Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Abstract

Relativ ruhig unterstützen somatische Stammzellen lebenslang die Zellerneuerung in den meisten adulten Geweben. Neurale Stammzellen im erwachsenen Gehirn von Säugetieren sind zwei spezifische neurogenen Nischen eingeschränkt: die Subgranularzone des Gyrus dentatus des Hippocampus und der ventrikulären-Subventrikularzone; in den Wänden der seitlichen (V-SVZ auch subependymale Zone oder SEZ bezeichnet) Ventrikel. Die Entwicklung von In-vivo-Gentransfer-Strategien für die adulte Stammzellpopulationen (dh diejenigen des Säugetiergehirns), die sich in langfristige Expression des gewünschten Transgene in den Stammzellen und deren abgeleiteten Nachkommen ist ein wichtiges Instrument in der aktuellen biomedizinischen und biotechnologischen Forschung. Hier wird eine direkte in vivo-Verfahren für die stabile genetische Veränderung von erwachsenen Maus V-SVZ Zellen präsentiert, die den Vorteil des Zellzyklus-unabhängig Infektion durch LVs und dem hoch spezialisierte Zellarchitektur des V-SVZ Nische findet. Insbesondere beinhalten die aktuelle Protokolls die Injektion von Leer LVs (Kontrolle) oder LVs kodiert bestimmten Transgen-Expressionskassetten entweder in die V-SVZ selbst, für den in-vivo-Targeting von allen Arten von Zellen in der Nische oder in die lateralen Ventrikel Lumen zum Targeting von ependymalen Zellen, die nur. Expressionskassetten werden dann in das Genom der transduzierten Zellen und fluoreszierende Proteine ​​integriert, die ebenfalls von dem LVs kodiert, erlauben die Detektion der transduzierten Zellen für die Analyse der Zelle autonom und nicht autonomen, Nische abhängige Effekte in den markierten Zellen und ihre Nachkommen.

Introduction

Die Maus-ventrikulären-Subventrikularzone (V-SVZ), in den Wänden des lateralen Ventrikel des Striatum zugewandt ist, ist eine sehr aktive Keimbereich, in dem ein kontinuierlicher Prozess der Vorläuferzellreplikation und Differenzierung ergibt sich die anhaltende Produktion von Riechkolben (OB ) Inter und Corpus callosum Oligodendrozyten ^1. Die lebenslange Erzeugung dieser Zellen wird durch die Anwesenheit in diesem Bereich von neuralen Stammzellen (NSC; auch als B1-Zellen) unterstützt werden, die die astrozytären Antigen glial fibrillary acidic protein (GFAP) und Stammzellmarker wie Nestin, Id1 auszudrücken und Sox2 ^2. GFAP-exprimierenden B1 Zellen erzeugen Transit Verstärken Vorläufer (TAP) Zellen (C-Zellen), die die Transkription DLX2 auszudrücken Faktoren (distal losen homeobox 2) und ASCL1 (mammalian Achaete-Schute homolog 1) und schnell zu einem mehrmals teilen, bevor sie Anlaß geben zu migrieren Neuroblasten (A-Zellen) oder oligodendroblasts ^3. Neu generierten prolifoperativen Neuroblasten Migration nach vorn, die rostralen Migrationsstrom (RMS) an den OB bildet, wo sie in dem körnigen und glomeruläre Schichten wie differenziert inhibitorischen Inter integrieren. Migrieren von jungen oligodendroblasts zur CC bewegen, wo sie unreif NG2-positive Zellen werden, die lokal oder differenzieren zu reifen myelinisierenden Oligodendrozyten ^1,4 weiter zu unterteilen.

B1-Zellen, die aus fötalen radialen Gliazellen ableiten, behalten die langgestreckte und polarisierte Morphologie ihrer Vorgänger und weisen eine hoch spezialisierte Beziehung zu ihrer Nische. Sie erstrecken sich zwischen dem Ependyms welche Linien der Herzkammer und dem Netzwerk von Blutgefäßen, die die V-SVZ Nische bewässern. Die kleine apikale Prozess der B1-Zellen lagert sich unter multiciliated ependymocytes und endet in einem unbeweglichen primären Zilien, während ihre basalen Prozess lange Strecken erweitert die planare Gefäßplexus zu nähern, die diese Nische Ende in der b bewässertasal Lamina des Plexus Kapillaren ^2,5-8.

Der zuverlässigste Weg B1-NSC aus nicht-neurogenen Astrozyten, die auch GFAP ^+, in der intakten V-SVZ Nische zu unterscheiden, basiert auf ganze Montage Zubereitungen der Ventrikel Seitenwand und deren Analyse durch 3-D konfokale Mikroskopie nach für GFAP Immunfärbung des dünnen B1-NSC apikalen Verfahren, β-Catenin zu beschriften Zellmembranen abzugrenzen, und entweder γ-Tubulin als Marker für cilial Basalkörpern oder acetyliertes α-Tubulin die Ausdehnung jeder cilium ^5,8 zu beschriften. Beobachtungen dieser Ganz Halterungen von der ventrikulären Oberfläche haben gezeigt, dass B1 und Ependymzellen in "pinwheels" ⁵ angeordnet sind, in denen die uniciliated apikale Prozesse eines oder mehrerer GFAP ⁺ B1-Zellen von einer Rosette aus multiciliated Ependymzellen umgeben sind.

Die charakteristische Morphologie von B1-Zellen korreliert mit experimentellen Beweis iRückenmarksflüssigkeit (CSF) bilden geregelt Quellen von löslichen Signale ndicating die Blutgefäße / Endothelzellen und ventrikuläre auf NSCs wirkenden ^2,6,9-11. An der ventrikulären Oberfläche, homotypische und hetero apikal-lateralen Wechselwirkungen zwischen ependymal und B1-Zellen gehören tight junctions und Adhärenzverbindungen ^5,12. Außerdem impliziert Adhäsionsmolekülen in den junctional Komplexen zwischen B1 und Ependymzellen, wie N-Cadherin und V-CAM, wurden in der V-SVZ Nische, sondern auch ihre Ruhe ¹² die hoch organisierten Positionierung von B1 nicht nur gezeigt, zu regulieren ^{, 13.} Die ependymalen-B1 Zellmonoschicht erscheint als eine Diffusionsbarriere zu wirken, um den geregelten Fluss von Wasser und kleinen Molekülen aus der CSF erlaubt, aber den Durchgang von großen interzellulären Proteinen ^10,11 einzuschränken. Experimentelle Daten zeigen, dass die einzigartig positioniert, B1 Zelle apikal Zilien eine Rolle als Sensor von Signalisierungs Polypeptide ² in der CSF spielen ^könnte,7.5. Ependymzellen sind an sich auch eine Quelle von löslichen und membrangebundenen Signale mit einer Rolle bei der Regulation von NSC Verhalten ^14,15.

Rückverfolgbar Nucleoside, wie Brom-desoxyuridin (BrdU) oder Retroviren sind weit zu beschriften Vorläuferzellen, einschließlich NSC, in vivo verwendet. Jedoch sind diese Methoden nicht optimal für die Rückverfolgung langfristige Schicksal weil BrdU Signale durch wiederholte Zellteilungen und Retroviren verdünnen erscheinen vorzugsweise vorübergehend an Zielzellen aufgrund ihrer Erfordernis der Zellproliferation zur Transduktion ^16,17 verstärken. NSC Physiologie in vivo, auch der Wechselwirkungen mit Nischen Komponenten zu untersuchen, ist es entscheidend, ein Verfahren zu etablieren selten teilende Zellen zu kennzeichnen und Spuren, als B1-NSCs weitgehend ruhig sind und deren Nachbar Ependymzellen nie ³ unter physiologischen Bedingungen unterteilen. Hier zeigen wir, dass lentivirale Vektoren (LVs) ermöglichen eine hocheffiziente Gen ZeichenIng und langfristige Änderung der Erwachsenen NSC und nicht teil Ependymzellen aufgrund meisten angemessen ihrer Fähigkeit zu transduzieren und in das Genom der Zielzellen in einer Zellzyklus-unabhängigen Weise zu integrieren. Darüber hinaus zeigen wir, wie die Route der Lieferung und virale Titer Hilfe speziell Ependymzellen transduzieren, aber nicht B1-Zellen wodurch die Analyse der Nische abhängig, ependymal Auswirkungen auf NSCs.

Protocol

Ethikerklärung: Dieses Protokoll folgt die Tierpflege-Richtlinien von der Universität von Valencia in Übereinstimmung mit den europäischen Richtlinie 2010/63 / EU.

1. Erzeugung von LV für In-vivo-Studien-Kennzeichnung (siehe 1A)

ACHTUNG: Die hier beschriebene Verfahrensweise ist Biosicherheitsstufe 2, also alle die folgenden Verfahren in einem Biohazard Haube zuführen. Stellen Sie sicher, dass die Mitarbeiter in der Forschung entsprechend qualifiziert sind und in allen Verfahren geschult. Persönliche Schutzausrüstung tragen, einschließlich Kleid, Doppelhandschuhe und geeignete Schutzbrille. Schließlich dekontaminieren gründlich alle Werkzeuge und Oberflächen, die in Kontakt mit Viren nach zugelassenen Einrichtung Desinfektion Praktiken gewesen sein könnte (nach mit 70% Ethanol, 10% Bleichmittel und / oder Autoklavieren Abwischen).

1. Die Produktion der LV in menschliche embryonale Nierenzellen 293T
   1. Starten Sie dieses Protokoll durch die Vorbereitung reine DNA für die Transfektion. Vorbereiten und reinigen jedes Plasmid durch doppelte CsCl gradient Zentrifugation oder andere im Handel erhältliche Säulenverfahren Endotoxin-freie DNA ergibt. In diesem Protokoll haben wir den Transfer-Vektor-Plasmid pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre verwendet. Empfohlen Kern Verpackung Plasmide sind pMDLg / pRRE und pRSV.REV und Umschlag Plasmid pMD2G ^13,18,19.
   2. Vierundzwanzig Stunden vor der Transfektion Platte 5 x 10 ⁶ 293T-Zellen in Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) in einem 10 cm Kunststoffschale, um eine etwa 1/4 bis 1/3 konfluente Kultur (Tabelle der Materialien sehen) zu erhalten für Transfektion. Bei 37 ° C inkubieren in einem befeuchteten Inkubator in einer Atmosphäre von _{5-7% CO 2.}
   3. Ersetzen Sie das Medium mit frischem Medium 2 Stunden vor der Transfektion.
   4. In einem sterilen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Mischung 10 & mgr; g Plasmid-Transfervektor (der cDNA des Transgens oder shRNA enthält geliefert werden) mit 2,5 ug des pRSV.REV und 5 ug der pMDLg / pRRE Verpackungs Plasmide und 3,5 & #181; g des Umschlags Plasmid pMD2G. Make-up, die das Plasmid-Lösung auf ein Gesamtvolumen von 450 ul mit 0,1 x TE-Puffer (siehe Tabelle der Materialien) / dH ₂ 0 (2: 1). Dann fügen Sie 50 ul 2,5 M CaCl _2.
   5. Bilden den Niederschlag durch tropfenweise Zugabe von 500 ul des 2x HEPES-gepufferte Saline (HBS, siehe Tabelle of Materials) Lösung für das 500 & mgr; l DNA-TE-CaCl _{2 -Mischung,} während bei voller Geschwindigkeit Vortexen.
   6. In den Niederschlag zu den 293T-Zellen sofort. Vorsichtig schwenken die Platte zu mischen. Bringen Sie die Zellen in den Inkubator und ändern Sie das Medium 14-16 Stunden nach der Transfektion.
   7. Sammeln Sie die Zellüberständen 30 Stunden nach den Medienwechsel. Filtern Überstand durch ein 0,22 um Porennitrocellulosefilter und fahren Sie mit Konzentration.
2. Die Konzentration von LVs
   1. Konzentriere das konditionierte Medium durch Ultrazentrifugation bei 50.000 · g (19.000 rpm mit SW-28-Ultrazentrifuge Rotor) für 2h bei Raumtemperatur (RT) in einem 30 ml Polypropylen transparent konischen Rotor Röhre.
      Hinweis: Verwenden Sie Ultrazentrifuge Adapter für konische Rotor Rohre (siehe Tabelle der Materialien).
   2. Verwerfen des Überstandes durch Dekantieren und Resuspendieren der Pellets in einem kleinen Volumen (200 & mgr; l oder weniger, wenn nur eine Zentrifugation durchgeführt wird) Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS, siehe Table of Materials). Dann Pipette auf und ab etwa 20-mal.
   3. Pool der Suspensionen und konzentrieren sich wieder durch Ultrazentrifugation, auch bei 50.000 x g (23.000 rpm mit SW-55-Ultrazentrifuge Rotor) für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Verwenden Polypropylen transparent Rotorrohre mit einem Nennvolumen von 5 ml (siehe Tabelle der Materialien).
   4. Das endgültige Pellet resuspendieren in einem sehr kleinen Volumen (1/500 oder 1 / 1.000 des Ausgangs Volumen des Mediums) steriler PBS und Schütteln auf einem rotierenden Rad für 1 h bei RT. Geteilt in kleinen Portionen (5-20 ul) und fReeze sie bei -80 ° C.
   5. Behandeln Sie alle Leerrohre mit 10% Bleichmittel vor der Entsorgung.
3. Lentivirale Titration unter Verwendung von Durchflusszytometrie
   1. Am Tag zuvor Platte 5 x 10 ⁴ HeLa-Zellen pro Well in 6-Well-Gewebekulturplatten in 2 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (siehe Tabelle der Materialien). Bei 37 ° C inkubieren in einem befeuchteten Inkubator in einer Atmosphäre von _{5-7% CO 2} für 24 Std.
   2. Am Tag der Titration eines Aliquots der Virusstamm auftauen und Verdünnungsreihen vorbereiten, von ^{10 -3 bis 10 -8,} in DMEM.
      1. Um dies zu tun, nehmen Sie eine 24-Well-Platte und 2 ml DMEM in die erste Vertiefung und 1,8 ml auf die folgenden Mulden. Dann fügen Sie in die erste Vertiefung 2 ul der konzentrierten Virusstamm (bis zu einer endgültigen Verdünnung von 1: 1000 oder ^{10 -3).}
      2. Nach dem Pipettieren mehrmals gründlich die Lösung, ändern Spitze zu mischen und 200 ul der ^{10 -3} Verdünnung übertragenauf der zweiten Wanne. Wiederholen Sie den Vorgang in Serie in den folgenden Brunnen, bis die ^{10 -8} Verdünnung hergestellt wird.
   3. Nehmen HeLa-Zellen am Vortag aus dem Inkubator überzogen. Entfernen Sie vorsichtig Medium aus Brunnen. 1 ml jeder Virusverdünnung zusammen mit 1 & mgr; l von 8 mg / ml Hexadimethrinbromid den HeLa Zellen enthaltenden Vertiefungen. Vorsichtig schwenken die Platte zu mischen.
      Anmerkung: Hexadimethrinbromid zugegeben, um die Virusadsorption an den Zellen in der Kultur zu erhöhen.
   4. Bringen Sie die Zellen in den Inkubator und erlauben die Infektion für 72 h ablaufen. Danach wird das Medium zu entfernen, um die Zellen einmal mit PBS waschen und 200 ul Trypsin-EDTA in den jeweils gut (Tabelle der Materialien sehen).
   5. Nach 5 min bei 37 ° C, 2 ml PBS in jede Vertiefung und Ernte Zellen in der Durchflusszytometrie Rohre.
   6. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei RT und Absaugen des Überstandes.
   7. Das Pellet mit 1 ml Befestigungs solutiauf (1% Formaldehyd Elektronenmikroskopie Grad und 2% fötalem Rinderserum in PBS), dann die Rohre vortexen.
   8. Analysieren der Zellen in einem Durchflußzytometer eine 488 nm Argon-ionlaser bei 15 mW Leistung verwendet wird.
   9. Stellen Sie das Gerät mit der Standardkonfiguration: Vorwärtsstreu (FS), Seitenstreuung (SS) und Fluoreszenz für GFP (525/40 nm). Markieren Sie die Zelle Bevölkerung Gating in einem FS vs. SS Punktauftragung auszuschließen Zellaggregate und Schutt. Sammeln Fluoreszenz in logarithmischen Skala. Berechnen der Anzahl der GFP ^{+ -Zellen} in jeder Probe.
   10. Berechnen Vektor-Titer unter Verwendung der folgenden Formel:% GFP ⁺ / 100 x Anzahl der Zellen infiziert x Verdünnungsfaktor (DF) = transduzierenden Einheiten (TU) / ml.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der verschiedenen Teile des Verfahrens (a) Teil 1 von t.er Protokoll: Erzeugung von LVs für in vivo Markierungsstudien von der Transfektion von HEK293T-Zellen mit geeigneten Plasmiden, die LVs zur Bestimmung des Virustiters durch Durchflusszytometrie unter Verwendung der angegebenen Formel zu erzeugen. Die Namen der Plasmide und der Zentrifugenrotoren sind angegeben. (B und c) Teil 2 des Protokolls: stereotaktische Injektion von LVs. "B" zeigt ein Beispiel für eine Vernier-Skala, ein Gerät, das Teil des stereotaktischen Instrumente und dient zur Feinmessungen. Als Beispiel zeigen die Pfeile 4,23 cm. Ein Nonius wird verwendet, um die Koordinaten in der von vorne nach hinten (AP), mediolaterale (ML) und dorsoventrale (DV) Achse wie gezeigt für eine Draufsicht (links) und nach einem Sagittalschnitt zu bestimmen (rechts ) des Gehirns. "C" zeigt die Position des Bregma als Schnittpunkt zwischen den sagittalen und koronalen Naht. LVs werden unter Verwendung einer Spritze eingespritzt. (D) Schematische Zeichnung zeigt, wie das Gehirn is für die Analyse aufbereitet. Die beiden Hemisphären aufgeteilt und jedes ist in zwei Blöcke aufgeteilt. Block "a", mit den OBs, wird durch einen koronalen Schnitt an der AP-Ebene erzeugt unmittelbar hinter dem OB Kreuzung mit der Telenzephalon (Bregma 2,46 mm; siehe Paxinos' Atlas für eine Referenz). Block "B" wird durch zwei koronale Schnitte erzeugt, eine an der vorderen Ebene nur auf die am rostralen Bereich des Corpus callosum (Bregma 1,7 mm) und ein zweites auf der Höhe des Übergangs der beiden seitlichen Kammern (Bregma -0.22 mm). GL, glomerulären Schicht; GCL, Körnerzellschicht; st, Striatum; cc, Corpus callosum; ac, Commissura anterior; lv, Seitenventrikel.

2. stereotaktische Injektion von LV in die V-SVZ / Striatum Rand oder in den lateralen Ventrikel (siehe Abbildung 1b)

1. Vorbereitung
   1. Sterilisieren eine 5 & mgr; l Kapazität Spritze mit einer 33-Gauge-Nadel durch den Körper Sprühen nach unten und Nadel mit 70% Ethanol, wobei der Kolbenganz herausgezogen. Ethanol aus einer 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen wiederholt anzusaugen und auszustoßen es den ganzen Weg mehrmals heraus, und spülen Sie die Spritze gründlich mit sterilem Wasser hinterher. Legen Sie die Spritze sicher beiseite in der Kultur Kapuze und trocknen lassen.
   2. Bereiten Sie eine biohazard Abfallbehälter mit 10% Bleichmittel auf ein geeignetes Volumen für das Eintauchen des gesamten Abfalls aus diesem Verfahren (in der Regel 200 ml in einem 500 ml-Behälter).
   3. Vorbereitung und Vorwärmung über einen 37 ° C Wasserbett durch einen verschließbaren Plastikaufbewahrungstasche mit Wasser gefüllt und erwärmt sie auf 37 ° C. Dies ermöglicht Mäusen nach Injektion zu erholen.
   4. Entfernen viralen Bestände von -80 ° C Gefrierschrank Lagerung 1 Stunde vor den Injektionen Start und legen Sie das Fläschchen auf einem rotierenden Rad bei RT. die virale Lager auf Eis während der Zeit der Injektionen Nach dem Auftauen erhalten. Vor der stereotaktische Injektion von LV, verdünnen die konzentrierten viralen Bestände bis 10 ⁶ TU / ul PBS in der Kultur Haube verwenden.
   5. Desinfizieren den Bereich zum Durchführen der Operation mit 70% Ethanol ausgewählt.
2. Mikroinjektion von LV
   1. Wählen und sterilisieren Werkzeuge für die Operation erforderlich (Skalpell, Bohrer und kleine Pinzette).
   2. Anesthetize eine 6-8 Wochen alten Maus intraperitoneal durch (ip) eine tierärztliche überwachte Mischung aus Ketamin und Medetomidin injizieren. Wiegen jedes Tier und Dosis mit jeweils 50 bis 75 mg Ketamin und 0,5-1 mg Medetomidin pro kg Maus Körpergewicht (etwa 100 bis 125 ul der Ketamin / Medetomidin Arbeitslösung pro Maus).
   3. Beurteilen Sie die Narkose Ebene, die durch die Zehen, Schwanz oder Ohr kneifen und sicherzustellen, dass das Tier keine Reaktion zeigt.
   4. Sobald die Maus anästhesiert wird, Butorphanol subkutan in einer endgültigen Dosis von 0,4-0,5 mg pro kg Maus Gewicht zu minimieren postoperativen Schmerzen injizieren.
   5. Rasieren Sie den Bereich zwischen den Ohren und desinfizieren Sie die Haut mit einem Iodophor wie iodopovidone oder 70% Ethanol. Reinige sterilen Watte mit-tipped Applikatoren. Achten Sie darauf, nicht zu stark, das Tier zu benetzen, da diese Unterkühlung verschlimmern können.
   6. Legen Sie das Tier in Bauchlage auf einem stereotaktischen Rahmen und befestigen vorsichtig den Kopf mit den Ohr Bars und den Gaumen Unterstützung der Vorrichtung. Halten Sie die Maus mit einem Heizkissen Satz bei 37 ° C und gelten ophthalmische Schmiermittel auf die Augen.
   7. Machen Sie einen 1 cm langen Schnitt auf der Kopfhaut in Längsrichtung mit einem Skalpell und zurückziehen die Haut sanft den Schädel mit einer feinen Pinzette freizulegen.
   8. Reinigen Sie den Knochenoberfläche mit einem sterilen Wattestäbchen. Reinigen Sie die freiliegenden Schädelknochen jeglicher verbleibende Gewebe.
   9. Montieren Sie den sterilisierten Spritze auf der stereotaktischen Gerät mit dem Spritzenhalter.
   10. Bewegen Sie den Spritzenhalter x, y und z-Achse, bis die Spitze der Spritzennadel am Bregma positioniert ist, der Punkt, wo die Verbindung sagittal (Längs- und medial) Naht senkrecht von der Kranznaht geschnitten wird (FigurE 1b). Stellen Sie sicher, dass die "Null" -Stellung des dorsoventrale (DV) Achse an der Schädeloberfläche bei Bregma ist.
   11. Bewegen, um die Spritze zu der x und y Zielkoordinaten (siehe Tabelle 1 und Abbildung 1b).

Region von Injektions	Koordinaten
	Antero-posterior (AP)	Mediolaterale (ML)	Dorsoventrale (DV)
SEZ / Striatum Grenze	0,6 mm	1,2 mm	-3,0 mm
Seitenventrikel	-0,3 mm	1,0 mm	-2,6 mm

Tabelle 1: Stereotaktische Koordinaten für die inProjektionen. Für den AP und ML-Achse, x und y-Koordinaten werden als ein Abstand (in mm) von Bregma gegeben. "-" Bedeutet "in Richtung posterior". Für die DV "Null" koordiniert ist die Oberfläche des Schädels am Bregma Punkt und DV-Koordinaten den Abstand (in mm) nach unten von diesem Punkt an.

12. Kommentieren Sie die x, y und z Zielkoordinaten in dem Nonius um in der Lage zu sein, wieder auf die Injektionsstelle zu kommen später. Mark der Knochen an der x- und y-Koordinaten eines chirurgischen Marker Stift.
13. Bewegen Sie die Spritze vom Arbeitsbereich.
14. ein elektrischer Bohrer vorsichtig auf den Schädel ein Loch nicht mit dem Gehirn zu beschädigen. Sie nicht die Pia-Oberfläche bohren, da dies die Hirnoberfläche beschädigen können.
15. Legen Sie die Spritze mit 1 ul der 10 ⁶ TU / ul Viruslösung. Verwenden Sie eine 33 Gauge scharf abgeschrägten Nadel, deren Spitze einen Winkel von 10 bis 12 ° aufweist. Positionieren Sie die Nadel der Spritze in einem 90 ° angle in Bezug auf die Hirnoberfläche.
16. Bewegen Sie die Spritze wieder an der Injektionsstelle und bewegen Sie ihn nach unten, bis die Spitze der Pia-Oberfläche berührt.
17. Durchdringen das Gehirn mit der Spritze zur z im DV-Koordinatenachse.
18. Freisetzung langsam die Virussuspension mit einer Rate von 0,2 ul / min, um Schäden am Hirngewebe durch zu hohe Flüssigkeitsdruck zu minimieren.
19. Warten für 5-10 min den Rückfluss von Virussuspension zu minimieren und dann die Spritze zurückzuziehen sehr langsam. Tupfen Sie überschüssiges an Flüssigkeit, die an der Oberfläche als Folge des Zurückziehens der Spritze mit einem Labortuch und legen Sie sie sofort in der bleichmittelhaltigen Biosicherheit Abfallbehälter auftreten.
20. Nehmen Sie das Tier aus der stereotaktischen Satz, legen Sie sie an einem warmen Pad, und schließen Sie die Wunde Hautkleber verwenden. Kehren Sie die Sedierung mit 0,1 bis 1,0 mg / kg Körpergewicht Atipamezol.
21. Injizieren Bupenorphrine subkutan in einer letzten Dosis von 0,1 mg pro kg Maus Gewicht alle 12 Stunden,ausgehend von 4 Stunden nach der Verabreichung des kurzer Dauer Butorphanol Analgetikum.
22. Legen Sie das Tier in einer individualisierten Käfig mit einem warmen Unterlage und genau beobachten, bis die Maus aus der Narkose erholt. Legen Sie eine Tüte mit Hydrogel in den Käfig des Tieres Hydrat nach der Genesung zu helfen.
23. Entsorgen Sie alle Bio-kontaminierte Abfälle in der flüssigen Bleich Biohazard Verfügung. Reinigen Sie die Spritze durch Ansaugen und Ausstoßen von Ethanol und mit Wasser abspülen. Desinfizieren Sie die Fläche, die stereotaktische Satz und das chirurgische Material, das mit Bleichmittel und 70% Ethanol verwendet wurde.
24. Halten Sie injizierten Mäusen isoliert in der Biosicherheitsstufe 2 Zimmer für 24 bis 48 Stunden nach dem sie zu einem herkömmlichen Gehäuse Anlage übertragen werden

3. Die histologische Analyse

1. Perfusion, Gewebesammlung, und Schneiden
   1. mit einem veterinär überwacht Mischung von Medetomidin und Ketamin (Beurteilung der Narkose Ebene tief in die Mäuse betäuben durch das T Kneifenoes, Schwanz oder Ohr), wie zuvor beschrieben.
   2. Transkardial perfundieren die Mäuse mit 25 ml Kochsalzlösung von 75 ml von 4% PFA in PB mit der gleichen Rate ¹⁷ gefolgt.
   3. Extrahieren Sie das Gehirn und Post-fixieren, indem sie es in mindestens der 10-fachen Volumen von kaltem 4% PFA in PB für 1-16 h (erhöhte Postfixierung mal abnehmen kann die Immunreaktivität von einigen Antigene) eintauchen. Gründlich die restliche PFA mit PB.
   4. Schneiden Sie das Gehirn nach Angaben von 1d und kleben Sie die erhaltene Block an den Inhaber eines Vibratom mit Cyanacrylat.
   5. Sammeln Sie 30 um dicke Serien Koronalschnitte ein Vibratom verwenden. Bewahren Sie die Hirnschnitten in 24-Multiwell-Platten mit PB bei 4 ° C. Zur Vermeidung von Kontaminationen, 0,05% Natriumazid können zur PB Lösung zugegeben werden.
2. Immunhistochemie
   1. Inkubieren der freischwebenden Teile Puffer (PB mit 0,05% Natriumazid, 1% Glycin, 5% normalem Ziegenserum und 0,1% Trit in Blockierungsauf X-100) für 1 h bei RT mit sanft in einem Wippschüttler schütteln.
   2. Eine geeignete Verdünnung von anti-GFP-Kaninchen primären Antikörper (siehe Tabelle der Materialien) in Blocking-Puffer und Inkubation Gewebe mit dieser Verdünnung für 48 Stunden bei 4 ° C unter leichtem Schütteln vorsichtig entfernen Blockierungspuffer mit einer Pipette, hinzuzufügen.
   3. Waschen Sie die primären Antikörperlösung, die mindestens 3-mal mit PB, einen Wasch alle 10 Minuten ab.
   4. Inkubation der frei schwebenden Abschnitte mit einer geeigneten Verdünnung von Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper) in Blockierungslösung (Table of Materials) für 1 h bei RT und leichtem Schütteln zu sehen. Schützen Sie die Abschnitte von direktem Licht während der Inkubation.
   5. Waschen Sie die sekundäre Antikörperlösung mit PB, 3-mal einmal alle 10 min ab, und Gegenfärbung des Gewebes durch die Abschnitte mit DAPI Inkubation (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol) bei 1 mg / ml in Wasser für 5 min. Waschen Sie die DAPI-Lösung durch Spülen zweimal und schnell weg Witzh Wasser.
   6. Sanft legen Sie die Abschnitte auf einem Objektträger einen feinen Pinsel verwenden. Geben Sie einige Tropfen Eindeckmedium für Fluoreszenz-Präparate über das Gewebe (Tabelle der Materialien sehen) und vorsichtig mit einem Deckglas legen und überprüfen, dass die Befestigungslösung korrekt über die gesamte Fläche verteilt wird und es gibt keine Blasen. Vorsichtig das Deckglas drücken Sie die mehr als Einschlussmittel abzulassen.
   7. Wenn die Montagelösung trocknet aus (2-16 h), Analyse der Probe durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie mit der 488-nm-Laser.

Representative Results

LV-vermittelte Gen-Delivery-System kann für die Langzeit-in vivo Transduktion von Zellen in der adulten Maus V-SVZ verwendet werden, so dass ihre Verfolgung und genetische Veränderung während der Proliferation, Migration und Differenzierung. Die Infektion und die Expression sind hochwirksame und zahlreiche Zellen ergeben, die leicht zu unterscheiden und auch nicht-infizierten Zellen durch die Expression des Reporter aufgenommen werden können. Wir haben bisher transduzierten Zellen mit GFP fluoreszierenden Reportern visualisiert, angetrieben durch den ubiquitär Phosphoglyceratkinase-Promotors exprimiert, aber auch andere Reporter oder Protein-Tags verwendet werden. Wir verwenden routinemäßig Antikörper gegen GFP statt auf dem direkten Nachweis des Reporteremissions verlassen, da es eine stärkere Fluoreszenzsignal ergibt. Darüber hinaus können die Gehirne in Fixiermittel frisch und eingetaucht werden seziert, aber viel bessere Ergebnisse werden durch transkardialer Perfusion erhalten.

Gereinigt, konzentriert Vektorstocks sind langsam injected unter stereotaktischen Führung in die V-SVZ an seiner Grenze mit dem Striatum (2a, b). Zwei Monate nach der Injektion, zahlreiche GFP ^{+ -Zellen wurden} in der V-SVZ und in einem ungefähren 1 mm Radius von der Injektionsstelle (2a, b) gefunden. Infektion mit LVs führt zur Transduktion aller Arten von Zellen in der V-SVZ und die Expression des Reporters durch Ependymzellen zeigt an, dass LVs ausrichten können Zellen (Abbildung 2c, siehe auch ¹⁵⁾ auch effizient nicht teil. GFP-Markierungsmuster in der V-SVZ war ähnlich der ¹⁸ nach 2 Wochen. Keine Spur von Gewebereaktion war jedoch nach 2 Monaten nach der Injektion nachweisbar, da die lange Zeit die Wiederherstellung des Gewebes aus der Verletzung von der Operation zugefügt werden können. Während der zwei Monate, die Fortschritts infiziert TAP Zellen in A-Neuroblasten, die die Zone in Richtung der OB Migration aus. Da dieser Vorgang dauert nur wenige Tage ^3, das Vorhandensein von GFPNeuroblasten in der RMS 60 Tage ⁺ nach der Infektion zeigt an, dass LVs auch neurogene B1-NSCs (2d) zielen. Die Transduktion von B1, C und A-Zellen zum Zeitpunkt der Injektion Ausbeuten GFP ⁺ Inter im OB (Figur 2e).

Injektion eines kleinen Volumens mit hohem Titer konzentriert LV Bestände in den lateralen Ventrikel führt zur Infektion von ependymocytes allein (Figuren 2f-h). Die meisten Ependymzellen, die den Calcium-bindende Protein S100β enthalten, drücken die Reporter nach nur 15 Tagen nach Infektion (Abbildung 2i). Im Gegensatz zur Injektion in die V-SVZ / striatalen Grenze, keine GFP ⁺ Zellen beobachtet wurden subependymally befindet oder in den RMS oder OB mit diesem Verfahren (Fig 2H, j). Beide Arten von Infektionen können in Schnitte durch die V-SVZ analysiert werden, wie erläutert. Sie können auch ganz Montage Zubereitungen der seitlichen Entlüftungs analysiert werdenricle Wand (siehe Protokoll in ^8).

Vor kurzem haben wir beschrieben, wie N-Cadherin-vermittelte Zell-Zell-Adhäsion von Zellen B1 ependymocytes ihre Ruhe reguliert. Wir haben das Verfahren hier LVs beschrieben verwendet zu liefern Cadherin dominant negative Konstrukte trägt, die zu einer Inaktivierung von N-Cadherin geführt. Wir haben gezeigt, dass der Verlust von N-Cadherin in den NSC und Ependymzellen oder in Ependymzellen nur eine Erhöhung in der Anzahl und der Zellzyklus-Eintritt von NSC als Ergebnis der Unterbrechung der homotypischen Zell-Zell-Wechselwirkungen gefördert (3a, b; siehe ^15).

Abbildung 2: Reporter Nachweis durch Immunfluoreszenz in Abschnitte von injizierten Mäusen (a) Schematische Darstellung der erwachsenen Unter ventrikulären Zone Nische.. Eine Vereinfachung des zellularen components der Nische dargestellt. B1-Zellen sind polarisiert und eine spezielle Beziehung mit der Nische aufweisen. Sie erstrecken sich zwischen dem Ependyms welche Linien der Herzkammer und dem Netzwerk von Blutgefäßen, die die V-SVZ Nische bewässern. Die kleine apikale Prozess der B1-Zellen lagert sich unter multiciliated ependymocytes und endet in einem unbeweglichen primären Zilien, während ihre basalen Prozess der planaren Gefäßplexus Ansatz erstreckt, die diese Nische in der Basalmembran des Plexus Kapillaren enden bewässert. B1 Zellderivate sind Zwischenvorläuferzellen, die aktiv in der Umgebung der Blutgefäße wuchern und migrieren Ketten von Neuroblasten zu den Riechkolben in Kontakt mit Nischen Astrozyten. (B) Schematische Darstellung eines Frontalschnitt durch eine Halbkugel zeigt die Höhe der Injektion und die Position des Spritzennadel für Injektionen an der V-SVZ / Striatum Grenze. (C) mikroskopische Aufnahme auf gleicher Höhe in der schematischen sta wiesenenined mit DAPI (grau; links) und für die Immundetektion von GFP (grün, rechts) 60 Tage nach der Injektion. Die gestrichelten Linien zeigen die Grenzen des Corpus callosum. (D) Höhere Vergrößerung eines Immunfluoreszenz-Nachweis des GFP-Reporters in der V-SVZ Nähe oder striatum Grenze in einem Frontalschnitt durch das V-SVZ injiziert. Die gestrichelten Linien zeigen die Grenzen der V-SVZ. Man beachte, dass viele Zellen in der V-SVZ Nische infiziert sind. Ependymzellen als quaderförmige Zellen Begrenzung der Ventrikel Lumen erkannt werden. (E) Immunfluoreszenz für GFP (grün) und die Neuroblast Marker PSZ-NCAM (rot). Beachten Sie die Anwesenheit von doppelt positiven Zellen, welche die Erzeugung von Neuroblasten von NSCs, die vor 60 Tage infiziert waren. Weiße Pfeile zeigen auf Neuroblasten. Intarsien entsprechen der Region innerhalb der weißen Quadrat umschlossen. (F) Schematische Darstellung eines Frontalschnitt durch eine Halbkugel das Niveau der Injektion zeigt und die Position desdie Spritzennadel für Injektionen in den lateralen Ventrikel. (G) Schliffbild auf dem gleichen Niveau in der mit DAPI (in grau; links) gefärbt schematische gezeigt genommen und für die Immundetektion von GFP (grün, rechts) 15 Tage nach der Injektion. Die gestrichelten Linien zeigen die Grenzen des Corpus callosum. (H) Höhere Vergrößerung eines Immunfluoreszenz-Nachweis des GFP-Reporter in der Herzkammer in einem Frontalschnitt durch die V-SVZ injiziert. Die gestrichelten Linien zeigen die Grenzen der V-SVZ. Beachten Sie, dass nur Ependymzellen infiziert sind. (I - j) Immunfluoreszenz für GFP und die ependymal Zellmarker S100β. Beachten Sie die Anwesenheit von zahlreichen doppelt positiven Zellen entlang der dorsalen (i) und ventralen (j) V-SVZ. Arrowhead Stellen bei einem Astrozyten im Striatum Parenchym, auch mit S100β beschriftet. k. Frontalschnitt durch den OB mit DAPI gefärbt (grau; links) und Immundetektion von GFP (green; rechts) in der Region um das weiße Quadrat von 60 Tagen nach einer V-SVZ / striatum Injektion eingeschlossen. Beachten zahlreichen markierten Neuronen. (L) Frontalschnitt durch den OB mit DAPI gefärbt (grau; links) und Immundetektion von GFP (grün, rechts) Region eingeschlossen durch das weiße Quadrat von 45 Tagen nach einer lateralen Ventrikel Injektion. Beachten Sie, dass es keine OB Neuronen markiert. cx, Hirnrinde; lv, Seitenventrikel; str, Striatum; GL, glomerulären Schicht; GCL, Körnerzellschicht; MCL, Mitral-Zellschicht. Maßstabsbalken: c, g = 500 & mgr; m; d, e, hj = 10 & mgr; m; kl = 250 um; 100 um.

Abb. 3: Erwachsene NSCs wuchern mehr aktiv, wenn sie aus ihrer Nische ablösen (a) Konfokale Aufnahmen von Schnitten durch das V-SVZ von Mäusen, die Striatum-Injektionen von leeren LVs (oberes Feld) oder LVs Carr erhaltenying eine dominant-negative Cadherin-Konstrukt (unten), der NSC Marker GFAP (rot), die Zellzyklus-Marker Ki67 (cyan) und DAPI (blau) 60 Tage immun für den Nachweis des NS-Reporter GFP (grün), nach die Infektionen. Unabhängige Platten für jeden Marker angezeigt (grau, rechts). (B) Konfokale mikroskopische Aufnahmen von Schnitten durch die V-SVZ von Mäusen, die immungefärbt zur Detektion des Reporter GFP LV Injektionen von leeren LVs (oberes Feld) oder LVs Durchführung einer dominant-negativen Cadherin Konstrukt (unteres Feld) in den lateralen Ventrikel empfangenen (grün), die NSC Marker GFAP (rot), die Zellzyklus-Marker Ki67 (cyan) und DAPI (blau), 15 Tage nach der Infektion. Unabhängige Platten für jeden Marker angezeigt (grau, rechts). Weiße Pfeile zeigen auf GFAP / GFP doppelt positiven Zellen und weiße Pfeilspitzen weisen auf GFAP / Ki67 / GFP dreifach positiven Zellen, deren Kerne in beiden Fällen mit einem gelben Stern gekennzeichnet sind. Die quantitative Analyse mehr Radfahren NSCs angezeigt, wenn der N-cadHerin Spiegel wurden in den NSC selbst oder nur in Ependymzellen ¹⁵ verringert. Maßstab: 10 & mgr; m.

Discussion

LVs bieten wichtige Vorteile gegenüber anderen viralen Systemen für die genetische Veränderung von erwachsenen NSC ^16,18. Stereotaktische Lieferung von Lentiviren in die V-SVZ Nische stellt ein effizientes Verfahren zur Markierung und Spuren selten B1-NSC Aufteilen der Grenzen der anderen üblicherweise verwendeten Methoden wie BrdU zu überwinden, die nach mehreren Zellteilungen verdünnt wird, oder Retrovirus, das Zellen, die nur Ziel dass zum Zeitpunkt der Anwendung wuchern. LVs zusammen mit Adenoviren können Zellen unabhängig von ihrem Status cycling infizieren und dies ist besonders relevant für Zellen, die nicht Zyklus tun, wie Ependymzellen, oder sind relativ ruhig, und somit selten unterteilen, wie Erwachsenen NSC ^16,18. Die Transgene geworden stabil integriert und äußerte mit hohem Wirkungsgrad morphologischen Charakterisierung von transduzierten Zellen und deren Nachkommen zu ermöglichen.

NSCs werden in einem hochspezialisierten Nische mit benachbarten Zellen beherbergtenwie ependymal oder Gefäßzellen so wie auch ihre eigene Zelle Nachkommen eines stark regulierten Umgebung ² zu schaffen. Wie viele fötalen NSC liegen B1 Zellen neben der Herzkammer und der Ventrikel kontaktieren seiner Flüssigkeit durch kleine, apikale Prozesse, die in einem einzigen unbeweglichen primären cilium in der ventrikulären CSF ¹ (2a) eingetaucht enden. Diese detaillierte Organisation gezielt ausgenutzt werden, um Ependymzellen oder alle Zellen in der Nische durch die Kontrolle des viralen Titer und Liefergebiet auszurichten. Adherens und Tight Junctions im polarisierten Epithel wurden Eindringen von Fremdviren in Zellen und Geweben zu verhindern gezeigt, manchmal aufgrund der eingeschränkten Lage von Viruseintritt Rezeptoren (dh CAR-Rezeptoren) in den Knoten-Komplexe. Unterbrechung der interzellulären Adhäsion daher begünstigt eine Infektion durch verschiedene Viren, einschließlich der lentivirus (LV). Interessanterweise wurden LVs gezeigt junctional Komplexe zu unterbrechen, wenn verwendet,in hohen Konzentrationen in Lungenepithel ^20-23. Dies könnte früheren Berichten von Infektionen durch LVs B1-NSC erklären ²⁴ in den lateralen Ventrikel injiziert.

Da B1-NSCs Nachkommen produzieren, die nach vorne und nach dorsal, GFP-positiven Zellen wandern können auf allen Ebenen der RMS sowie im OB und Corpus callosum gefunden werden, wo sie unheilbar in Neuronen und Oligodendrozyten differenzieren sind. Aber wir verwenden, um die Reporter Ausdruck nicht Auswirkungen der genetischen Veränderung auf die Preise der Neurogenese oder oligodendrogenesis zu bestimmen. Einerseits ist der Balken in dem Weg des Nadelbahn und damit einige Zellen, die das Ergebnis einer direkten Infektion während des Einspritzvorgangs kann erscheinen gekennzeichnet. Auf der anderen Seite, da alle Typen von Zellen in der V-SVZ infiziert werden kann, ist es nicht möglich, ob die markierten Neuronen OB das Ergebnis einer genetischen Modifikation in den Zellen oder deren B1 prog zu unterscheidenEnitor Derivate. Im Falle von Versuchen, bei denen nur die Ependyms infiziert ist, B1-Zellen und deren Nachkommen nicht mit dem Reporter markiert und somit Neurogenese oder oligodendrogenesis nicht verfolgt werden kann. Jedoch kann ein Vorteil von BrdU Retentions nehmen B1-NSC abhängigen Neurogenese zu dem OB oder oligodendrogenesis zum Corpus callosum sowie die proliferative Aktivität von langsam teilenden NSC in dem V-SVZ der infizierten Mäusen zu analysieren. Beispielsweise können die Mäuse mit BrdU Protokolle ¹⁷ 10 Tage nach der Infektion mit den LVs folgende zuvor veröffentlicht eingespritzt und für 21 Tage zu überleben erlaubt. BrdU Detektion im OB / Corpus callosum kann dann verwendet werden, um die Rate der Neurogenese / oligodendrogenesis zu bestimmen, während BrdU Retention in der V-SVZ kann als eine Schätzung der Anzahl der aktivierten B1-Zellen ¹³ entnommen werden.

Das hier beschriebene Verfahren kann für die Expression von Genen von Interesse für gain-of-function ex verwendet werdenExperimente, kann aber auch für die Lieferung von Silencing-Konstrukte auf Basis von RNA-Interferenz oder zur Lieferung von Cre-Rekombinase verwendet werden konstruiert Keimbahn übertragen floxed Allele in den V-SVZ Zellen zu inaktivieren. Darüber hinaus könnte diese Technik auch für CRISPR-vermittelte Genom Bearbeitung eingesetzt werden, wenn die Injektion von Lentivirus einzigen Führungs RNAs in Kombination mit einem Cre-abhängige Rosa26 Cas9 knockin Maus ²⁵ verwendet wird.

Kritischer Schritt. 1: Lentivirus Herstellung und Manipulation In vivo Gentransfer-Anwendungen mit LVs in spezifischen Hirnregionen erfordern hohe Titer Zubereitungen Vektor, da nur sehr kleine Mengen ohne Beschädigung des Hirngewebes stereotaktisch injiziert werden kann. Lentivirale Präparate müssen, bevor aufgrund der Tatsache in das Gehirn Injektion gereinigt und effizient konzentriert werden, dass LVs in transienter Cotransfektion Systeme erzeugt werden. Die hier beschriebene Verfahrensweise ist Biosicherheitsstufe 2, also alle Verfahren, dass daserfordern die Manipulation von Viren in BSL2 Einrichtungen durchgeführt werden. Forschungspersonal muss in allen Verfahren angemessen qualifiziert und geschult werden. Darüber hinaus Operation muss von den örtlichen Behörden für den Tierschutz genehmigt durch voll ausgebildete Ermittler folgenden Routinen durchgeführt werden und sollte unter aseptischen Bedingungen mit ordnungsgemäß sterilisierten Instrumente in der biologischen Sicherheitsstufe 2-Gebiete durchgeführt werden. Angemessene präoperativen und postoperative Versorgung der Tiere müssen durchgeführt werden und in Übereinstimmung mit festgelegten veterinärmedizinischen und Pflegepraxis sein sollte. Genauer gesagt, müssen alle Vorsichtsmaßnahmen für das Tier, einschließlich Verabreichung von Anästhesie und Analgesie zugefügt, die Schmerzen und Stress zu minimieren. Jeder Schritt, um die Verwendung von Viren bei Tieren Beginn durch den institutionellen Behörden und durchgeführt in Übereinstimmung mit den örtlichen Vorschriften zugelassen werden. Persönliche Schutzausrüstung muss auch getragen werden, darunter ein Kleid, Doppelhandschuhe und geeignete Schutzbrille. FlosseVerbündeter, alle Werkzeuge und Oberflächen, die mit Viren in Kontakt gewesen sein muss gründlich nach den Desinfektions Praktiken genehmigt facility's dekontaminiert werden (indem sie mit 70% Ethanol Wischen, 10% Bleichmittel und / oder Autoklavieren).

Nach unserer Erfahrung ist die Calciumphosphat-Transfektion Verfahren eine sehr effiziente und billige Technik der DNA in 293T-Zellen einzuführen. Allerdings kommerzielle DNA-Transfektion Reagenzien können auch als pro Protokoll des Herstellers in diesem Schritt verwendet werden. Dieses Protokoll wird für die Sammlung des viralen Überstandes optimiert bei 30 Stunden nach dem Austausch der Medien 293T-Zellen. Lentivirale Überstand kann auch 24 und 48 gesammelt werden Stunden nach Medienwechsel. nach unserer Erfahrung erzeugt jedoch eine einzige Sammlung in 30 Stunden eine hohe Titer Lentivirusvektor.

Kritische Schritt 2: praktisches Beispiel für die Berechnung des Vektors Titer nach der Formel:% ^{GFP +} / 100 x Anzahl der Zellen infiziert x Verdünnungs faCtor (DF) = Wandlereinheiten (TU) / ml. In diesem Beispiel 5 x ^{10 4 Zellen} (293T) werden am Vortag ausgesät zur Transduktion ^{von 10 5} Zellen ermöglicht. Nach Erhalt Verwendung der% der transduzierten Zellen, wie in dem Protokoll beschrieben Durchflusszytometrie, zwei Werte von transduzierten Zellen werden für die Berechnungen gewählt, die von dem zu den Verdünnungen entsprechen, bei der Transduktion weder gesättigten noch zu niedrig ist. Zum Beispiel: Verdünnungsfaktor ^{10 -6} Ausbeute 8,08% der Zellen infiziert und Verdünnungsfaktor ^{10 -5} Ausbeute ein 61,78% Zellen infiziert. Der Titer ist der Durchschnitt der erbrachten Werte aus der Formel berechnet, die Werte der Zellen transduziert und der entsprechenden Verdünnungsfaktor verwendet. In diesem Beispiel:

Titer für den Verdünnungsfaktor ^{10 -6} = (8,08 / 100) x 100.000 x 10 ^{6 =} 8,08 · ^{10 9} TU / ml

Titer für den Verdünnungsfaktor ^{10 -5} = (61,78 / 100) x 100.000 x 10 ⁵= 6,178 · ^{10 9} TU / ml

Durchschnitt = [(8,08 + 6,178) / 2] · ^{10 9} = 7,1 · ^{10 9} TU / ml

Kritische Schritt 3: stereotaktische Injektion. Das hier beschriebene Verfahren beruht auf der Verwendung von geringen Mengen von hohen Titern von LVs stereotaktisch geführte Zuführung in bestimmten Orten. Die stereotaktischen Koordinaten in diesem Protokoll gegeben wurden C57 / BL6-Mäusen etabliert und kann für andere Mausstämme nicht geeignet sein. Stereotaktischen Koordinaten sollte für jeden Stamm und Alter mit einem Farbstoff wie Fast Green vor dem Experiment bestimmt werden. Dazu wird der Farbstoff injiziert und nachdem die Maus geopfert wird, wird das Gehirn entnommen und eingefroren für 1 hrat -20 ° C. Sobald das Gehirn ausgehärtet ist, kann es an der Stelle der Injektion mit einer Klinge geschnitten und unter einem Präpariermikroskop beobachtet, um festzustellen, ob die Injektionsstelle für bestimmte experimentelle Zwecke optimiert ist.

kritische Schritt4: Post-Überlebenszeiten. Post-Überlebenszeiten werden in Abhängigkeit von der Injektionsstelle unterschiedlich sein. Eine langfristige Überlebenszeit ermöglicht Hirngewebe von der Injektions Läsion und vor allem zu erholen, in der RMS und OB beobachtet Zellen nach 60 Tagen sind Derivate der relativen Ruhe B1-NSC. Injektionen in den lateralen Ventrikel nicht schaden physikalisch die V-SVZ. Daher ist eine 15-Tage-Frist genug Expression der Transgene durch Ependymzellen zu gewährleisten.

Kritische Schritt 5: Postfixierung Zeiten. Übermäßige Postfixierung des Hirngewebes kann Maskierung von bestimmten Antigenen, aufgrund der Vernetzungsaktivität der Reagenzien, wie Paraformaldehyd erzeugen. Dies sind gute Zellstruktur zu erhalten, sondern kann die Antigenität einiger Proteine ​​als Vernetzungs reduzieren Antikörper behindern an die Epitope binden. Antigen-Retrieval-Techniken erforderlich sein, insbesondere wenn es eine lange Fixierung Inkubationszeit oder wenn ein hoher Prozentsatz an Vernetzungs fixative verwendet. Alternativ kürzere Postfixierung von 1 h in ausreichendem Maße in unserer Erfahrung bewiesen die Struktur des Gewebes sowie die Gewährleistung einer guten Antigenität innerhalb der Zellen ohne den Einsatz von Antigen Abrufverfahren zu erhalten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	358126	25 mm x 89 mm
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326819	13 mm x 51 mm
Ultracentrifuge adapters	Beckman Coulter	358156
6-well plate	SPL	PLC-30006
24-well plate	SPL	PLC-30024
10 cm dish	SPL	PLC-20101	100 x 20 style
FACS tubes	Afora	DE400800	12 mm x 75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter	BD	340626	30 µm
Nitrocellulose filter	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm
Flow cytometer	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Steritop filter	Biofil	FPE-204-500	0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid	Addgene	#12251	Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid	Addgene	#12253	Core packaging plasmid
pMD2G plasmid	Addgene	#12259	Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid	Addgene	#12252	Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2x HBS			0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock solution at 100x, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10x.
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate	Life technologies	11360-039	Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Without calcium chloride and magnesium chloride, 10x, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1x PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	H9268	Powder. Prepare a 1,000x stock solution at 8 mg/ml in dHO
Paraformaldehyde EM grade 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument	NeuroLab, Leica	39463001	http://www.leicabiosystems.com/
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor	NeuroLab, Leica	39462950
Syringe holder	KD Scientific	KDS-311-CE
33 gauge syringe	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
Electric drill	Fine Science Tool	98096
Thermal blanket	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Comercial solution at 1 mg/ml.
Ketamine	Merial	Imalgene 500	Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture			Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topical skin adhesive
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11 cm x 21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Surgical marker pen	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant		SICCAFLUID	0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine	Betadine	694109.6	10% povidone-iodine
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Scalp vein set	Vygon V-green	70246.05T	25 G, 30 cm tube length
Vibratome	Leica	VT1000
Confocal microscope	Olympus	FluoView FV10i
Hot plate	Tehtnica	SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB)			0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution			0.9% NaCl in dH2O
Superglue	LOCTITE	767547
Sodium azide	Panreac	122712.1608
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normal goat serum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergent
Anti-GFP rabbit antibody	ROCKLAND	600-401-215	Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular probes	A-21206	Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mounting medium for fluorescent preparations