MiRNA के मस्तिष्क विशिष्ट पछाड़ना के लिए stereotactic इंजेक्शन के लिए एक आसान विकल्प
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
MicroRNAs कारण जीन अभिव्यक्ति और रोग में भागीदारी के लिए प्रत्यक्ष प्रमाण के नियमन में उनके सार्वभौमिक भूमिका के लिए उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में उभरा है। दवा 1,2 लक्ष्य के रूप में miRNAs सक्रिय रूप से अपनी क्षमता का पता लगाया जा रहा है। इसके अलावा, miRNA अभिव्यक्ति में परिवर्तन कई रोगों 3 और miRNA अभिव्यक्ति की कृत्रिम गड़बड़ी से इन परिवर्तनों के अनुकरण के साथ जुड़े रहे रोग अभिव्यक्ति में शामिल सेलुलर रास्ते अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। MiRNA को लक्षित दवाओं के ऊतक विशिष्ट वितरण वर्तमान में miRNA आधारित दवा के विकास के लिए एक बड़ी चुनौती है। Antagomirs और miRNA mimics miRNA के स्तर 4-6 perturbing के लिए होनहार एजेंट हैं। हालांकि, उनकी विशिष्टता और प्रभावकारिता को बढ़ाने कि विशेष सुविधाओं वे miRNA अभिव्यक्ति के vivo गड़बड़ी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता से पहले antagomirs के डिजाइन में शामिल किया जाना है।
MicroRNAs विशेष रूप से प्रासंगिक हैं वर्तमान में लाइलाज neurodegenerative और न्यूरो विकासात्मक रोगों में लक्ष्य के रूप में। रक्त मस्तिष्क बाधा मस्तिष्क में antagomirs के वितरण के लिए एक प्रतिबंध बन गया है। स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन व्यापक रूप से मस्तिष्क 7 में विशिष्ट स्थानों के लिए अणुओं देने के लिए कृंतक मॉडल में इस्तेमाल कर रहे हैं। यह कौशल, उपकरण और समय में व्यापक निवेश की आवश्यकता है। स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन कम से कम मामूली चोट के कारण, सर्जरी शामिल है और स्थानीय वितरण के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं, आक्रामक हैं। लक्षित कर न्यूरॉन्स के लिए एक प्राथमिकता के साथ सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स के उपयोग वे ट्रांस-संवहनी मार्ग के माध्यम से दिया जा सकता है के बाद से इन सीमाओं का मुकाबला लेकिन रक्त मस्तिष्क बाधा को पार कर सकते हैं। रेबीज वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (RVG) से ली गई इस तरह की एक पेप्टाइड, पहले चूहों 8 में जापानी इन्सेफेलाइटिस वायरस के खिलाफ siRNA वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हम antagomir प्रसव के लिए पेप्टाइड का उपयोग कर, miRNAs प्रभावी रूप से होना माउस मस्तिष्क 9 में नीचे गिरा कर सकते हैं पाया।
ontent "> miRNA की दूसरी बड़ी चुनौती तोड़े नीचे miRNAs की छोटे आकार और बारीकी से संबंधित अनुक्रम isoforms की उपस्थिति से उठता है। हम तीन निकट से संबंधित isoforms के होते हैं जो-मीर 29 MMU परिवार का उदाहरण लेते हैं, मीर 29A न्यूक्लिक एसिड (LNAs) वे भी थर्मल स्थिरता को बढ़ाने और कहा कि एक और लाभ की पेशकश बंद कर दिया, बी और सी। Antagomirs भी आम तौर पर उनके स्थिरता बढ़ाने के लिए और न्युक्लिअसिज़ द्वारा हमला करने के लिए उन्हें प्रतिरोधी प्रस्तुत करने के लिए रीढ़ की हड्डी के साथ संशोधित कर रहे हैं। और अधिक से परे गिरावट को लक्षित करने के लिए नेतृत्व steric बाधा 10। सभी रीढ़ की हड्डी के साथ संशोधनों का परिचय प्रभावी लेकिन महंगा हो सकता है। हम पहले एक इष्टतम संख्या से परे संशोधनों के आगे प्रभावकारिता में वृद्धि नहीं हो सकता है कि देखा है। antagomir के डिजाइन इसलिए antagomir का इष्टतम संशोधन शामिल है।जटिल करने के लिए antagomir गैर covalently नोना-arginine विस्तार करने के लिए neurotropic पेप्टाइड, एक चार्ज hepta- के साथ प्रयोग किया जाता है। डी-Arginineवे प्रोटिएजों द्वारा दरार के लिए अतिसंवेदनशील नहीं कर रहे हैं के रूप में उच्च स्थिरता प्रदान के बाद अवशेषों किया जाता है। नोना-arginine हिस्सों को Hepta- वे सेल प्रकार विशिष्टता प्रदान नहीं करते हैं, हालांकि, के रूप में कुशल सेल मर्मज्ञ एजेंट काम करते हैं। Covalently नोना-arginine लिंकर, एक neurotropic, सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड उत्पन्न किया गया था करने के लिए RVG पेप्टाइड जोड़ने के द्वारा। पेप्टाइड की सकारात्मक आरोप लगाया अवशेषों परिसरों के लिए फार्म, नकारात्मक आरोप लगाया न्यूक्लिक एसिड रीढ़ की हड्डी के साथ बातचीत। इन परिसरों को प्रभावी ढंग से संवर्धित कोशिकाओं में और ऊतकों में विवो में डीएनए या आरएनए transfect करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
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