Introduction
Un condotto accesso vascolare funzionale è di vitale importanza per i pazienti con insufficienza renale che dipendono in emodialisi cronica per rimanere in vita. La costruzione di una fistola artero-venosa (AVF) è attualmente la scelta preferita per l'accesso vascolare. Tuttavia, le complicanze legate AVF costituiscono una delle principali cause di morbilità per i pazienti in emodialisi cronica. Nonostante i grandi sforzi scientifici, nessuno dei nuovi approcci per ridurre le complicazioni di accesso legate AVF ha comportato sostanziale miglioramento della AVF durata. Una parte di questo progresso deludente riferisce alla comprensione incompleta della fisiopatologia sottostante del fallimento accesso emodialisi.
Per svelare la fisiopatologia del fallimento accesso AV, i modelli animali che imitano da vicino patologia umana sono della massima importanza. A questo riguardo, non solo le specie animali, ma anche il sito anastomotico, la necessaria terapia anti-coagulatoria e la durata del follow-up dopo l'impulsory dovrebbe essere presa in considerazione 1. Mentre grandi animali sono i più adatti per studi di intervento finalizzati a sviluppare nuove strategie terapeutiche, modelli murini hanno il maggiore potenziale per ottenere un quadro più chiaro nei meccanismi molecolari alla base mancato accesso AV a causa della disponibilità di topi transgenici. Inoltre, un gran numero di topi può essere utilizzato per questo scopo a costi inferiori rispetto al grande uso animale.
Il primo modello murino di guasto AVF è stata descritta nel 2004 da Kwei e et al. 2 In questo modello, FAV sono stati costruiti utilizzando l'arteria carotide e la vena giugulare in modo end-to-end utilizzando un catetere intravascolare. Questo modello potrebbe essere utile per studiare l'adattamento venosa presto FAV sebbene la configurazione end-to-end e la presenza di un catetere intravascolare limitano la validità di questo modello per FAV umani. Un modello AVF migliorato è stato introdotto da Castier e et al. 3 in cui l'estremità dil'arteria carotidea è collegato al lato della vena giugulare. Tuttavia, FAV in pazienti in emodialisi sono solitamente costruiti anatomizza la fine di una vena al lato di un'arteria. La configurazione esatta del AVF è una caratteristica fondamentale di un modello di accesso AV poiché determina il profilo emodinamico nel condotto 4. Quest'ultimo è un importante contributo alla disfunzione endoteliale e successivo sviluppo di iperplasia intimale (IH) 5.
Un modello murino romanzo è stato recentemente sviluppato con una configurazione anatomica identica come è utilizzato nell'uomo 6. In questo modello, AVF vengono creati nella C57BL / 6 topi anastomosing la fine di un ramo della vena giugulare esterna al lato della carotide comune con punti staccati. In questo lavoro, grazie alla procedura microchirurgica di questo modello, al fine di facilitare l'uso diffuso di questo modello murino, mirata a dipanare il complesso fisiopatologiadi errore di accesso emodialisi.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla commissione per il benessere degli animali del Leiden University Medical Center.
1. Preparazione degli animali e Anestesia
- Anestetizzare il mouse (1-3 mesi) in un continuo camera di induzione anestetica pieno di 3-4% isoflurano.
- Shave lato ventrale del collo e la parte interna della coscia sinistra utilizzando un rasoio elettrico e utilizzare un pezzo di nastro per rimuovere i peli.
- Applicare una pomata oculare su entrambi gli occhi.
- Posizionare l'animale sulla coperta di riscaldamento sul quale è fissata la maschera di ventilazione naso. Fissare la testa alla maschera del naso con del nastro adesivo.
- Invia isoflurano ad una concentrazione di 1,5-2,0% utilizzando arricchita di ossigeno set aria alla seguente flusso d'aria 0,3 L / min, 100% di ossigeno 0,2 L / min. Pizzicare la pelle tra le dita per valutare la profondità dell'anestesia e regolare la concentrazione di isoflurano se necessario.
- Fissare l'animale altermocoperta con nastro adesivo su tutti gli arti che è impostato a circa 37 ° C in posizione supina.
- Iniettare buprenorfina disciolto in cloruro di sodio (NaCl) 0,9% alla dose di 0,1 mg / kg insieme con 0,5 ml di soluzione sterile di NaCl allo 0,9% per via sottocutanea nel fianco dell'animale.
- Applicare clorexidina tintura 0,5% per la zona preparata.
Incisione 2. Pelle
- Posizionare l'animale sotto il microscopio con la testa verso il chirurgo.
- Effettuare una incisione longitudinale di circa 1,5 cm la linea mediana del collo ventrale utilizzando un micro forbice.
- Afferra le ghiandole salivari con una pinza e spostare il diritto ghiandola salivare cranialmente fino a quando è in parte al di fuori della ferita.
3. dissezione e preparazione del Vein
- Identificare e senza mezzi termini sezionare il ramo dorsomediale del diritto vena giugulare esterna completamente dal suo tessuto perivascolare diffondendo solo unlongside e nella direzione del vaso sanguigno.
- Posizionare un ciclo (10.0 di sutura) intorno alla vena sezionato e applicare un nodo senza bloccarlo.
4. Rimozione del muscolo sternocleidomastoideo
- Utilizzando pinze, senza mezzi termini sezionare il muscolo sternocleidomastoideo destro dal suo ambiente, diffondendo lungo il confine. Mettere un paio di pinze aperte sotto il muscolo isolata e legare lo prossimale e distale con una sutura 6.0. Successivamente, accise il muscolo utilizzando un cauterizer.
5. dissezione e preparazione del carotide comune
- Identificare e sezionare il diritto arteria carotide comune con pinze. Inserire un filo 6.0 sutura intorno all'arteria per aiutare nella manipolazione dell'arteria.
- Applicare pinze vascolari come distalmente e prossimalmente possibile.
- Effettuare una incisione longitudinale nel mezzo dell'arteria di 1 mm circa utilizzando micro forbice specializzata.
- Sciacquare ilarteria con una soluzione di eparina [100 UI / ml] finché l'imbarcazione non chiara di sangue.
- Misurare e regolare la lunghezza dell'incisione se necessario in base alla larghezza del morsetto vascolare [1.1 mm].
6. legatura della vena
- Applicare una pinza vascolare prossimale della vena già preparato e mettere un filo di sutura intorno alla vena.
- Applicare leggera trazione caudale alla vena con un emostatico che viene immesso sul filo di sutura e legare la vena come distalmente possibile utilizzando il 10.0 di sutura che è stato posto in precedenza.
- Tagliare la vena con una forbice appena prossimale alla legatura.
- Utilizzando pinze vascolari, aprire delicatamente il lume della vena e sciacquare con una soluzione di eparina [100 UI / ml].
7. Creazione di anastomosi Parte 1
- Collegare la vena per l'arteria con una sutura interrotta (10,0) con 2 nodi quadrati in posizione ore dodici seguita da una sutura a sei o 'posizione di orologio. Assicurarsi di collegare la vena all'arteria senza farlo ruotare attorno al proprio asse. Ruotare l'animale al fine di migliorare l'esposizione chirurgica.
- Posizionare un filo di sutura intorno alla vena e applicare la trazione laterale dolce con un emostatico.
- Utilizzando gli stessi punti staccati, completare l'anastomosi mettendo circa 3-4 suture supplementari su lato ventrale visibile della anastomosi.
8. somministrazione di eparina
- Ruotare riscaldamento coperta di 180 ° e mettere a fuoco il microscopio sulla gamba in alto a sinistra.
- Identificare il femorale fascio vena / arteria / nervo con la ricerca di una struttura vascolare che corre longitudinalmente nella parte mediale della coscia e può essere visto attraverso la pelle. Fare un'incisione con il micro forbice di circa 1 cm direttamente sopra la vena femorale in modo longitudinale.
- sezionare con cura il tessuto perivascolare di vena femorale e iniettare eparina a dosi of 0.2 UI / g di peso corporeo nella vena femorale.
9. Creazione di anastomosi Parte 2
- Ritorna alla zona del collo e rimuovere il filo di sutura che è stato messo intorno alla vena.
- Collocare un filo di sutura (6.0) che passa successivamente sotto l'arteria carotide, sopra la vena e ancora sotto l'arteria carotidea. (Figura 1L)
- Rimuovere la fascetta vascolare venosa.
- Successivamente, ruotare il mezzo completato fistola artero 180 ° lungo l'asse della carotide in senso orario ruotando contemporaneamente entrambe le pinze vascolari e applicare la trazione mediale alle estremità del filo di sutura.
- Completa l'anastomosi nello stesso modo come descritto nel passaggio 7.2.
Rimozione 10. vascolare morsetto
- Rimuovere il filo di sutura e ruotare il vascolare morsetti di 180 ° in senso antiorario.
- Rimuovere il morsetto vascolare distale seguita dalla pinza vascolare prossimale. <li> Valutare la pervietà delle anastomosi occludendo delicatamente il tratto di efflusso venoso con le pinze vascolari. In caso di anastomosi di brevetto, la sezione venosa pre-occlusivo si espanderà in modo pulsatile. Riposizionare il diritto ghiandola salivare alla sua posizione usando anatomiche pinze originali.
11. Pelle Chiusura e postoperatoria cura
- Chiudere la pelle della gamba superiore con una sutura ininterrotta (6.0).
- Chiudere la pelle del collo con una sutura ininterrotta (6.0).
- Rimuovere l'animale dalla coperta di riscaldamento e iniettare 0,5 ml di NaCl allo 0,9% per via sottocutanea.
- Posto l'animale in una gabbia buia che viene riscaldata con una lampada di riscaldamento e lasciate riprendersi completamente. Quando un animale non riprendersi completamente, assicurarsi che non soffre di uno shock emodinamico a causa di sanguinamento nella zona chirurgica. Cercare segni come un collo gonfio e la fuoriuscita di sangue.
- Dopo circa 6 ore dopo la prima iniezione di buprenorphine, iniettare una dose singola di una formulazione a rilascio prolungato di buprenorfina per via sottocutanea in una dose che è raccomandato dal costruttore, al fine di fornire un'adeguata analgesia per un ulteriore 72 hr.
12. Tessuto raccolta
- Anestetizzare l'animale con un anestetico miscela contenente midazolam (5 mg / kg), medetomidina (0,5 mg / kg) e fentanyl (0,05 mg / kg) somministrato per via intraperitoneale.
- Fissare l'animale in posizione supina con l'inserimento di aghi attraverso le zampe e le guance in una stuoia di silicio non riscaldata.
- Fare un'incisione di circa 1,5-2,0 centimetri sopra la cicatrice al collo con il micro forbice.
- Sezionare il AVF, e inserire fili di sutura (6,0) in tutto il proximal-, arteria distale e del tratto di efflusso venoso per una facile identificazione.
- Valutare la pervietà del AVF come descritto nel paragrafo 10.3 del protocollo.
- Aprire la cavità peritoneale eseguendo una laparotomia mediale ucantare la micro forbice.
- Tagliare la gabbia toracica ventrale destra e sinistra con un paio di forbici a partire caudalmente nella linea medioclavicolare. Utilizzando un micro forbice, transetto il diaframma che è collegato alla parte centrale della gabbia toracica ventrale e successivamente spostare questa sezione craniale con pinze.
- Individuare la vena cava inferiore e transetto con un micro forbice.
- Inserire un ago calibro 23 ago nel ventricolo sinistro e profumato con PBS ad una pressione di circa 100 mmHg finché il fluido intravasale praticamente limpida.
- Senza rimuovere l'ago, ormai profumato con formalina 4% per 10 min ad una pressione di circa 100 mmHg.
- Accise L'AVF da sezionare sia le arterie e le vene con il micro forbice e immergerlo in una soluzione di formalina O / N 4%.
13. Tessuto di rivestimento e di sezionamento
- Elaborare il tessuto di paraffina secondo le protoco della produzionel. Il protocollo applicato si analizzano come segue:
- Immergere in etanolo 70% per 1 ora a RT. Ripetere 2x.
- Immergere in etanolo 96% per 1 ora a RT. Ripetere 2x.
- Immergere in etanolo 99,5% per 1 ora a RT. Ripetere una volta.
- Immergere in etanolo 99,5% per 1,5 ore a temperatura ambiente.
- Immergere in xilene 100% per 1 ora a RT. Ripetere una volta.
- Immergere in Parafin per 1 ora a 62 ° C. Ripetere 2x.
- Incorpora l'AVF in paraffina in modo che il tratto di efflusso venoso è orientato perpendicolarmente alla cassetta incorporamento.
- Utilizzando un microtomo, creare 12 sezioni seriali ognuno composto da 30 sezioni con spessore 5 micron. Poi di ogni sezione seriale, posizionare una sezione su un solo bicchiere di montaggio a partire dalla posizione uno fino a dodici in modo ordinato a partire dalla zona più vicina al anastomosi.
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Representative Results
Dopo la creazione della anastomosi (figura 1), la pervietà deve essere valutata a breve occludendo il tratto di efflusso venoso con una pinza vascolare. Quando l'anastomosi è brevetto, il prossimale tratto vascolare all'occlusione dovrebbe chiaramente espandere in modo pulsatile. Inoltre, la pervietà è confermata mediante fluoroscopia vicino infrarosso (NIRF) che funziona efficacemente come angiografia (Figura 2). Un errore nella procedura chirurgica può portare ad una occlusione del anastomosi come illustrato nella (Figura 2). Questo errore può essere causato da un troppo ristretta zona anastomotica, torsione delle navi, dose di eparina inadeguata o un sutura accidentali che collega il lato anteriore della anastomosi sul lato posteriore.
A livello istologico, il processo di rimodellamento vascolare AVF può essere indagato elegantemente utilizzando questo modello. rimodellamento vascolare in AVF si verifica come risultato dellaaumento del flusso sanguigno e della pressione. Nei topi, questa risposta è caratterizzata da un aumento della circonferenza (ad esempio, rimodellamento esterno) portando ad un aumento dell'area luminale nelle prime 2 settimane dopo l'intervento. Dopo queste 2 settimane, l'area luminale diminuisce progressivamente a causa di un arresto nel rimodellamento verso l'esterno e l'ispessimento corso della tunica intima. La formazione di queste lesioni stenotiche progressivi provoca occlusione del 50% di AVF a 4 settimane dopo l'intervento chirurgico. Pertanto, il punto di tempo ottimale di raccolta delle FAV sarebbe a 2 settimane dopo l'intervento, poiché in questa fase, una corretta analisi della risposta vascolare nel brevetto AVF è ancora fattibile. Immunostaining del tratto di efflusso venoso a 2 settimane dopo l'intervento dimostra che il compartimento cellulare dell'intima consiste principalmente di actina alfa del muscolo liscio (α-SMA) cellule positive (figura 3), come osservato in FAV umani falliti nonché 7.
In considerazione della complessità della procedimento microchirurgico, è realistico conti con guasto tecnico del procedimento in una proporzione dei topi. Nelle nostre mani, il tasso di successo della procedura è stata del 67% in principio. Tuttavia, con la formazione continua questo tasso è stato aumentato fino al 97%. La causa principale di fallimento era emorragia (60%), seguita da trombosi acuta (27%) e anesthesia- decesso legato (13%). Dopo formazione sufficiente, la procedura chirurgica può essere eseguita in circa 1 ora.
Figura 1. schema dettagliato di intervento chirurgico (A - T). Passaggi chiave per la creazione di successo di un AVF. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2. immagini macroscopiche di brevetti e FAV occlusi. (A) Un AVF brevetto con un morsetto vascolare sul distale dell'arteria carotide comune. (B) Un occluso AVF. (Bianco freccia) indica la direzione del flusso del sangue. (C) Un AVF brevetto dimostrata utilizzando vicino infrarosso fluoroscopia. (Freccia rossa) indica arteria. (freccia blu) indica tratto deflusso venoso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. colorazioni istologiche del tratto di efflusso venoso del AVF al giorno 14 rispetto ai vasi di controllo non operati (A - B). Panoramica morfologica con ematossilina, Floxina e Saffron che mostra un netto aumento della circonferenza nave e iperplasia intimale sviluppo 14 giorni dopo la creazione AVF. (C - D) colorazione immunoistochimica che dimostra che la maggior parte delle cellule presenti l'iperplasia intimale sono alfa actina muscolo liscio positivo. (L) Lumen; (IH) iperplasia intimale; barra della scala:. 200 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'AVF è considerato come il tallone d'Achille 'nel trattamento di emodialisi. Purtroppo, l'AVF soffre ancora da un elevato numero di guasti 8-10. Nonostante le ampie ricerche sui meccanismi sottostanti, la fisiopatologia esatta non è nota. Numerosi modelli murini per la mancata AVF sono già stati descritti in letteratura 2,3,11,12. Tuttavia, nessuno di questi modelli incorporano una estremità venosa alla configurazione anastomosi lato arterioso che è più utilizzato nella situazione clinica. Questo è molto importante in quanto il profilo emodinamico risultante ha un ruolo importante nel rimodellamento vascolare. Inoltre, alcuni dei modelli utilizzati un bracciale sintetico per il collegamento tra l'arteria e vena 2,11, che non viene utilizzato in ambito clinico.
Per migliorare la rilevanza clinica, abbiamo quindi sviluppato un modello murino in cui è stato creato un fine venoso unilaterale di anastomosi lato arteriosa tra un ramo del jugular vena e arteria carotide comune con punti staccati 6. In questo modello cruciali cambiamenti istomorfologici sono stati osservati tra cui l'esterno rimodellamento e iperplasia intimale progressiva, in ultima analisi, che porta al fallimento AVF.
Un aspetto fondamentale della procedura chirurgica è il protocollo di anestesia. Si raccomanda di utilizzare isoflurano anestesia per inalazione, in quanto questo è un metodo sicuro e facile per ottenere periodi di anestesia prolungati. Quest'ultimo è particolarmente importante per la fase di formazione in cui l'intera procedura può richiedere fino a 3 ore.
Per creare il necessario per la vena traslazione deflusso della fistola artero-venosa, muscolo sternocleidomastoideo ipsilaterale deve essere asportato.
Riguardo al trattamento recipiente durante l'intervento chirurgico, la dissezione dei vasi deve essere eseguita in modo smussato con pinze. L'uso del forcipe dritto vascolari specializzati sono recommended per la gestione diretta e la manipolazione dei vasi in quanto forniscono una maggiore precisione e producono meno danni meccanici dovuti alla punta arrotondata. L'uso di fili di sutura come loop vaso combinate con una pinza emostatica può aiutare nella gestione dei tessuti sicura ed inoltre, nel presentare il tessuto in modo ottimale quando viene utilizzato come una terza parte che è cruciale per cui questa procedura può essere eseguita senza alcuna assistenza diretta.
Senza dubbio, il passo più difficile della procedura sono i tirocini di sutura tra l'arteria e vena. Bisogna fare attenzione a non suturare la -side "indietro" del anastomosi con il -side "fronte", in quanto questo porterà ad restringimento della anastomosi che può portare al fallimento precoce della AVF. Per evitare che ciò accada, posizionare la punta della pinza vascolari tra le due pareti del recipiente in modo da separarli. La difficoltà tecnica può essere considerata una limitazione di questo modello. Tuttavia, non pensiamo °a questa procedura è più impegnativo rispetto al modello che è attualmente più utilizzato 3,6.
E 'difficile fare una considerazione generale sulla dimensione del campione per gli studi futuri, come la dimensione del campione calcolato non dipende solo dalla variabilità tra gli animali, ma anche sulla' forza 'dell'intervento. Stimiamo che una dimensione di gruppo di circa 10 topi (esclusi i topi che abbandonano lo studio a causa di un guasto tecnico del AVF) dovrebbe essere sufficiente per gli studi che si concentrano sul ruolo di un gene specifico in un fallimento AVF. Di recente, siamo stati in grado di ottenere risultati significativi con una dimensione media gruppo di 10 animali in uno studio sul ruolo di elastina nella murino AVF rimodellamento 13.
Un aspetto del nostro modello murino richiede ulteriori discussioni. E 'noto che l'ambiente uremico in pazienti con malattia renale allo stadio terminale contribuisce ad una moltitudine di malattie vascolari tra cui venosa hyperplasi intimaleun anche prima di un intervento chirurgico accesso emodialisi 14-16. Questo modello attuale non incorpora l'ambiente uremica. Pertanto, l'incorporazione di un modello di insufficienza renale cronica 17 sarebbe un passo additivo utile per migliorare ulteriormente la validità di questo modello murino.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microsocpe | Leica | M80 | |
| Forceps | Medicon | 07.61.25 | |
| Vascular forceps | S&T | JFL-3D.2 | |
| Vascular forceps | S&T | D-5a.2 | |
| Forceps | Roboz | SS/45 | |
| Micro scissor 5 mm blade | Fine science tools | 15000-08 | |
| Micro scissor 2 mm blade | Fine science tools | 15000-03 | |
| Scissor | Medicon | 05.12.21 | |
| Clip applier 1 | S&T | CAF-4 | |
| Vascular clamp 1 | S&T | B-1V | |
| Clip applier 2 | BBraun | FE572K | |
| Vascular clamp 2 | BBraun | FE740K | |
| Hemostatic forceps | BBraun | BH110 | |
| 10.0 sutures | BBraun | G1117041 | |
| 6.0 sutures | BBraun | 768464 | |
| Cauterizer | Fine science tools | 18010-00 | |
| Needle holder | Medicon | 11.82.18 | |
| Ocular ointment | Pharmachemie | 41821101 | |
| Chlorhexidine tincture 0,5% | Leiden University Medical Center | NA | |
| Heparin | Leo Pharma | 012866-08 | |
| Buprenorphin | RB Pharmaceuticals | 283732 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45,112,110 | |
| Anesthesia mask | Maastricht university | custom made | |
| Midazolam | Actavis | AAAC6877 | |
| Dexmedetomidine | Orion | 141-267 | |
| Fentanyl | Bipharma | 15923002 | |
| Continuous anaesthetic induction chamber | Vet-tech solutions | AN010R |
References
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