Introduction
Un conducto de acceso vascular funcional es de vital importancia para los pacientes con insuficiencia renal que dependen de la hemodiálisis crónica para mantenerse con vida. La construcción de una fístula arteriovenosa (FAV) es actualmente la opción preferida para el acceso vascular. Sin embargo, las complicaciones relacionadas AVF constituyen una causa importante de morbilidad en los pacientes en hemodiálisis crónica. A pesar de grandes esfuerzos científicos, ninguno de los nuevos enfoques para reducir las complicaciones relacionadas con las FAV-dio lugar a una mejora sustancial de la FAV durabilidad. Parte de este decepcionante progreso se refiere a la comprensión incompleta de la fisiopatología subyacente de la falta de acceso a hemodiálisis.
Para desentrañar la fisiopatología de la insuficiencia de acceso AV, los modelos animales que imitan estrechamente la patología humana son de suma importancia. En este sentido, no sólo las especies animales, sino también el lugar de la anastomosis, la terapia anti-coagulatory requerida y la duración del seguimiento después de la oleadary debe tenerse en cuenta 1. Mientras que los animales grandes son los más adecuados para los estudios de intervención dirigidos al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, los modelos murinos tienen el mayor potencial para obtener mayor conocimiento de los mecanismos moleculares que subyacen a la falta de acceso AV debido a la disponibilidad de los ratones transgénicos. Además, un gran número de ratones se puede usar para este propósito a costes más bajos en comparación con el uso de animales de mayor tamaño.
El primer modelo murino de fracaso AVF fue descrito en 2004 por Kwei y. Et al 2 En este modelo, las FAV se construyeron utilizando la arteria carótida y la vena yugular de una manera de extremo a extremo utilizando un catéter intravascular. Este modelo podría ser útil para estudiar la adaptación venosa temprano en FAV aunque la configuración de extremo a extremo y la presencia de un catéter intravascular limitar la validez de este modelo para FAV humanos. Un modelo mejorado AVF fue introducido por Castier y et al. 3 en la que el extremo dela arteria carótida está conectado al lado de la vena yugular. Sin embargo, las FAV en pacientes de hemodiálisis se construyen normalmente por anatomizing el final de una vena para el lado de una arteria. La configuración exacta de la FAV es una característica crucial de un modelo de acceso AV ya que determina el perfil hemodinámico dentro del conducto 4. Este último es un importante contribuyente a la disfunción endotelial y posterior desarrollo de hiperplasia de la íntima (IH) 5.
Un modelo murino novela fue desarrollado recientemente con una configuración anatómica idéntica como se utiliza en los seres humanos 6. En este modelo, AVF se crean en ratones C57BL / 6 por anastomosis al final de una rama de la vena yugular externa para la parte de la arteria carótida común con suturas interrumpidas. En el presente trabajo, nos centramos en el procedimiento microquirúrgico de este modelo con el fin de facilitar el uso generalizado de este modelo murino, con el objetivo de desentrañar la compleja fisiopatologíade la falta de acceso a hemodiálisis.
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Protocol
Todos los experimentos fueron aprobados por el comité de bienestar de los animales del Centro Médico de la Universidad de Leiden.
1. Preparación de los animales y anestesia
- Anestesiar el ratón (1-3 meses de edad) en una cámara de inducción de la anestesia continua llena de 3-4% isoflurano.
- Afeitarse la cara ventral del cuello y la parte interior de la pierna superior izquierda usando una máquina de afeitar eléctrica y usar un trozo de cinta para eliminar el vello.
- Aplique un ungüento ocular en ambos ojos.
- Coloque el animal sobre la manta de calentamiento en la que se fija la máscara de ventilación nariz. Fijar la cabeza a la máscara de la nariz con cinta adhesiva.
- Entregar isoflurano a una concentración de 1,5-2,0%, utilizando un equipo de aire enriquecido con oxígeno en el siguiente flujo: aire 0,3 l / min, 100% de oxígeno de 0,2 l / min. Pellizcar la piel entre los dedos para evaluar la profundidad de la anestesia y ajustar la concentración de isoflurano si es necesario.
- Fijar el animal a lamanta térmica con cinta adhesiva en todas las extremidades que se fija en aproximadamente 37 ° C en una posición supina.
- Inyectar buprenorfina disuelto en cloruro de sodio (NaCl) 0,9% a una dosis de 0,1 mg / kg junto con 0,5 ml de NaCl 0,9% por vía subcutánea estéril en el flanco del animal.
- Aplicar clorhexidina tintura 0,5% a la zona preparada.
2. Incisión de la piel
- Coloque el animal bajo el microscopio con su cabeza hacia el cirujano.
- Se practica una incisión longitudinal de aproximadamente 1,5 cm en la línea media ventral del cuello utilizando una tijera micro.
- Coge las glándulas salivales con fórceps y desplazar la glándula salival derecha craneal hasta que esté parcialmente fuera de la herida.
3. La disección y preparación de la vena
- Identificar y sin rodeos diseccionar la rama dorsomedial de la vena yugular externa derecha completamente de su tejido perivascular mediante la difusión de un soloLongside y en la dirección del vaso sanguíneo.
- Coloque un bucle (10,0 sutura) alrededor de la vena diseccionado y aplicar un nudo sin bloquearla.
4. Extracción del músculo esternocleidomastoideo
- El uso de pinzas, sin rodeos diseccionar el músculo esternocleidomastoideo derecho de su entorno mediante la difusión a lo largo de su frontera. Colocar un par de fórceps abierto bajo el músculo aislado y ligarlo proximal y distal con una sutura de 6,0. Posteriormente, escindir el músculo usando un cauterizador.
5. La disección y preparación de la arteria carótida común
- Identificar y disecar la arteria carótida común derecha con unas pinzas. Colocar un hilo de sutura 6.0 alrededor de la arteria para ayudar en la manipulación de la arteria.
- Aplicar pinzas vasculares como distal y proximal como sea posible.
- Se practica una incisión longitudinal en el medio de la arteria de aproximadamente 1 mm utilizando la tijera micro especializada.
- enjuague elarteria con una solución de heparina [100 IU / ml] hasta que el buque está libre de sangre.
- Medir y ajustar la longitud de la incisión si es necesario para que coincida con la anchura de la pinza vascular [1,1 mm].
6. La ligadura de la vena
- Aplicar una pinza vascular proximal de la vena ya preparado y colocar un hilo de sutura alrededor de la vena.
- Aplicar tracción caudal suave a la vena utilizando un hemostático que se coloca sobre el hilo de sutura y se liga la vena como distalmente como sea posible usando la sutura 10.0 que se colocó antes.
- Cortar la vena usando una tijera justo proximal a la ligadura.
- El uso de pinzas vasculares, abrir suavemente el lumen de la vena y enjuague con una solución de heparina [100 IU / ml].
7. Creación de Anastomosis Parte 1
- Conectar la vena a la arteria con una sutura interrumpida (10.0) por medio de 2 nudos cuadrados en la posición doce seguido de una sutura en el seis en puntoposición del reloj. Asegúrese de conectar la vena a la arteria sin permitir que gire alrededor de su propio eje. Girar el animal con el fin de mejorar la exposición quirúrgica.
- Coloque un hilo de sutura alrededor de la vena y aplicar tracción lateral suave usando un hemostático.
- Utilizando las mismas suturas interrumpidas, completar la anastomosis mediante la colocación de aproximadamente 3-4 suturas adicionales en el lado ventral visible de la anastomosis.
8. La administración de heparina
- Girar la calefacción manta 180 ° y enfocar el microscopio en la pierna izquierda superior.
- Identificar el haz vena / arteria / nervio femoral mediante la búsqueda de una estructura vascular que se extiende longitudinalmente en la parte medial de la pierna superior y puede ser visto a través de la piel. Hacer una incisión con la tijera micro de aproximadamente 1 cm directamente encima de la vena femoral de manera longitudinal.
- diseccionar cuidadosamente el tejido perivascular de la vena femoral y se inyecta heparina a dosis of 0.2 IU / g de peso corporal en la vena femoral.
9. Creación de Anastomosis Parte 2
- Volver a la zona del cuello y retire el hilo de sutura que se coloca alrededor de la vena.
- Colocar un hilo de sutura (6.0) que pasa posteriormente por debajo de la arteria carótida, sobre la vena y de nuevo por debajo de la arteria carótida. (Figura 1L)
- Retire la pinza vascular venosa.
- A continuación, torcer el medio completado fístula arteriovenosa 180 ° a lo largo del eje de la arteria carótida de una manera hacia la derecha girando al mismo tiempo tanto las pinzas vasculares y aplicar tracción medial a los extremos del hilo de sutura.
- Completar la anastomosis de la misma manera como se describe en el paso 7.2.
La eliminación 10. Pinza vascular
- Retire el hilo de sutura vascular y gire el abrazaderas 180 ° en sentido antihorario.
- Retire la pinza vascular distal seguida de la pinza vascular proximal. <li> Evaluar la permeabilidad de la anastomosis mediante la oclusión suavemente el tracto de salida venoso con las pinzas vasculares. En caso de una anastomosis patente, la sección de pre-venoso de oclusión se expandirá de una manera pulsátil. Reubicar la glándula salival derecha a su posición utilizando pinzas anatómicas originales.
11. Cierre de la piel y Cuidado posoperatorio
- Cierre de la piel de la pierna superior con una sutura continua (6.0).
- Cierre la piel del cuello con una sutura continua (6.0).
- Retire el animal de la manta eléctrica e inyectar 0,5 ml de NaCl al 0,9% por vía subcutánea.
- Colocar el animal en una jaula oscura que se calienta con una lámpara de calentamiento y dejar que se recupere totalmente. Cuando un animal no se recupera completamente, asegúrese de que no sufre de un shock hemodinámico por sangrado en el área quirúrgica. Busque señales como un cuello hinchado y la salida de la sangre.
- Después de aproximadamente 6 horas después de la primera inyección de buprenorphine, inyectar una dosis única de una formulación de liberación sostenida de buprenorfina por vía subcutánea en una dosis que es recomendado por el fabricante, a fin de proporcionar una analgesia adecuada para un 72 hr adicional.
12. La recolección de tejidos
- Anestesiar al animal con una mezcla anestésica que contiene midazolam (5 mg / kg), medetomidina (0,5 mg / kg) y fentanilo (0,05 mg / kg) administrado por vía intraperitoneal.
- Fijar el animal en posición supina por la inserción de agujas a través de sus patas y las mejillas en una estera de silicio no calentado.
- Hacer una incisión de aproximadamente 1,5 a 2,0 cm sobre la cicatriz en el cuello con la tijera micro.
- Diseccionar la FAV, y colocar hilos de sutura (6.0) en todo el proximal-, arteria distal y tracto de salida venoso para facilitar su identificación.
- Evaluar la permeabilidad de la FAV como se describe en la sección 10.3 del protocolo.
- Abra la cavidad peritoneal mediante la realización de una laparotomía medial ucantar la tijera micro.
- Corte a través de la caja torácica ventral izquierda y derecha usando un par de tijeras a partir caudal en la línea media clavicular. El uso de una tijera micro, seccionar el diafragma que se adjunta a la parte media de la caja torácica ventral y, posteriormente, desplazar esta sección cranealmente usando fórceps.
- Localizar la vena cava inferior y seccionar con una tijera micro.
- Inserte una aguja de calibre de la aguja 23 en el ventrículo izquierdo y perfundir con PBS a una presión de aproximadamente 100 mm de Hg hasta que el líquido intravasal prácticamente clara.
- Sin retirar la aguja, ahora perfundir con formalina al 4% durante 10 min a una presión de aproximadamente 100 mmHg.
- Escindir la FAV por transección tanto las arterias y venas con la tijera micro y sumergirla en una solución de formalina S / N 4%.
13. Tejido inclusión y corte
- Procesar el tejido de parafina de acuerdo con protoco de la fabricaciónl. El protocolo aplicado consistió en lo siguiente:
- Sumergir en etanol 70% durante 1 hora a RT. Repetir 2x.
- Sumergir en etanol 96% durante 1 hora a RT. Repetir 2x.
- Sumergir en etanol 99,5% durante 1 hora a RT. Repetir una vez.
- Sumergir en etanol 99,5% durante 1,5 h a TA.
- Sumergir en xileno 100% durante 1 hora a RT. Repetir una vez.
- Sumergir en Parafin durante 1 hora a 62 ° C. Repetir 2x.
- Incrustar la FAV en parafina para que el tracto de salida venosa está orientado perpendicular a la incorporación de casete.
- Usando un microtomo, crear 12 secciones en serie cada uno compuesto de 30 secciones con un espesor de 5 micras. Luego de cada sección de serie, colocar una sección en un solo vaso de montaje a partir de la posición de uno hasta doce de una manera ordenada a partir de la zona más próxima a la anastomosis.
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Representative Results
Después de la creación de la anastomosis (Figura 1), la permeabilidad debe ser evaluada mediante la oclusión de poco el tracto de salida venoso con una pinza vascular. Cuando la anastomosis es patente, el tracto proximal a la oclusión vascular debe ampliar claramente de una manera pulsátil. Además, la permeabilidad se confirma mediante el uso de fluoroscopia cerca de infrarrojos (NIRF) que funciona efectivamente como una angiografía (Figura 2). Un fallo en el procedimiento quirúrgico puede conducir a una oclusión de la anastomosis como se representa en la (Figura 2). Este fallo puede ser causado por un área demasiado estrecho anastomótica, la torsión de los vasos, la dosis de heparina inadecuada o una colocación de la sutura accidental que conecta la parte frontal de la anastomosis a la parte de atrás.
A nivel histológico, el proceso de remodelación vascular en AVF puede investigarse elegantemente usando este modelo. el remodelado vascular en AVF se produce como resultado de laaumento en el flujo sanguíneo y la presión. En los ratones, esta respuesta se caracteriza por un aumento de la circunferencia (por ejemplo, la remodelación hacia el exterior) que conduce a un aumento del área luminal en las primeras 2 semanas después de la cirugía. Después de estas 2 semanas, el área luminal disminuye progresivamente debido a una parada en la remodelación hacia el exterior y engrosamiento en curso de la túnica íntima. La formación de estas lesiones estenóticas progresivas resulta en la oclusión de 50% de AVF a las 4 semanas después de la cirugía. Por lo tanto, el momento óptimo para cosechar las FAV sería a las 2 semanas después de la cirugía, ya que en esta fase, el correcto análisis de la respuesta vascular en la patente AVF es todavía factible. La inmunotinción del tracto de salida venoso a las 2 semanas después de la cirugía muestra que el compartimento celular de la íntima se compone principalmente de actina alfa del músculo liso (α-SMA) células positivas (Figura 3), como se observa en las FAV humanos fallidos, así 7.
En vista de la complejidad de la procedimiento microquirúrgico, que es realista que contar con un fallo técnico del procedimiento en una proporción de los ratones. En nuestras manos, la tasa de éxito del procedimiento fue del 67% en el principio. Sin embargo, con formación adicional esta tasa se incrementó hasta el 97%. La principal causa del fracaso fue la hemorragia (60%), seguido de la trombosis aguda (27%) y anestesia- muerte relacionada con el (13%). Después de la formación suficiente, el procedimiento quirúrgico se puede realizar en aproximadamente 1 hora.
Figura 1. Esquema detallado de procedimiento quirúrgico (A - T). Los pasos clave para la creación exitosa de una FAV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2. Fotografías macroscópicas de patente y FAV ocluidos. (A) A AVF patente con una pinza vascular en la arteria carótida común distal. (B) Un ocluido FAV. (Flecha blanca) indica la dirección del flujo de sangre. (C) Un FAV patente demostrado utilizando infrarrojo cercano fluoroscopia. (Flecha roja) indica arteria. (flecha azul) indica tracto de salida venoso. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. tinciones histológicas de la vía de salida venosa de la FAV en el día 14 en comparación con los vasos de control no operados (A - B). Descripción general morfológico utilizando hematoxilina, floxina y saffron que muestra un claro aumento de la circunferencia del vaso y la hiperplasia de la íntima desarrollo de 14 días después de la creación de FAV. (C - D) La tinción inmunohistoquímica que demuestra que la mayoría de las células presentes la hiperplasia de la íntima son alfa actina de músculo liso positivo. (L) Lumen; hiperplasia (IH) de la íntima; barra de escala:. 200 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La FAV se considera que es el talón de Aquiles en el tratamiento de hemodiálisis. Por desgracia, la FAV todavía sufre de un alto número de fallos 8-10. A pesar de una amplia investigación sobre los mecanismos subyacentes, la fisiopatología exacta sigue siendo desconocida. Numerosos modelos murinos para la insuficiencia AVF ya se han descrito en la literatura 2,3,11,12. Sin embargo, ninguno de estos modelos incorporan un extremo venoso a la configuración de anastomosis lado arterial que más se utiliza en la situación clínica. Esto es muy relevante desde el perfil hemodinámico resultante juega un papel importante en la remodelación vascular. Por otra parte, algunos de los modelos utilizados un manguito sintético para la conexión entre la arteria y la vena 2,11, que no se utiliza en el entorno clínico.
Para mejorar la relevancia clínica, por lo tanto, desarrollamos un modelo murino en el que se creó un extremo venoso unilateral de la anastomosis lado arterial entre una rama del jugular de la vena y la arteria carótida común con suturas interrumpidas 6. En este modelo los cambios histomorphological cruciales se observaron hacia afuera incluyendo la remodelación y la hiperplasia de la íntima progresiva, en última instancia conduce a la insuficiencia FAV.
Un aspecto crucial de la intervención quirúrgica es el protocolo de anestesia. Se recomienda el uso de anestesia de inhalación de isoflurano, ya que este es un método seguro y fácil para la obtención de períodos prolongados de anestesia. Esto último es especialmente importante para la fase de entrenamiento en el que todo el procedimiento puede tardar hasta 3 horas.
Con el fin de crear el espacio necesario para la vena de desplazamiento de salida de la fístula arteriovenosa, el músculo esternocleidomastoideo ipsilateral necesita ser extirpada.
Con respecto a la manipulación recipiente durante la cirugía, la disección de los vasos se debe realizar de una manera contundente el uso de fórceps. El uso de fórceps rectos vasculares especializados son recommended para el manejo y la manipulación directa de los vasos, ya que proporcionan una mayor precisión y producen menos daños mecánicos debido a la punta redondeada. El uso de hilos de sutura como bucles de los vasos en combinación con una pinza hemostática puede ayudar en la manipulación de tejidos seguro y por otra parte, al presentar el tejido de una manera óptima cuando se usa como una tercera mano que es crucial por lo que este procedimiento se puede realizar sin ninguna asistencia directa.
Sin lugar a dudas, el paso más difícil en el procedimiento son las colocaciones de sutura entre la arteria y la vena. Se debe tener cuidado de no suturar el -side "vuelta" de la anastomosis con el -side "frontal", ya que esto dará lugar a un estrechamiento de la anastomosis que puede conducir a un fallo prematuro de la FAV. Para evitar que esto suceda, la posición de la punta de las pinzas vasculares entre las dos paredes del vaso con el fin de separarlos. La dificultad técnica puede ser considerado como una limitación de este modelo. Sin embargo, no creemos que THen este procedimiento es más difícil que el modelo que actualmente es el más ampliamente utilizado 3,6.
Es difícil hacer una observación general sobre el tamaño de la muestra para estudios futuros, como el tamaño de la muestra calculado no sólo depende de la variabilidad entre los animales, sino también en la "fuerza" de la intervención. Estimamos que un tamaño de grupo de aproximadamente 10 ratones (con exclusión de los ratones que abandonan el estudio debido a un fallo técnico de la FAV) debería ser suficiente para los estudios que se centran en el papel de un gen específico en un fracaso FAV. Recientemente, hemos sido capaces de obtener resultados significativos con un tamaño medio de grupo de 10 animales en un estudio sobre el papel de la elastina en la remodelación de murino FAV 13.
Un aspecto de nuestro modelo murino requiere más discusión. Se sabe que el medio urémico en pacientes con enfermedad renal en etapa terminal contribuye a una multitud de enfermedades vasculares incluyendo hyperplasi intimal venosauna incluso antes de la cirugía acceso vascular para hemodiálisis 14-16. Este modelo actual no incorpora el medio urémico. Por lo tanto, la incorporación de un modelo de insuficiencia renal crónica 17 sería un paso aditivo valioso para mejorar aún más la validez de este modelo murino.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microsocpe | Leica | M80 | |
| Forceps | Medicon | 07.61.25 | |
| Vascular forceps | S&T | JFL-3D.2 | |
| Vascular forceps | S&T | D-5a.2 | |
| Forceps | Roboz | SS/45 | |
| Micro scissor 5 mm blade | Fine science tools | 15000-08 | |
| Micro scissor 2 mm blade | Fine science tools | 15000-03 | |
| Scissor | Medicon | 05.12.21 | |
| Clip applier 1 | S&T | CAF-4 | |
| Vascular clamp 1 | S&T | B-1V | |
| Clip applier 2 | BBraun | FE572K | |
| Vascular clamp 2 | BBraun | FE740K | |
| Hemostatic forceps | BBraun | BH110 | |
| 10.0 sutures | BBraun | G1117041 | |
| 6.0 sutures | BBraun | 768464 | |
| Cauterizer | Fine science tools | 18010-00 | |
| Needle holder | Medicon | 11.82.18 | |
| Ocular ointment | Pharmachemie | 41821101 | |
| Chlorhexidine tincture 0,5% | Leiden University Medical Center | NA | |
| Heparin | Leo Pharma | 012866-08 | |
| Buprenorphin | RB Pharmaceuticals | 283732 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45,112,110 | |
| Anesthesia mask | Maastricht university | custom made | |
| Midazolam | Actavis | AAAC6877 | |
| Dexmedetomidine | Orion | 141-267 | |
| Fentanyl | Bipharma | 15923002 | |
| Continuous anaesthetic induction chamber | Vet-tech solutions | AN010R |
References
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