Introduction
기능 혈관 통로 도관은 살아 남기 위해 만성 혈액 투석에 의존 신부전 환자를위한 매우 중요하다. 동정맥루 (AVF)의 건설은 현재 혈관 액세스를 위해 바람직한 선택이 될 것입니다. 그러나 AVF 합병증 만성 혈액 투석 환자의 주요 사망 원인을 구성한다. 광범위한 과학적 노력에도 불구하고, 소설의 어느 것도 AVF 내구성의 상당한 개선 될 않았다 AVF 액세스 관련 합병증을 줄이기 위해 접근합니다. 이 실망 진행의 일부 혈액 투석 액세스 실패의 기본 기전 불완전한 이해에 관한 것이다.
밀접하게 인간의 병리를 모방 AV 접속 실패, 동물 모델의 병태 생리를 해명하기 위해 가장 중요하다. 이러한 관점에서뿐만 아니라 동물 종뿐만 아니라, 문 합부 필요한 항 coagulatory 요법 기간 서지 후 후속공예 계정 하나에주의해야한다. 큰 동물은 새로운 치료 전략을 개발 목표로 개입 연구에 가장 적합한 반면, 뮤린 모델 의한 형질 전환 마우스의 가용성 AV 액세스 실패를 기본 분자 메커니즘에서 더 파악할 수있는 큰 잠재력을 가지고있다. 또한, 마우스의 수많은 큰 동물의 사용과 비교하여 낮은 비용으로 이러한 목적을 위해 사용될 수있다.
AVF 장애 제 뮤린 모델 Kwei 및 동부 알.이이 모델 2004에 기술되었다에서 avfs는 경동맥 및 혈관 내 카테터를 사용하는 엔드 투 엔드 방식으로 경정맥을 이용하여 구성 하였다. 엔드 - 투 - 엔드 구성 및 혈관 내 카테터의 존재는 인간에서 avfs이 모델의 유효성을 제한하지만이 모델에서 avfs 초기 정맥 적응을 연구하는 것이 유용 할 수있다. 개선 AVF 모델은 Castier과 등에 의해 소개되었다. (3)하는 말에경동맥 경정맥 측에 접속된다. 그러나, 혈액 투석 환자에서 avfs 보통 동맥 측 정맥 끝 anatomizing 의해 구성된다. 이 유로 (4) 내의 혈역학 적 프로파일을 결정하기 때문에 AVF의 정확한 구성은 AV 액세스 모델의 중요한 특성이다. 후자는 장애 및 내막 증식증 (1H)의 후속 개발 내피 중요한 기여.
인간 6에서 사용 된 바와 같이 새로운 쥐 모델은 최근에 동일한 해부학 적 구성으로 개발되었다. 이 모델에서 AVF 중단 봉합 경동맥 측 외부 경정맥의 분기 단부 anastomosing하여 C57BL / 6 마우스에서 생성된다. 본 논문에서는 복잡한 기전을 해명보고자 뮤린 모델의 보급을 촉진하기 위해서,이 모델의 미세 수술 절차에 집중혈액 투석 접근 실패.
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Protocol
모든 실험은 라이덴 대학 의료 센터의 동물 복지위원회에 의해 승인되었다.
1. 동물 준비 및 마취
- 3-4%의 이소 플루 란으로 가득 연속 마취 유도 챔버에서 마우스 (1-3 개월)를 마취.
- 목 및 전기 면도기를 이용하여 좌측 상부 다리의 내측부의 복부 측면을 면도 모발을 제거 테이프의 조각을 사용한다.
- 두 눈에 눈 연고를 적용합니다.
- 코 환기 마스크가 고정되는 가열 담요에 동물을 배치합니다. 접착 테이프를 사용하여 코 마스크에 머리를 흥분시키는.
- 다음 흐름에 산소가 풍부한 공기 세트를 사용하여 1.5 내지 2.0 %의 농도로 이소 플루 란을 전달 : 공기 0.3 L / min로 100 % 산소 / 분 0.2 L. 마취 깊이를 평가하고 필요한 경우 이소 플루 란의 농도를 조정 발가락 사이 피부 핀치.
- 동물을 흥분시키는누운 자세에서 약 37 ° C로 설정되어 모든 사지에 접착 테이프로 가열 담요.
- 0.1 mg을 투여로 염화나트륨 0.9 %에 용해 된 부 프레 노르 핀을 주입 / 동물의 측면에서 0.9 % NaCl을 멸균 피하 0.5ml를 함께 kg이다.
- 준비된 지역에 클로르헥시딘 팅크 0.5 %를 적용합니다.
2. 피부 절개
- 외과 의사를 향해 머리를 가진 현미경으로 동물을 배치합니다.
- 마이크로 가위를 사용하여 복부 목의 중간 선에서 약 1.5 cm의 종 절개를합니다.
- 집게로 침샘을 잡고는 부분적으로 상처 밖에까지 두개쪽으로 오른쪽 침샘을 대체.
3. 해부 및 정맥 준비
- 확인하고 퉁명스럽게 확산하여 혈관 주위 조직으로부터 완전히 오른쪽 외부 경정맥의 dorsomedial 분기를 해부 단지longside 및 혈관의 방향.
- 해부 정맥 주위에 루프 (10.0 봉합)을 배치하고 잠금없이 하나의 매듭을 적용합니다.
4. 흉쇄 근육을 제거
- 집게를 사용하여, 퉁명스럽게 그 국경을 따라 확산에 의해 그 주변에서 오른쪽 흉쇄 근육을 해부하다. 격리 된 근육에서 열린 포셉 한 쌍을 놓고는 6.0 봉합사와 근위 및 원위 결찰. 이어서, cauterizer를 사용 근육 절개.
5. 해부 및 경동맥 준비
- 확인하고 집게를 사용하여 오른쪽 경동맥을 해부하다. 동맥의 조작에 도움이 동맥 주위에 6.0 봉합 실을 배치합니다.
- 같은 말단 및 근위 가능한 혈관 클램프를 적용합니다.
- 전문 마이크로 가위를 사용하여 약 1mm의 동맥의 중간에 세로 절개를합니다.
- 린스헤파린 용액과 동맥 [100 IU / ㎖] 선박이 피가 깨끗해질 때까지.
- 측정 및 폭을 혈관 클램프 [1.1 mm]을 일치시킬 필요 절개의 길이를 조정한다.
정맥 6. 내고
- 근위 이미 준비 정맥의 혈관 클램프를 적용하고 정맥 주위 봉합 실을 배치합니다.
- 이전에 배치 된 10.0 봉합사를 사용하여 가능한 한 원심 정맥을 봉합 실에 배치하고 결찰하는 haemostat를 사용하여 정맥에 부드러운 꼬리 견인을 적용합니다.
- 결찰에 단지 근위 가위를 사용하여 정맥을 잘라.
- 혈관 집게를 사용하여 부드럽게 혈관의 내강을 열고 헤파린 솔루션 [100 IU / ㎖]로 씻어.
문합 제 1 항에 창조
- 여섯 O '에서 봉합 다음에 12시 위치에 2 평방 노트를 사용하여 중단 된 봉합사 (10.0)과 동맥 정맥을 연결합니다시계 위치입니다. 그것은 자신의 축 주위를 회전 할 수없이 동맥에 정맥을 연결해야합니다. 외과 적 노출을 개선시키기 위해 동물을 돌린다.
- 정맥 주위 봉합 실을 놓고 haemostat를 사용하여 부드러운 측면 견인을 적용합니다.
- 동일한 단속 봉합을 사용하여 문합 표시 복부 측에 약 3-4 봉합 부가 배치하여 문합을 완료.
8. 헤파린 관리
- 가열 담요를 180 ° 회전하고 왼쪽 상단 다리에 현미경을 집중한다.
- 상부 다리의 중간 부분에 길이 방향으로 실행하고 피부를 통해 볼 수있는 혈관 구조를 찾아 대퇴 정맥 / 동맥 / 신경 다발을 확인합니다. 직접 길이 방법으로 대퇴 정맥으로 약 1cm의 미세 가위와 절개를합니다.
- 조심스럽게 대퇴 정맥의 혈관 주위 조직을 해부하고 선량 오에 헤파린을 주입대퇴 정맥에 0.2 IU / g의 체중 바.
문합 제 2 항 만들기
- 목 영역으로 돌아가 정맥 주위에 배치 된 봉합 실을 제거합니다.
- 연속적으로 정맥을 통해 다시 경동맥 아래에있는 경동맥 아래를 통과 봉합 실 (6.0)을 놓습니다. (그림 1L)
- 정맥 혈관 클램프를 제거합니다.
- 다음으로, 동시에 혈관 클램프를 왜곡하여 절반 완료 동정맥루를 시계 방향 방식으로 경동맥의 축을 따라 180도 트위스트와 봉합 실의 끝 부분에 중간 견인을 적용합니다.
- 단계 7.2에서 설명하는 것과 같은 방식으로 문합을 완료합니다.
10. 혈관 클램프 제거
- 봉합 실을 제거하고 혈관이 180 ° 시계 반대 방향으로 회전 클램프.
- 근위 혈관 클램프 다음 말초 혈관 클램프를 제거합니다. <리는> 부드럽게 혈관 집게로 정맥 유출 관을 폐색하여 문합의 개통을 평가합니다. 특허 문합 경우, 사전 흡장 정맥 절에서는 박동성 방식으로 확장됩니다. 원래의 해부학 적 위치하여 집게에 대한 권리 침샘을 변경합니다.
11. 피부 폐쇄 및 수술 후 케어
- 중단 봉합 (6.0)와 상부 다리의 피부를 닫습니다.
- 중단 봉합 (6.0)과 목의 피부를 닫습니다.
- 가열 블랭킷으로부터 동물을 제거하고 0.5 ml의 0.9 % 염화나트륨을 피하 주사.
- 가열 램프 가열 어두운 새장에 동물을 놓고 완전히 복구 할 수 있습니다. 동물이 완전히 회복되지 않는 경우,이 때문에 외과 영역에서 출혈에 혈역학 적 충격으로 고생하지 않도록. 이러한 부어 목 혈액의 누출로 표지판을 찾아보십시오.
- bupr의 첫 번째 주사 후 약 6 시간 후enorphine, 추가로 72 시간 동안 적절한 진통을 제공하기 위해, 제조자에 의해 권장되는 투여 량의 부 프레 노르 핀 피하의 서방 성 제제의 단일 투여 량을 주입.
(12) 조직 수확
- 복강 투여 미다 졸람 (5 ㎎ / ㎏)을 포함 마취-혼합물, 메데 토미 (0.5 ㎎ / ㎏)과 펜타닐 (0.05 ㎎ / ㎏)과 동물을 마취.
- 비 가열 된 실리콘 매트에 그것의 발과 뺨을 통해 바늘을 삽입하여 앙와위에서 동물을 흥분시키는.
- 마이크로 가위와 목에 흉터를 통해 약 1.5-2.0 cm의 절개를합니다.
- AVF를 해부하고, 쉽게 식별하기 위해 proximal-, 말초 동맥 및 정맥 유출 기관 주위 봉합 스레드 (6.0)를 배치합니다.
- 프로토콜의 섹션 10.3에서 설명하는대로 AVF의 개통을 평가합니다.
- 내측 유 개복술을 수행하여 복강을 열고마이크로 가위를 노래.
- 쇄골 라인에 꼬리 쪽부터 가위를 사용하여 왼쪽과 오른쪽 복부 갈비뼈를 잘라. 마이크로 가위를 사용하여 집게를 사용하여 두개쪽으로이 부분을 복부 흉곽의 중간 부분에 부착 이후에 대체되는 다이아 프램을 가로로 쪼개다.
- 열등한 대정맥 정맥을 찾아 마이크로 가위로를 가로로 쪼개다.
- 좌심실에서 바늘 23 게이지 바늘을 삽입하고 intravasal 유체가 거의 깨끗해질 때까지 약 100 mmHg로의 압력에서 PBS로 관류.
- 니들을 제거하지 않고, 현재 약 100 mmHg의 압력에서 10 분 동안 4 % 포르말린 관류.
- 마이크로 가위로 동맥과 정맥 모두에 병행하여 AVF 절제 및 4 % 포르말린 용액 O / N에서 잠수함.
13. 조직 임베딩 및 단면
- 제조의 protoco에 따라 파라핀하기 위해 조직을 처리엘. 프로토콜은 다음의 구성으로 적용 :
- RT에서 1 시간 동안 70 % 에탄올에 담가. 배를 반복합니다.
- 실온에서 1 시간 동안 에탄올 96 %에 빠져. 배를 반복합니다.
- 실온에서 1 시간 동안 에탄올 99.5 %에 빠져. 한 번 반복합니다.
- 실온에서 1.5 시간 동안 에탄올 99.5 %에 빠져.
- RT에서 1 시간 동안 100 % 크실렌 빠져. 한 번 반복합니다.
- 62 ° C에서 1 시간 동안 Parafin에 빠져. 배를 반복합니다.
- 정맥 유출 관이 삽입 카세트에 수직 배향되도록 파라핀에 AVF를 포함.
- 마이크로톰을 사용하여 각각 5 μm의 두께 부 (30) (12)로 이루어지는 직렬 섹션을 생성한다. 그런 다음 각 직렬 섹션의, 문합에 가장 가까운 지역부터 시작 질서 열두까지 위치 하나에서 시작하는 단일 장착 유리에 한 섹션을 배치합니다.
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Representative Results
문합 (그림 1)의 생성 후, 개통은 곧 혈관 집게로 정맥 유출 관을 폐색에 의해 평가되어야한다. 문합 특허 때, 폐색에 혈관 계통의 근위 명확하게 박동성 방식으로 확장한다. 또한 명백 적외선 투시 효과적으로 혈관 조영술로 함수 (NIRF) (도 2) 근처하여 확인된다. 수술의 실패는 (그림 2)에 도시되어 같은 문합의 폐쇄로 이어질 수 있습니다. 이 오류가 너무 좁 문합 영역 용기 토션 불충분 헤파린 투여 또는 뒷면에 문합의 전면을 연결하는 실수 봉합 위치에 의해 야기 될 수있다.
조직 학적 수준에서 AVF 혈관 리모델링 과정이 모델을 이용하여 연구를 매끄럽게 할 수있다. AVF 혈관 리모델링의 결과로 발생혈류 및 압력 증가. 마우스에서,이 반응은 수술 후 제 2 주 내강 영역의 증가로 이어지는 (예를 들면, 외측으로 개조) 둘레의 증가에 의해 특징된다. 이 두 주 후, 내강 면적은 점진적으로 인해 외부 리모델링과 내막의 지속적인 농축에 정지 감소한다. 이러한 진보적 협착 병변의 형성은 수술 후 사주에 AVF의 50 %의 폐색을 초래한다. 이 단계에서는, 특허 AVF에서 혈관 반응 적절한 분석이 여전히 가능하므로 따라서에서 avfs 수확 최적 시점은 수술 후 이주에있을 것이다. 수술 후 이주의 정맥 유출 기관의 면역 염색에 실패 인간에서 avfs도 7에서 관찰 내막의 세포 구획은 주로 알파 - 평활근 액틴 (α-SMA) 양성 세포 (그림 3)으로 구성되어 있음을 보여준다.
복잡성의 관점에서 미세 수술 절차는, 상기 마우스의 비율 절차의 기술적 장애 이해 할수 현실적이다. 우리의 손에서, 절차의 성공률은 처음에 67 %였다. 하지만, 상기 교육이 비율은 97 %까지 증가 하였다. 고장의 주요 원인은 급성 혈전증 (27 %) 및 anesthesia- 관련 사망 (13 %),이어서 출혈 (60 %)이었다. 충분한 훈련 후 수술을 약 1 시간에 수행 될 수있다.
수술 그림 1. 상세 계획 (A - T). AVF의 성공적인 창조를위한 중요한 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2 다시 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 53294 / 53294fig2.jpg "/>
그림 특허 및 폐색에서 avfs 2. 육안 사진. (A) 원위부 경동맥의 혈관 클램프와 특허 AVF. (B)는 AVF는 흡장. (흰색 화살표)가 혈액 흐름의 방향을 나타낸다. (C) 근처 적외선 투시를 사용하여 시연 특허 AVF. (빨간색 화살표) 동맥을 나타냅니다. (파란색 화살표) 정맥 유출 관을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
작동이되지 않는 상태 제어 선박에 비해 14 일에서 AVF의 정맥 유출 관의 그림 3. 조직 학적 염색과 (A - B). 형태 학적 개요 헤 마톡 실린, phloxin 및 SAFF를 사용하여론은 14 일 AVF 작성 후 용기 둘레 내막 증식증 개발에 명확한 증가를 나타내는. (C - D) 면역 조직 화학 염색은 세포의 대부분은 내막 과형성을 제시 긍정적 알파 평활근 액틴임을 입증. (L) 루멘; (IH) 내막 증식; 스케일 바 :. 200 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
AVF는 혈액 투석 치료의 아킬레스로 간주됩니다. 불행하게도, AVF는 여전히 실패 8-10의 높은 숫자에서 겪고있다. 기본 메커니즘에 대한 광범위한 연구에도 불구하고, 정확한 병태 생리는 알려져 있지 않다. AVF 실패 수많은 쥐 모델은 이미 문헌 2,3,11,12에 기재되어있다. 그러나, 이러한 모델 중 어느 것도 대부분의 임상 상황에서 사용되는 동맥 측 문합 구성에 정맥 끝을 통합하지 않습니다. 얻어진 혈역학 프로필 혈관 재 형성에 중요한 역할 때문에 매우 적합하다. 또한, 모델의 일부 임상에서 사용되지 동맥 및 정맥 2,11 간의 연결 합성 커프를 사용했다.
임상 적 관련성을 개선하기 위해, 우리는 따라서 동맥 측 문합에 일방적 정맥 끝이 jugu의 지점 사이에 작성된 쥐 모델을 개발중단 봉합 6 LAR 정맥과 경동맥. 이 모델에서 중요한 histomorphological 변화는 외부를 포함하여 궁극적으로 AVF 실패로 이어지는, 리모델링 및 진보적 내막의 증식이 관찰되었다.
수술의 중요한 측면은 마취 프로토콜이다. 이 마취의 장기간를 얻기위한 안전하고 쉬운 방법으로는, 이소 플루 란 흡입 마취를 사용하는 것이 좋습니다. 후자는 전체 절차는 3 시간까지 걸릴 수있는 트레이닝 단계에 특히 중요하다.
동정맥루 이송 유출 정맥에 필요한 공간을 생성하기 위해, 동측 흉쇄 근육 절개 할 필요가있다.
수술하는 동안 처리 용기에 대하여, 혈관 해부 집게를 사용하여 평활하게 수행되어야한다. 전문 혈관 직선 집게의 사용은 연구입니다때문에 둥근 팁을 직접 취급 및 혈관의 조작 그들은 더 정밀도를 제공하고 덜 기계적 손상을 생산하는 한 ecommended. 봉합 실의 사용은 지혈 결합 용기 루프는이 절차는 직접적인 도움없이 수행 될 수 있으므로 매우 중요하다 제 손으로 사용할 때 최적의 방법으로 조직을 제시에서 또한 안전 조직 처리에 도움을 수있다.
의심 할 여지없이, 절차의 가장 어려운 단계는 동맥과 정맥 사이의 봉합 게재 위치입니다. 이 AVF의 조기 실패로 이어질 수있는 문 합부의 축소로 이어질 것 같이주의를, "앞"- 측에 문합의 "뒤로"- 측을 봉합하지 않도록주의해야합니다. 이를 방지하기 위해, 그들을 분리하기 위해 용기의 두 벽 사이의 혈관 핀셋의 선단 위치. 기술적 어려움은이 모델의 제한으로 간주 될 수있다. 그러나, 우리는 일 생각하지 않습니다이 과정에서 현재 가장 널리 3,6를 사용하는 모델보다 더 도전입니다.
계산 된 표본 크기는 동물 사이뿐만 아니라 개입의 '힘'의 변화에 의존하지 않는 한 그것은 미래 연구를위한 표본의 크기에 일반적인 발언을하기는 어렵습니다. 우리는 (때문에 AVF의 기술적 인 실패의 연구에서 드롭 마우스 제외) 약 10 생쥐의 그룹 크기가 AVF 실패의 특정 유전자의 역할에 초점을 연구하기에 충분해야한다고 추정한다. 최근에, 우리는 13 개조 쥐 AVF에서 엘라스틴의 역할에 대한 연구에서 10 동물의 평균 그룹 크기와 의미있는 결과를 얻을 수 있었다.
우리의 쥐 모델의 한 측면은 추가 논의가 필요합니다. 말기 신장 질환 환자에서 요독 환경이 정맥 내막 hyperplasi을 포함한 혈관 질환의 다수에 기여하는 것으로 알려져있다혈액 투석 접근 수술 14-16로도 이전. 이 본 모델은 요독 환경을 통합하지 않습니다. 따라서, 만성 신부전 (17)의 모델의 결합은 또한 본 뮤린 모델의 유효성을 개선하기 위해 유용한 부가적인 단계가 될 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microsocpe | Leica | M80 | |
| Forceps | Medicon | 07.61.25 | |
| Vascular forceps | S&T | JFL-3D.2 | |
| Vascular forceps | S&T | D-5a.2 | |
| Forceps | Roboz | SS/45 | |
| Micro scissor 5 mm blade | Fine science tools | 15000-08 | |
| Micro scissor 2 mm blade | Fine science tools | 15000-03 | |
| Scissor | Medicon | 05.12.21 | |
| Clip applier 1 | S&T | CAF-4 | |
| Vascular clamp 1 | S&T | B-1V | |
| Clip applier 2 | BBraun | FE572K | |
| Vascular clamp 2 | BBraun | FE740K | |
| Hemostatic forceps | BBraun | BH110 | |
| 10.0 sutures | BBraun | G1117041 | |
| 6.0 sutures | BBraun | 768464 | |
| Cauterizer | Fine science tools | 18010-00 | |
| Needle holder | Medicon | 11.82.18 | |
| Ocular ointment | Pharmachemie | 41821101 | |
| Chlorhexidine tincture 0,5% | Leiden University Medical Center | NA | |
| Heparin | Leo Pharma | 012866-08 | |
| Buprenorphin | RB Pharmaceuticals | 283732 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45,112,110 | |
| Anesthesia mask | Maastricht university | custom made | |
| Midazolam | Actavis | AAAC6877 | |
| Dexmedetomidine | Orion | 141-267 | |
| Fentanyl | Bipharma | 15923002 | |
| Continuous anaesthetic induction chamber | Vet-tech solutions | AN010R |
References
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