZ / striatal सीमा में इंजेक्शन के विपरीत, कोई GFP + कोशिकाओं मनाया subependymally स्थित थे या आरएमएस या ओबी इस प्रक्रिया (आंकड़े 2H, जे) का उपयोग करने में। संक्रमण के दोनों प्रकार के वी SVZ के माध्यम से वर्गों में विश्लेषण किया जा सकता के रूप में समझाया। उन्होंने यह भी में विश्लेषण किया जा सकता पूरे माउंट पार्श्व वेंट की तैयारीricle दीवार (8 में प्रोटोकॉल देखें)।

हाल ही में, हम बताया कि कैसे ependymocytes को बी 1 कोशिकाओं के एन cadherin मध्यस्थता सेल सेल आसंजन उनकी निष्क्रियता को नियंत्रित करता है। हम प्रक्रिया यहाँ वर्णित प्रमुख नकारात्मक निर्माणों कि एन cadherin की निष्क्रियता के परिणामस्वरूप cadherin ले जाने LVS वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया है। हमने दिखा दिया है कि एनएससी और ependymal कोशिकाओं में या ependymal कोशिकाओं में एन cadherin की हानि केवल homotypic सेल सेल बातचीत के विघटन का एक परिणाम के रूप में एनएससी की संख्या और सेल चक्र प्रविष्टि में वृद्धि को बढ़ावा दिया (आंकड़े 3 ए, बी, 15 देखें)।

चित्र 2
चित्रा 2: इंजेक्शन चूहों के वर्गों में immunofluorescence द्वारा रिपोर्टर का पता लगाने (क) वयस्क उप-निलय क्षेत्र आला की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।। सेलुलर componen का सरलीकरणआला के टीएस दिखाया गया है। बी 1 कोशिकाओं ध्रुवीकृत हैं और आला के साथ एक विशेष संबंध दिखा रहे हैं। वे ependyma जो लाइनों वेंट्रिकल और रक्त वाहिकाओं है कि वी SVZ आला सिंचाई के नेटवर्क के बीच अवधि। multiciliated ependymocytes के बीच बी 1 कोशिकाओं intercalates के छोटे शिखर प्रक्रिया और, एक भी गैर गतिशील प्राथमिक बरौनी में समाप्त होता है, जबकि उनके बेसल प्रक्रिया तलीय संवहनी जाल है कि इस जगह जाल केशिकाओं के बेसल पटल में समाप्त सिंचाई के दृष्टिकोण के लिए फैली हुई है। बी 1 सेल डेरिवेटिव मध्यवर्ती progenitors कि सक्रिय रूप से रक्त वाहिकाओं के आसपास और आला astrocytes के साथ संपर्क में घ्राण बल्ब की ओर पलायन neuroblasts की जंजीरों में पैदा कर रहे हैं। (ख) एक गोलार्द्ध के माध्यम से एक राज्याभिषेक अनुभाग के योजनाबद्ध इंजेक्शन के स्तर पर और वी SVZ / स्ट्रिएटम सीमा पर इंजेक्शन के लिए सिरिंज सुई की स्थिति को दर्शाता है। (ग) सूक्ष्मग्राफ योजनाबद्ध स्टेशन में दिखाया गया है एक ही स्तर पर लियाDAPI के साथ ined (ग्रे, बाएं) और GFP के immunodetection के लिए, 60 दिनों के बाद इंजेक्शन (हरी दाएं)। बिंदीदार रेखा महासंयोजिका की सीमा से संकेत मिलता है। (घ) GFP संवाददाता वी SVZ के माध्यम से एक राज्याभिषेक अनुभाग में वी-SVZ आसपास या स्ट्रिएटम सीमा में इंजेक्शन के एक immunofluorescent का पता लगाने के उच्च बढ़ाई। बिंदीदार रेखा वी SVZ की सीमा से संकेत मिलता है। ध्यान दें कि कई कोशिकाओं वी SVZ आला में संक्रमित हैं। Ependymal कोशिकाओं वेंट्रिकल लुमेन सीमित cuboidal कोशिकाओं के रूप में मान्यता प्राप्त किया जा सकता है। (ई) GFP (हरा) के लिए immunofluorescence और neuroblast मार्कर PSZ-NCAM (लाल)। दोगुना सकारात्मक कोशिकाओं की उपस्थिति नोट, एनएससी कि 60 दिन पहले से संक्रमित थे neuroblasts की पीढ़ी के संकेत मिलते हैं। व्हाइट तीर neuroblasts पर इशारा करते हैं। Insets क्षेत्र सफेद वर्ग के भीतर संलग्न के अनुरूप हैं। (च) एक गोलार्द्ध के माध्यम से एक राज्याभिषेक अनुभाग के योजनाबद्ध इंजेक्शन के स्तर की स्थिति और दिखापार्श्व वेंट्रिकल में इंजेक्शन के लिए सिरिंज सुई। (हरे रंग में, दाएं) और GFP के immunodetection के लिए, (छ) सूक्ष्मग्राफ (बाएं ग्रे में) योजनाबद्ध DAPI के साथ दाग में दिखाया गया है एक ही स्तर पर लिया 15 दिन के इंजेक्शन के बाद। बिंदीदार रेखा महासंयोजिका की सीमा से संकेत मिलता है। (ज) GFP संवाददाता वी SVZ के माध्यम से एक राज्याभिषेक अनुभाग में वेंट्रिकल में इंजेक्शन के एक immunofluorescent का पता लगाने के उच्च बढ़ाई। बिंदीदार रेखा वी SVZ की सीमा से संकेत मिलता है। ध्यान दें कि केवल ependymal कोशिकाओं संक्रमित हैं। (मैं - जे) GFP के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस और ependymal सेल मार्कर S100β। पृष्ठीय (i) और उदर (जे) वी SVZ साथ कई दोगुना सकारात्मक कोशिकाओं की उपस्थिति पर ध्यान दें। striatal पैरेन्काइमा में एक astrocyte पर Arrowhead अंक भी S100β के साथ लेबल। कश्मीर। ओबी के माध्यम से कोरोनल खंड DAPI (ग्रे, बाएं) के साथ दाग और immunodetection GFP के (जीआरईएन; दाएं) क्षेत्र सफेद वर्ग 60 दिनों एक वी SVZ / स्ट्रिएटम इंजेक्शन के बाद से घिरा है। सूचना है कई लेबल न्यूरॉन्स। (ठ) ओबी DAPI के साथ दाग के माध्यम से कोरोनल खंड (ग्रे, बाएं) और GFP के immunodetection (हरे रंग में, सही) क्षेत्र में 45 दिनों एक पार्श्व वेंट्रिकल इंजेक्शन के बाद सफेद वर्ग से घिरा। सूचना है कोई ओबी लेबल न्यूरॉन्स होते हैं। CX, सेरेब्रल कॉर्टेक्स; एल.वी., पार्श्व वेंट्रिकल; एसटीआर, स्ट्रिएटम; जीएल, glomerular परत; GCL, दाना सेल परत; एमसीएल, माइट्रल सेल परत। स्केल सलाखों: सी, जी = 500 माइक्रोन; डी, ई, HJ 10 माइक्रोन =; केएल = 250 माइक्रोन; 100 माइक्रोन।

चित्र तीन
चित्रा 3:। एडल्ट एनएससी अधिक सक्रिय रूप से जब वे अपने आला से अलग हो पैदा करना (एक) चूहों कि खाली LVS (ऊपरी पैनल) या LVS कैर की striatal इंजेक्शन प्राप्त की वी SVZ के माध्यम से वर्गों के Confocal micrographsएक प्रमुख नकारात्मक cadherin निर्माण (नीचे पैनल), एल.वी. संवाददाता GFP (हरा), एनएससी मार्कर GFAP (लाल), कोशिका चक्र मार्कर Ki67 (सियान), और DAPI (नीला) का पता लगाने के लिए 60 दिनों के बाद immunostained यिंग संक्रमण। प्रत्येक मार्कर के लिए स्वतंत्र पैनल में दिखाया जाता है (ग्रे; दाएं)। (ख) चूहों कि एल.वी. संवाददाता GFP का पता लगाने के लिए immunostained पार्श्व वेंट्रिकल में एक प्रमुख नकारात्मक cadherin निर्माण (नीचे पैनल) ले जाने खाली LVS के इंजेक्शन (ऊपरी पैनल) या LVS प्राप्त की वी SVZ के माध्यम से वर्गों के Confocal micrographs (हरा), एनएससी मार्कर GFAP (लाल), कोशिका चक्र मार्कर Ki67 (सियान), और DAPI (नीला), 15 दिनों में संक्रमण के बाद। प्रत्येक मार्कर के लिए स्वतंत्र पैनल में दिखाया जाता है (ग्रे; दाएं)। व्हाइट तीर GFAP / GFP डबल सकारात्मक कोशिकाओं पर बात और सफेद तीर GFAP / Ki67 / GFP ट्रिपल सकारात्मक कोशिकाओं जिसका दोनों ही मामलों में नाभिक एक पीले रंग की तारांकन द्वारा संकेत कर रहे हैं पर इशारा करते हैं। मात्रात्मक विश्लेषण अधिक साइकिल चालन एनएससी संकेत दिया जब एन पाजीherin स्तरों एनएससी खुद को या केवल ependymal कोशिकाओं में 15 में कम है। स्केल: 10 माइक्रोन।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LVS वयस्क की आनुवंशिक संशोधन एनएससी 16,18 के लिए अन्य वायरल प्रणाली पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं। वी-SVZ आला करने के लिए lentiviruses के Stereotaxic वितरण लेबल और कभी कभी ट्रेस विभाजित B1-एनएससी ऐसे BrdU, के रूप में अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों जो कई कोशिका विभाजन, या रेट्रोवायरस के बाद पतला है, जो केवल कोशिकाओं को लक्षित की सीमाओं पर काबू पाने के लिए एक कारगर तरीका का प्रतिनिधित्व करता है कि आवेदन के क्षण में proliferating हैं। LVS, एक साथ adenoviruses साथ कोशिकाओं को अपनी साइकिल चालन स्थिति की स्वतंत्र रूप से संक्रमित कर सकते हैं और इस कोशिका चक्र नहीं है कि, इस तरह के ependymal कोशिकाओं के रूप में, या अपेक्षाकृत मौन हैं, और इस तरह शायद ही कभी विभाजित है, वयस्क एनएससी 16,18 तरह के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है। ट्रांसजीन स्थिरतापूर्वक एकीकृत और उच्च दक्षता transduced कोशिकाओं और उनके संतान के रूपात्मक लक्षण वर्णन की अनुमति के साथ व्यक्त हो जाते हैं।

एनएससी पड़ोसी की कोशिकाओं के साथ एक अति विशिष्ट आला में शरण कर रहे हैंके रूप में इस तरह के ependymal या नाड़ी कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से अपने स्वयं के सेल संतान इस प्रकार एक कसकर विनियमित वातावरण 2 का निर्माण। कई भ्रूण एनएससी की तरह, बी 1 कोशिकाओं वेंट्रिकल के बगल में झूठ और वेंट्रिकल छोटे, शिखर प्रक्रियाओं है कि एक भी गैर गतिशील प्राथमिक वेंट्रिकुलर सीएसएफ 1 (चित्रा 2A) में डूबे बरौनी में खत्म माध्यम से अपने तरल पदार्थ से संपर्क करें। इस विस्तृत संगठन विशेष रूप से वायरल अनुमापांक और वितरण क्षेत्र के नियंत्रण के माध्यम से आला में ependymal कोशिकाओं या सभी कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। Adherens और ध्रुवीकृत epithelia में तंग जंक्शनों कभी कभी जंक्शनल परिसरों में वायरल प्रविष्टि रिसेप्टर्स (यानी कार रिसेप्टर्स) की प्रतिबंधित स्थान के कारण कोशिकाओं और ऊतकों में विदेशी वायरस के प्रवेश को रोकने के लिए, दिखाया गया है। कहनेवाला आसंजन के विघटन इसलिए वायरस के विभिन्न प्रकार, lentivirus (एल.वी.) सहित द्वारा संक्रमण के पक्ष में है। दिलचस्प बात यह है LVS जब इस्तेमाल जंक्शनल परिसरों को बाधित करने के लिए दिखाया गया हैफेफड़ों के उपकला 20-23 में उच्च सांद्रता में। यह पार्श्व वेंट्रिकल 24 में इंजेक्शन LVS द्वारा बी 1-एनएससी के संक्रमण की पिछली रिपोर्टों समझा सकता है।

चूंकि B1-एनएससी संतान है कि पूर्व और पीछे की ओर पलायन का उत्पादन, GFP पॉजिटिव कोशिकाओं आरएमएस के सभी स्तरों पर और साथ ही ओबी और महासंयोजिका जहां वे मरणासन्न क्रमश न्यूरॉन्स और oligodendrocytes में अंतर, में पाया जा सकता है। हालांकि, हम न्यूरोजेनेसिस या oligodendrogenesis की दरों पर आनुवंशिक संशोधन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए संवाददाता अभिव्यक्ति का उपयोग नहीं करते। एक तरफ, महासंयोजिका इसलिए, कुछ कोशिकाओं है कि लेबल दिखाई इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान एक प्रत्यक्ष संक्रमण का परिणाम हो सकता सुई ट्रैक के रास्ते में है और। दूसरी ओर, क्योंकि वी SVZ में कोशिकाओं के सभी प्रकार के संक्रमित हो सकता है कि यह संभव नहीं भेद करने के लिए लेबल ओबी न्यूरॉन्स बी 1 कोशिकाओं या उनके ठेला में एक आनुवंशिक संशोधन का परिणाम है कि क्या हैenitor डेरिवेटिव। प्रयोगों में जो केवल ependyma संक्रमित है के मामले में, बी 1 कोशिकाओं और उनके संतान पत्रकार के साथ लेबल नहीं हैं और इसलिए न्यूरोजेनेसिस या oligodendrogenesis पता नहीं लगाया जा सकता है। हालांकि, एक B1-एनएससी का विश्लेषण करने के लिए या ओबी महासंयोजिका को oligodendrogenesis के साथ ही संक्रमित चूहों के वी SVZ में धीरे-विभाजित एनएससी के proliferative गतिविधि के लिए निर्भर न्यूरोजेनेसिस BrdU की अवधारण के लाभ ले सकते हैं। उदाहरण के लिए, चूहों BrdU 17 से 10 दिनों के LVS साथ संक्रमण के बाद पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल का पालन करने और 21 दिनों के लिए जीवित रहने के लिए अनुमति के साथ इंजेक्शन जा सकता है। ओबी / महासंयोजिका में BrdU पता लगाने तब, न्यूरोजेनेसिस / oligodendrogenesis की दर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि वी SVZ में BrdU प्रतिधारण सक्रिय B1-कोशिकाओं की संख्या 13 के एक अनुमान के रूप में लिया जा सकता है।

यहाँ वर्णित प्रक्रिया के लिए लाभ के समारोह के पूर्व हित के जीनों की अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकताperiments लेकिन यह भी शाही सेना के हस्तक्षेप पर या रचनात्मक Recombinase के वितरण के लिए आधार निर्माणों मुंह बंद करने के वितरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता वी SVZ कोशिकाओं में रोगाणु लाइन alleles floxed प्रेषित निष्क्रिय करने के लिए निर्माण करती है। इसके अलावा, इस तकनीक को भी यदि Lentivirus की एकल गाइड RNAs के इंजेक्शन एक Cre पर निर्भर Rosa26 Cas9 Knockin माउस 25 के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है CRISPR की मध्यस्थता जीनोम संपादन के लिए नियोजित किया जा सकता है।

महत्वपूर्ण कदम 1:। Lentivirus उत्पादन और हेरफेर विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में LVS साथ में विवो जीन स्थानांतरण आवेदन, उच्च अनुमापांक वेक्टर की तैयारी की आवश्यकता होती है के बाद से ही बहुत छोटी मात्रा मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना stereotaxically इंजेक्शन जा सकता है। Lentiviral तैयारियों शुद्ध और कुशलता से मस्तिष्क में इंजेक्शन से पहले केंद्रित हो तथ्य यह है कि LVS क्षणिक सह अभिकर्मक प्रणाली में उत्पन्न कर रहे हैं के कारण की जरूरत है। प्रक्रिया यहाँ बताया जैव सुरक्षा स्तर 2, इसलिए सभी प्रक्रियाओं है किआवश्यकता वायरस के हेरफेर BSL2 सुविधाओं में प्रदर्शन कर रहे हैं। अनुसंधान कर्मियों उचित योग्य और प्रशिक्षित करने की सभी प्रक्रियाओं में की जरूरत है। इसके अलावा, सर्जरी पशु कल्याण के लिए स्थानीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित दिनचर्या के बाद पूरी तरह से प्रशिक्षित जांचकर्ताओं द्वारा निष्पादित किया जाना चाहिए, और जैव सुरक्षा स्तर 2 क्षेत्रों में ठीक से निष्फल उपकरणों के साथ सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत किया जाना चाहिए। जानवरों की पर्याप्त पूर्व ऑपरेटिव और पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल बाहर किया जाना चाहिए और स्थापित पशु चिकित्सा और नर्सिंग प्रथाओं के अनुसार होना चाहिए। अधिक विशेष रूप से, सभी सावधानियों दर्द और तनाव संज्ञाहरण और analgesia के प्रशासन सहित पशु करने के लिए प्रवृत्त कम करने के लिए लिया जाना चाहिए। पशुओं में वायरस के उपयोग के विषय में हर कदम संस्थागत अधिकारियों द्वारा अधिकृत और स्थानीय नियमों के अनुसार किया जाना चाहिए। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण भी एक गाउन, डबल दस्ताने और उपयुक्त आंखों की सुरक्षा सहित, पहना जाना चाहिए। पंखसहयोगी, सभी उपकरण और सतहों कि संपर्क में वायरस के साथ अच्छी तरह से हो सकता था facility's कीटाणुशोधन प्रथाओं को मंजूरी दी (70% इथेनॉल, 10% ब्लीच और / या autoclaving से पोंछते द्वारा) के अनुसार decontaminated किया जाना चाहिए।

हमारे अनुभव में, कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक विधि 293T कोशिकाओं में डीएनए को शुरू करने का एक बहुत ही कुशल और सस्ते तकनीक है। हालांकि वाणिज्यिक डीएनए अभिकर्मक अभिकर्मकों भी इस चरण में निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल 293T कोशिकाओं के मीडिया प्रतिस्थापन के बाद 30 घंटे में वायरल सतह पर तैरनेवाला के संग्रह के लिए अनुकूलित है। Lentiviral सतह पर तैरनेवाला भी 24 एकत्र किया जा सकता है और 48 घंटे के मीडिया बदलने के बाद। हालांकि, हमारे अनुभव में 30 घंटा पर एक एकल संग्रह एक उच्च अनुमापांक lentivirus वेक्टर पैदा करता है।

महत्वपूर्ण कदम 2: सूत्र का उपयोग वेक्टर अनुमापांक की गणना के व्यावहारिक उदाहरण:% + GFP / 100 x कोशिकाओं को संक्रमित एक्स कमजोर पड़ने एफए की संख्याctor (डीएफ) = transducing इकाइयों (टीयू) / मिलीलीटर। इस उदाहरण में, 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं (293T) पिछले दिन 10 5 कोशिकाओं के पारगमन के लिए अनुमति वरीयता प्राप्त हैं। प्रवाह cytometry प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में प्रयोग transduced कोशिकाओं का% प्राप्त करने के बाद, transduced कोशिकाओं के दो मूल्यों की गणना, जिनमें से उन dilutions जिस पर पारगमन न संतृप्त है और न ही बहुत कम है के अनुरूप करने के लिए चुना जाता है। उदाहरण के लिए: कमजोर पड़ने कारक 10 -6 उपज 8.08% की कोशिकाओं को संक्रमित है, और कमजोर पड़ने कारक 10 -5 उपज एक ६१.७८% कोशिकाओं को संक्रमित। अनुमापांक मूल्यों सूत्र कोशिकाओं transduced और अपनी इसी कमजोर पड़ने कारक के मूल्यों का उपयोग कर लागू करने से प्रदान की औसत है। इस उदाहरण में:

कमजोर पड़ने कारक 10 -6 = (8.08 / 100) के लिए अनुमापांक x 1,00,000 x 10 6 = 8.08 · 10 9 टीयू / मिलीलीटर

कमजोर पड़ने कारक 10 -5 = (61,78 / 100) के लिए अनुमापांक x 1,00,000 x 10 5= ६.१७८ · 10 9 टीयू / मिलीलीटर

औसत = [(8,08 + 6,178) / 2] · 10 9 = 7.1 · 10 9 टीयू / मिलीलीटर

महत्वपूर्ण कदम 3: stereotaxic इंजेक्शन। विधि यहाँ वर्णित LVS विशिष्ट स्थानों में stereotaxically निर्देशित वितरण के उच्च titers की कम मात्रा के उपयोग पर निर्भर करता है। इस प्रोटोकॉल में दिए गए stereotaxic निर्देशांक C57 / BL6 चूहों के लिए स्थापित किया गया है और अन्य माउस उपभेदों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता। Stereotaxic निर्देशांक प्रत्येक तनाव और उम्र तेजी से हरे रंग प्रयोग करने से पहले की तरह एक डाई का उपयोग करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। ऐसा करने के लिए, डाई इंजेक्ट किया जाता है और बाद माउस बलिदान है, मस्तिष्क निकाले और 1 hrat -20 डिग्री सेल्सियस के लिए जमे हुए है। एक बार मस्तिष्क कठोर है, यह इंजेक्शन के स्थल पर एक ब्लेड के साथ कटा हुआ है और एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे देखा निर्धारित करने के लिए इंजेक्शन साइट विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए अनुकूलित है कि क्या किया जा सकता है।

महत्वपूर्ण कदम4: पोस्ट-अस्तित्व बार। पोस्ट-अस्तित्व बार इंजेक्शन के स्थल के आधार पर अलग अलग हो जाएगा। एक लंबे समय तक जीवित रहने के समय मस्तिष्क के ऊतकों इंजेक्शन घाव से उबरने के लिए और अधिक महत्वपूर्ण बात, 60 दिनों के बाद आरएमएस और ओबी में मनाया कोशिकाओं रिश्तेदार मौन B1-एनएससी के डेरिवेटिव हैं अनुमति देता है। पार्श्व वेंट्रिकल में इंजेक्शन शारीरिक रूप से वी SVZ नुकसान नहीं है। इसलिए, एक 15 दिन की अवधि सुनिश्चित करने के लिए transgenes की अभिव्यक्ति ependymal कोशिकाओं से पर्याप्त है।

महत्वपूर्ण कदम 5: पोस्ट-निर्धारण बार। मस्तिष्क के ऊतकों के अत्यधिक पोस्ट-निर्धारण इस तरह के paraformaldehyde के रूप में अभिकर्मकों, तिर्यक की गतिविधि के कारण, कुछ एंटीजन की मास्किंग उत्पन्न हो सकता है। ये सेल संरचना के संरक्षण में अच्छे हैं, लेकिन crosslinking के रूप में कुछ प्रोटीन का प्रतिजनकता कम कर सकते हैं epitopes के लिए बाध्य एंटीबॉडी में बाधा डालती कर सकते हैं। प्रतिजन पुनर्प्राप्ति तकनीकों की आवश्यकता हो सकती है, खासकर अगर वहाँ एक लंबे निर्धारण ऊष्मायन समय है या अगर crosslinking एफ के एक उच्च प्रतिशतixative प्रयोग किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, 1 घंटा के बाद निर्धारण की छोटी अवधि के ऊतकों की संरचना को बनाए रखने के साथ-साथ प्रतिजन पुन: प्राप्त करने की प्रक्रियाओं के उपयोग के बिना कोशिकाओं के भीतर एक अच्छा प्रतिजनकता सुनिश्चित हमारे अनुभव में पर्याप्त साबित कर दिया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

सभी जोड़तोड़ एक जैव सुरक्षा स्तर 2 कमरे में किए गए थे। पशु प्रोटोकॉल वालेंसिया के विश्वविद्यालय के आचार समिति ने मंजूरी दे दी है और यूरोपीय निर्देश 2010/63 / यूरोपीय संघ के अनुपालन में सभी थे।

Acknowledgments

हम एम.जे. Palop की मदद और Universidad डी वालेंसिया के SCSIE की तकनीकी सहायता स्वीकार करते हैं। हम यह भी उपयोगी टिप्पणी और पांडुलिपि की चर्चा के लिए Antonia Follenzi धन्यवाद। यदि Fundación Botin, इसके Santander विश्वविद्यालयों नेटवर्किंग प्रभाग के माध्यम से बैंको Santander द्वारा, द्वारा और Generalitat Valenciana (Programa Prometeo, ACOMP, और आईएसआईसी) और Ministerio de Economia Y Competitividad से अनुदान द्वारा समर्थित है (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED और RETIC बाज़) । यह काम भी MINECO और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) 2012-एसटीजी से BFU2010-21823 और RETIC बाज़ अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (260511- पीडी-HUMMODEL) एसी बी एम पी करने के लिए। MINECO की एक स्पेनिश एफपीआई फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor Beckman Coulter SW-28
Ultracentrifuge rotor Beckman Coulter SW-55
Ultracentrifuge tubes  Beckman Coulter 358126 25 mm x 89 mm
Ultracentrifuge tubes  Beckman Coulter 326819 13 mm x 51 mm
Ultracentrifuge adapters Beckman Coulter 358156
6-well plate SPL PLC-30006
24-well plate SPL PLC-30024
10 cm dish SPL PLC-20101 100 x 20 style
FACS tubes Afora DE400800 12 mm x 75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter BD 340626 30 µm
Nitrocellulose filter Millipore SCGPU05RE 0.22 μm 
Flow cytometer BD LSR Fortessa Blue laser 488 nm
Steritop filter Biofil FPE-204-500  0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid  Addgene #12251 Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid  Addgene #12253 Core packaging plasmid
pMD2G plasmid  Addgene #12259 Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid  Addgene #12252 Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Biowest L0101-500 For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium  Life technologies 12440-053 For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE) Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2x HBS 0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS) Biowest S181B-500 Stock solution at 100x, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10x.
Glutamine Sigma-Aldrich G7513-100 Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate Life technologies 11360-039 Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement Life technologies 35050-061 Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin Sigma-Aldrich P4458 Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056 With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS) Sigma-Aldrich D1408 Without calcium chloride and magnesium chloride, 10x, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1x PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)  Sigma-Aldrich H9268 Powder. Prepare a 1,000x stock solution at 8 mg/ml in dHO
Paraformaldehyde EM grade 16% EM Sciences 15710
Name Company Catalog Number Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument NeuroLab, Leica 39463001 http://www.leicabiosystems.com/
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor NeuroLab, Leica 39462950
Syringe holder KD Scientific KDS-311-CE
33 gauge syringe Hamilton P/N    84851/00 #85RN
Electric drill Fine Science Tool 98096
Thermal blanket Ufesa AL5512/01 230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver  Jata MP373N Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine Esteve DOMTOR  Comercial solution at 1 mg/ml. 
Ketamine Merial Imalgene 500  Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol Pfizer Torbugesic Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole Esteve Antisedan Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution Braun 13465412
Histoacryl Braun 1050052 Topical skin adhesive
HydroGel Clear H2O 70-01-5022
Kimwipes Kimberly-Clark 34120 11 cm x 21 cm
Bleach/Virkon Dupont
Surgical marker pen Staedler 313-9 Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant   SICCAFLUID 0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine Betadine 694109.6 10% povidone-iodine
Name Company Catalog Number Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump Cole-Parmer Inst. Co. HV-07524-55 Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head Cole-Parmer Inst. Co. HV-07518-00 Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube Cole-Parmer Inst. Co. HV-96410-16 Platinum L/S 16
Scalp vein set Vygon V-green 70246.05T 25 G, 30 cm tube length
Vibratome Leica VT1000
Confocal microscope Olympus FluoView FV10i
Hot plate Tehtnica SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB) 0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA) Panreac 141451.1211 Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution 0.9% NaCl in dH2O
Superglue LOCTITE 767547
Sodium azide Panreac 122712.1608
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100
Normal goat serum Millipore S30-100
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 Detergent
Anti-GFP rabbit antibody ROCKLAND 600-401-215 Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular probes A-21206 Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G EM Sciences 17984-25 Mounting medium for fluorescent preparations

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).
  2. Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).
  3. Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone. Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).
  4. Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., Alvarez-Buylla, A. Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci. 26 (30), 7907-7918 (2006).
  5. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
  6. Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).
  7. Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
  8. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. (39), (2010).
  9. Ramirez-Castillejo, C., et al. Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal. Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).
  10. Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow! Front Cell Neurosci. 6, (2012).
  11. Delgado, A. C., et al. Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction. Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).
  12. Kokovay, E., et al. VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression. Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).
  13. Porlan, E., et al. MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin. Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).
  14. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain. Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).
  15. Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone. Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).
  16. Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. In vivo targeting of subventricular zone astrocytes. Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).
  17. Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).
  18. Consiglio, A., et al. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).
  19. Dull, T., et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  20. Bomsel, M., Alfsen, A. Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).
  21. Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine. J Biomed Biotechnol. , (2010).
  22. Bonazzi, M., Cossart, P. Impenetrable barriers or entry portals? The role of cell-cell adhesion during infection. J Cell Biol. 195 (3), 349-358 (2011).
  23. Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer. PLoS One. 8 (11), (2013).
  24. Yamashita, T., et al. Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum. J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).
  25. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 108 Neurogenesis वेंट्रिकुलर-subventricular क्षेत्र subependymal जोन पार्श्व वेंट्रिकल तंत्रिका स्टेम सेल ependymal सेल आला lentivirus।
तंत्रिका के विश्लेषण के लिए वयस्क माउस वी SVZ में कोशिकाओं की स्थिर और कुशल आनुवंशिक संशोधन स्टेम सेल स्वायत्त और गैर स्वायत्त प्रभाव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Porlan, E., Martí-Prado, B.,… More

Porlan, E., Martí-Prado, B., Consiglio, A., Fariñas, I. Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects. J. Vis. Exp. (108), e53282, doi:10.3791/53282 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter