Introduction
En funktionell vaskulär tillgång ledningen är av avgörande betydelse för patienter med njursvikt som beror på kronisk hemodialys för att överleva. Byggandet av en arteriovenös fistel (AVF) är för närvarande det bästa valet för vaskulär access. Men AVF komplikationer utgör en viktig orsak till sjuklighet för patienter på kronisk hemodialys. Trots omfattande vetenskapliga insatser, ingen av de nya metoder för att minska AVF åtkomstrelaterade komplikationer resulterade i en avsevärd förbättring av AVF hållbarhet. En del av denna nedslående utveckling avser ofullständig förståelse av den underliggande patofysiologin av hemodialys tillgång misslyckande.
Att riva upp patofysiologi AV tillgång misslyckande, djurmodeller som nära efterliknar människans patologi är av yttersta vikt. I detta avseende, inte bara de djurarter utan också anastomistället, det krävs anti-koagulativa terapi och varaktigheten av uppföljningen efter uppsvingry bör beaktas en. Medan stora djur är den mest lämpliga för interventionsstudier som syftar till att utveckla nya behandlingsstrategier, musmodeller har störst potential att vinna mer insikt i de molekylära mekanismerna bakom AV tillgång misslyckande beror på tillgången av transgena möss. Dessutom kan ett stort antal möss användas för detta ändamål till lägre kostnader jämfört med större djur.
Den första musmodell av AVF fel beskrevs 2004 av Kwei och et al. 2 I denna modell var AVFs konstrueras med hjälp av halspulsådern och halsvenen i en end-to-end sätt med hjälp av en intravaskulär kateter. Denna modell kan vara användbart för att studera tidig venös anpassning i AVFs trots att end-to-end konfiguration och närvaron av en intravaskulär kateter begränsa giltigheten av denna modell för mänskliga AVFs. En förbättrad AVF modell introducerades av Castier och et al. 3 i vilken änden avkarotidartären är ansluten till sidan av jugularvenen. Emellertid är AVFs i hemodialyspatienter vanligtvis konstruerad genom anatomizing i slutet av en ven till sidan av en artär. Den exakta utformningen av AVF är en viktig egenskap hos en AV tillgång modell eftersom det bestämmer hemodynamiska profil inom ledningen 4. Det sistnämnda är en viktig bidragsgivare till endoteldysfunktion och efterföljande utveckling av intimal hyperplasi (IH) 5.
En ny musmodell utvecklades nyligen med en identisk anatomisk konfiguration som används i människor 6. I denna modell är AVF skapas i C57BL / 6 möss genom anastomosering i slutet av en gren av den yttre halsvenen vid sidan av den gemensamma halsartären med avbrutna suturer. I föreliggande dokument fokuserar vi på mikro förfarande av denna modell för att underlätta den utbredda användningen av denna musmodell, som syftar till att riva upp komplexa patofysiologiav hemodialys tillgång misslyckande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment har godkänts av kommittén för djurs välbefinnande Leiden University Medical Center.
1. Animaliska Förberedelser och anestesi
- Söva musen (1-3 månader gamla) i en kontinuerlig anestesiinduktionskammare fylld med 3-4% isofluran.
- Raka den ventrala sidan av halsen och insidan delen av den vänstra övre benet med användning av en elektrisk rakhyvel och använder en bit tejp för att ta bort hår.
- Applicera okulär salva på båda ögonen.
- Placera djuret på värmefilt på vilken näsan andningsmasken är fast. Fixera huvudet till näsmask med tejp.
- Leverera isofluran vid en koncentration av 1,5-2,0% med syreberikad luft inställd på följande flödes: luft 0,3 L / min, 100% syre 0,2 L / min. Nyp ihop huden mellan tårna för att bedöma djupet av anestesi och justera koncentrationen av isofluran vid behov.
- Fixera djuret tillvärmefilt med självhäftande tejp på alla lemmar som är satt vid ungefär 37 ° C i ryggläge.
- Injicera buprenorfin löst i natriumklorid (NaCl) 0,9% vid en dosering av 0,1 mg / kg tillsammans med 0,5 ml steril NaCl 0,9% subkutant i flanken hos djuret.
- Applicera klorhexidin tinktur 0,5% till den preparerade ytan.
2. hudsnitt
- Placera djuret under mikroskop med dess huvud mot kirurgen.
- Gör en längsgående snitt på ca 1,5 cm i mittlinjen av den ventrala hals med hjälp av en mikro sax.
- Ta spottkörtlarna med pincett och förskjuta den högra spottkörtel cranially tills den är delvis utanför såret.
3. Analysera och Förbereda Vein
- Identifiera och rakt på sak dissekera dorsomediala gren av den högra yttre halsvenen helt från sin perivaskulär vävnad genom att sprida bara enlångsida och i riktning av blodkärlet.
- Placera en slinga (10,0 sutur) runt dissekerade ven och tillämpa en knut utan att låsa den.
4. Ta sternocleidomastoideus
- Använd pincett, rakt på sak dissekera den högra sternocleidomastoideus från omgivningen genom att sprida längs gränsen. Placera ett par öppna pincett under isolerade muskler och ligera det proximalt och distalt med en 6,0 sutur. Därefter skära muskeln med hjälp av en cauterizer.
5. Analysera och Förbereda gemensamma halsartären
- Identifiera och dissekera den högra gemensamma halspulsådern med pincett. Placera en 6,0 suturtråd runt artären för att underlätta manipulering av artären.
- Applicera kärlklämmor som distalt och proximalt som möjligt.
- Göra ett längsgående snitt i mitten av den artär på ca 1 mm med hjälp av specialiserade mikro sax.
- Sköljartär med en heparinlösning [100 lU / ml] till dess att fartyget är fritt från blod.
- Mäta och justera längden av snittet om så är nödvändigt för att matcha bredden den vaskulära klämman [1,1 mm].
6. Ligering av Vein
- Applicera en vaskulär klämma proximalt av redan förberett ven och placera en suturtråd runt venen.
- Applicera mild caudal dragkraft venen med hjälp av en hemostat som placeras på suturtråden och ligera venen så distalt som möjligt genom att använda 10,0 sutur som placerades tidigare.
- Skär venen med hjälp av en sax precis proximalt till ligering.
- Med hjälp av vaskulära pincett, försiktigt öppna lumen av venen och skölj den med en heparinlösning [100 IU / ml].
7. Skapande av anastomos Del 1
- Anslut venen till artären med en avbruten sutur (10,0) med 2 fyrkantiga knop vid klockan tolv positionen följt av en sutur vid sex oklocka läge. Se till att ansluta venen till artären utan gör det möjligt att rotera runt sin egen axel. Rotera djuret i syfte att förbättra den kirurgiska exponering.
- Placera en suturtråd runt venen och tillämpa mild lateral dragning med hjälp av en hemostat.
- Genom att använda samma avbrutna suturer, fyll anastomosen genom att placera cirka 3-4 ytterligare suturer på den synliga ventrala sidan av anastomos.
8. Heparin Administration
- Vrid värmefilt 180 ° och fokusera mikroskopet på övre vänstra benet.
- Identifiera lårbensvenen / artär / nervknippe genom att leta efter en kärlstruktur som löper i längdriktningen i den mediala delen av låret och kan ses genom huden. Gör ett snitt med mikro sax av ungefär 1 cm direkt ovanför den femorala venen i en längd sätt.
- dissekera noggrant perivaskulär vävnad lårbensvenen och injicera heparin vid en dos of 0,2 IU / g kroppsvikt i lårbensvenen.
9. Skapande av anastomos del 2
- Återgå till nackområdet och avlägsna suturtråden som placerades runt venen.
- Placera en suturtråd (6,0), som därefter passerar under karotidartären, över venen och igen nedanför halspulsådern. (Figur 1 liter)
- Ta bort den venösa kärlklämman.
- Nästa, vrid halv avslutade arteriovenös fistel 180 ° utmed axellinjen för karotidartären medurs genom samtidig vridning båda de vaskulära klämmorna och tillämpa mediala dragkraft på ändarna av suturen tråden.
- Fullborda anastomosen på samma sätt som beskrivs i steg 7,2.
10. Kärlkläm Removal
- Ta bort suturtråden och rotera vaskulära klämmor 180 ° moturs.
- Ta bort den distala vaskulära klämman följt av den proximala vaskulära klämman. <li> Utvärdera öppenheten hos anastomosen genom att försiktigt tillsluta den venösa utflöde med kärl pincett. I händelse av ett patent anastomos kommer den pre-tilltäppande venösa sektionen expandera på ett pulserande sätt. Flytta rätt spottkörteln det ursprungliga anatomiska position med hjälp av pincett.
11. Hud Stängning och postoperativ vård
- Stänga huden på låret med en oavbruten sutur (6,0).
- Stänga huden på halsen med en oavbruten sutur (6,0).
- Ta bort djuret från värmefilten och injicera 0,5 ml NaCl 0,9% subkutant.
- Placera djuret i ett mörklagt bur som värms med en värmelampa och låt den återhämta sig helt. När ett djur inte återhämta sig helt, se till att det inte lider av en hemodynamisk chock på grund av blödning i operationsområdet. Leta efter tecken, såsom en svullen hals och läckage av blod.
- Efter ca 6 h efter den första injektionen av buprenorphine, injicera en enda dos av en depotberedning av buprenorfin subkutant i en dos som rekommenderas av tillverkaren, för att ge adekvat analgesi under ytterligare 72 timmar.
12. Tissue Skörd
- Söva djuret med ett bedövningsmedel-blandning innehållande midazolam (5 mg / kg), medetomidin (0,5 mg / kg) och fentanyl (0,05 mg / kg) administrerades intraperitonealt.
- Fixera djuret i ryggläge genom att föra in nålar genom sina tassar och kinder i en icke-uppvärmd silikonmatta.
- Gör ett snitt på cirka 1,5-2,0 cm över ärret i nacken med mikro sax.
- Dissekera AVF, och placera suturtrådar (6,0) runt proximal-, distala artären och venösa utflöde för enkel identifiering.
- Utvärdera öppenheten hos AVF som beskrivs i avsnitt 10.3 i protokollet.
- Öppna bukhålan genom att utföra en medial laparotomi usjunga mikro sax.
- Skär igenom den vänstra och högra ventrala bröstkorg med hjälp av en sax börjar kaudalt i medioklavikularlinjen. Med användning av en mikro sax, transekt membranet som är fäst vid den mellersta delen av den ventrala bröstkorgen och därefter förskjuta detta avsnitt kranialt med användning av pincett.
- Leta sämre cava ven och transekt den med en mikro sax.
- För in en nål 23 gauge nål i den vänstra ventrikeln och BEGJUTA med PBS vid ett tryck av cirka 100 mmHg tills intravasal vätskan är nästan helt klart.
- Utan att ta bort nålen, nu BEGJUTA med 4% formalin under 10 minuter vid ett tryck på ungefär 100 mmHg.
- Skära ut AVF genom transecting både artärer och ven med mikro sax och dränka den i en 4% formalinlösning O / N.
13. Tissue Bädda och Sektione
- Behandla vävnaden som paraffin enligt tillverkarens s protocol. Protokollet som tillämpas bestod av följande:
- Fördjupa sig i Etanol 70% under 1 h vid RT. Upprepa 2x.
- Fördjupa sig i Etanol 96% under 1 h vid RT. Upprepa 2x.
- Fördjupa sig i Etanol 99,5% under 1 h vid RT. Upprepa en gång.
- Fördjupa sig i Etanol 99,5% i 1,5 h vid RT.
- Sänk ned i xylen 100% under 1 h vid RT. Upprepa en gång.
- Fördjupa sig i Parafin under 1 timme vid 62 ° C. Upprepa 2x.
- Bädda in AVF i paraffin, så att det venösa utflöde är orienterad vinkelrätt mot inbäddning kassett.
- Med hjälp av en mikrotom, skapa 12 seriesnitt vardera bestående av 30 sektioner med en 5 pm tjocklek. Sen varje seriell avsnitt placera en sektion på en enda monterings glas utgående från ställning ett upp till tolv på ett ordnat sätt som börjar med området närmast anastomosen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter skapandet av anastomos (Figur 1), bör öppenheten bedömas av kort täppa venösa utflöde med en kärl pincett. När anastomosen är patent, bör kärlvägarna proximal till ocklusion tydligt expandera på ett pulserande sätt. Dessutom är öppenheten bekräftas genom användning av nära infraröd fluoroskopi (NIRF) som fungerar effektivt som ett angiografi (Figur 2). Ett fel i det kirurgiska förfarandet kan leda till en tilltäppning av anastomosen som avbildas i (figur 2). Detta misslyckande kan orsakas av en alltför snäv anastomos område, vridning av fartygen, otillräcklig heparindosen eller en oavsiktlig sutur placering som förbinder framsidan av anastomos på baksidan.
Vid en histologisk nivå, kan processen av vaskulär remodellering i AVF undersökas elegant med hjälp av denna modell. Vaskulär remodellering i AVF sker som ett resultat avökning av blodflödet och tryck. Hos möss är denna reaktion som kännetecknas av en ökning i omkrets (t.ex., passiv remodeling) som leder till en ökning av luminala område i de första 2 veckorna efter operationen. Efter dessa 2 veckor, den luminala området minskar gradvis på grund av ett stopp i den yttre ombyggnad och pågående förtjockning av tunica intima. Bildningen av dessa progressiva stenotiska lesioner resulterar i tilltäppning av 50% av AVF på 4 veckor efter operationen. Därför skulle den optimala tidpunkten för att skörda AVFs vara 2 veckor efter operationen, eftersom det i detta skede, är fortfarande möjligt ordentlig analys av den vaskulära responsen i patent AVF. Immunfärgning av det venösa utflödesområdet vid 2 veckor efter operationen visar att den cellulära fack i intiman består huvudsakligen av alfa-aktin i glatt muskulatur (α-SMA) positiva celler (Figur 3), såsom observerats i misslyckade humana AVFs samt 7.
Med tanke på komplexiteten i mikro förfarande, är det realistiskt att räkna med tekniskt fel i förfarandet i en del av mössen. I våra händer, andelen framgångsrika förfarandet var 67% i början. Men med vidareutbildning detta höjdes upp till 97%. Den främsta orsaken till misslyckandet var blödning (60%), följt av akut trombos (27%) och anesthesia- relaterade dödsfall (13%). Efter tillräcklig träning, kan det kirurgiska ingreppet utföras på cirka en timme.
Figur 1. Detaljerad system av kirurgiskt ingrepp (A - T). Viktiga steg för framgångsrik skapa en AVF. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
re 2 "src =" / filer / ftp_upload / 53294 / 53294fig2.jpg "/>
Figur 2. Makroskopiska bilder av patent och ockluderade AVFs. (A) Ett patent AVF med en vaskulär klämma på den distala gemensamma halspulsådern. (B) En tilltäppt AVF. (Vit pil) anger riktningen för blodflödet. (C) Ett patent AVF demonstreras med användning av nära infraröd genomlysning. (Röd pil) indikerar artär. (blå pil) visar venösa utflöde. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Histologiska färgningar av venösa utflöde från AVF vid dag 14 jämfört med oanvänd kontrollfartyg (A - B). Morfologisk Översikt Använda hematoxylin, phloxin och saffron visar en tydlig ökning i kärlet omkrets och intimal hyperplasi utveckling 14 dagar efter AVF skapelse. (C - D) Immunohistokemisk färgning som visar att majoriteten av cellerna presentera den intimala hyperplasi är alfa glattmuskelaktin positiva. (L) Lumen; (IH) intimal hyperplasi; skala bar. 200 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den AVF anses vara akilleshälen i hemodialysbehandling. Tyvärr AVF fortfarande lider ett stort antal fel 8-10. Trots omfattande forskning om de bakomliggande mekanismerna, den exakta patofysiologi fortfarande okänd. Ett stort antal musmodeller för AVF fel har redan beskrivits i litteraturen 2,3,11,12. Men ingen av dessa modeller innehåller en venös slut på arteriell sida anastomos konfiguration som används mest i den kliniska situationen. Detta är mycket relevant eftersom den resulterande hemodynamiska profil spelar en viktig roll vid vaskulär remodellering. Dessutom är vissa av de modeller som används en syntetisk manschett för anslutningen mellan artär och ven 2,11, som inte används i klinisk miljö.
För att förbättra den kliniska relevansen, därför har vi utvecklat en musmodell där en ensidig venös slut på artärsidan anastomos skapades mellan en gren av jugular ven och gemensamma halspulsådern med avbrutna suturer 6. I denna modell avgörande histomorphological förändringar observerades bland utåt ombyggnad och progressiv intimal hyperplasi, vilket slutligen leder till AVF misslyckande.
En viktig aspekt av det kirurgiska ingreppet är anestesi protokoll. Det rekommenderas att använda isofluran inhalationsanestesi, eftersom detta är en säker och enkel metod för att erhålla långa perioder av anestesi. Det senare är särskilt viktigt för den träningsfasen, i vilken hela förfarandet kan ta upp till 3 timmar.
För att skapa det nödvändiga utrymme för förflyttnings utflöde venen av arteriovenös fistel, behöver den ipsilaterala sternocleidomastoideus till skäras ut.
Med avseende på hantering kärlet under operation, bör utföras dissektion av kärl i en trubbig sätt med användning av pincett. Användningen av specialiserade vaskulära raka pincett är recommended för direkt hantering och manipulering av kärlen eftersom de ger större precision och producerar mindre mekanisk skada på grund av den rundade spetsen. Användningen av suturtrådar som fartygsslingor i kombination med en hemostat kan underlätta säker hantering vävnad och dessutom presentera vävnaden på ett optimalt sätt när den används som en tredje hand som är avgörande så detta förfarande kan utföras utan någon direkt hjälp.
Utan tvekan, det svåraste steget i förfarandet är sutur placeringar mellan artär och ven. Man måste vara försiktig att inte sutur "tillbaka" -side av anastomosen med "front" -sida, eftersom detta kommer att leda till förträngning av anastomosen som kan leda till förtida fel av AVF. För att förhindra att detta händer, placera spetsen på kärl pincett mellan de två väggarna i kärlet för att skilja dem åt. Den tekniska svårighet kan anses vara en begränsning av denna modell. Men vi tror inte thvid detta förfarande är mer utmanande än den modell som för närvarande mest använda 3,6.
Det är svårt att göra en allmän kommentar på provstorleken för framtida studier, som den beräknade provstorleken inte bara beror på variabiliteten mellan djur utan även på "styrka" av insatsen. Vi uppskattar att en gruppstorlek om cirka 10 möss (exklusive möss som faller ur studien på grund av tekniskt fel på AVF) bör vara tillräckligt för studier som fokuserar på rollen av en specifik gen i AVF misslyckande. Nyligen kunde vi ge betydande resultat med en genomsnittlig gruppstorlek på 10 djur i en studie på rollen av elastin i murin AVF ombyggnad 13.
En aspekt av vår musmodell kräver ytterligare diskussion. Det är känt att uremiskt miljön hos patienter med njursjukdom i slutstadiet bidrar till en mängd kärlsjukdomar inklusive venös intima hyperplasien redan innan hemodialys tillgång kirurgi 14-16. Denna nuvarande modellen inte införliva uremiskt miljö. Därför skulle införandet av en modell av kronisk njursvikt 17 vara en värdefull tillsats steg för att ytterligare förbättra giltigheten av denna musmodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microsocpe | Leica | M80 | |
| Forceps | Medicon | 07.61.25 | |
| Vascular forceps | S&T | JFL-3D.2 | |
| Vascular forceps | S&T | D-5a.2 | |
| Forceps | Roboz | SS/45 | |
| Micro scissor 5 mm blade | Fine science tools | 15000-08 | |
| Micro scissor 2 mm blade | Fine science tools | 15000-03 | |
| Scissor | Medicon | 05.12.21 | |
| Clip applier 1 | S&T | CAF-4 | |
| Vascular clamp 1 | S&T | B-1V | |
| Clip applier 2 | BBraun | FE572K | |
| Vascular clamp 2 | BBraun | FE740K | |
| Hemostatic forceps | BBraun | BH110 | |
| 10.0 sutures | BBraun | G1117041 | |
| 6.0 sutures | BBraun | 768464 | |
| Cauterizer | Fine science tools | 18010-00 | |
| Needle holder | Medicon | 11.82.18 | |
| Ocular ointment | Pharmachemie | 41821101 | |
| Chlorhexidine tincture 0,5% | Leiden University Medical Center | NA | |
| Heparin | Leo Pharma | 012866-08 | |
| Buprenorphin | RB Pharmaceuticals | 283732 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45,112,110 | |
| Anesthesia mask | Maastricht university | custom made | |
| Midazolam | Actavis | AAAC6877 | |
| Dexmedetomidine | Orion | 141-267 | |
| Fentanyl | Bipharma | 15923002 | |
| Continuous anaesthetic induction chamber | Vet-tech solutions | AN010R |
References
- Rotmans, J. I. Animal Models for Studying Pathophysiology of Hemodialysis Access. The Open Urology & Nephrology Journal. 7, 14-21 (2014).
- Kwei, S., et al. Early adaptive responses of the vascular wall during venous arterialization in mice. Am.J.Pathol. 164 (1), 81-89 (2004).
- Castier, Y., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney Int. 70 (2), 315-320 (2006).
- Krishnamoorthy, M. K., et al. Hemodynamic wall shear stress profiles influence the magnitude and pattern of stenosis in a pig AV fistula. Kidney Int. 74 (11), 1410-1419 (2008).
- Ene-Iordache, B., Cattaneo, L., Dubini, G., Remuzzi, A. Effect of anastomosis angle on the localization of disturbed flow in 'side-to-end' fistulae for haemodialysis access. Nephrol. Dial. Transplant. 28 (4), 997-1005 (2013).
- Wong, C. Y., et al. Vascular remodeling and intimal hyperplasia in a novel murine model of arteriovenous fistula failure. J.Vasc.Surg. 59 (1), 192-201 (2014).
- Rekhter, M., Nicholls, S., Ferguson, M., Gordon, D. Cell proliferation in human arteriovenous fistulas used for hemodialysis. Arterioscler. Thromb. 13 (4), 609-617 (1993).
- Falk, A. Maintenance and salvage of arteriovenous fistulas. J. Vasc. Interv. Radiol. 17 (5), 807-813 (2006).
- Tordoir, J. H., et al. Prospective evaluation of failure modes in autogenous radiocephalic wrist access for haemodialysis. Nephrol. Dial. Transplant. 18 (2), 378-383 (2003).
- Dixon, B. S., Novak, L., Fangman, J. Hemodialysis vascular access survival: upper-arm native arteriovenous fistula. Am. J. Kidney Dis. 39 (1), 92-101 (2002).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. J. Vasc. Interv. Radiol. 20 (7), 946-950 (2009).
- Kang, L., et al. Regional and systemic hemodynamic responses following the creation of a murine arteriovenous fistula. Am. J. Physiol Renal Physiol. 301 (4), F845-F851 (2011).
- Wong, C. Y., et al. Elastin is a key regulator of outward remodeling in arteriovenous fistulas. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 49 (4), 480-486 (2015).
- Kennedy, R., et al. Does renal failure cause an atherosclerotic milieu in patients with end-stage renal disease. Am. J. Med. 110 (3), 198-204 (2001).
- Cheung, A. K., et al. Atherosclerotic cardiovascular disease risks in chronic hemodialysis patients. Kidney Int. 58 (1), 353-362 (2000).
- Lee, T., et al. Severe venous neointimal hyperplasia prior to dialysis access surgery. Nephrol. Dial. Transplant. 26 (7), 2264-2270 (2011).
- Kokubo, T., et al. CKD accelerates development of neointimal hyperplasia in arteriovenous fistulas. J. Am. Soc. Nephrol. 20 (6), 1236-1245 (2009).
