Summary
واميلويد β (Aβ) -injected نموذج حيواني تمكن الإدارة من كمية وأنواع من شظايا Aβ محددة ويقلل الفروق الفردية داخل كل مجموعة الدراسة. يصف هذا البروتوكول حقن intracerebroventricular (ICV) من Aβ دون أدوات المجسم، مما يتيح للإنتاج الانحرافات السلوكية الزهايمر تشبه في الفئران العادية.
Introduction
وبالنظر إلى أن اميلويد β (Aβ) هي السمة المميزة المرضية لمرض الزهايمر (م)، وقد ركزت على تطوير نماذج حيوانية م على overexpression العصبي للAβ. بسبب طفرات في بروتين اميلويد السلائف (APP) أو presenilin (PS) يؤدي إلى اضطراب في التوازن Aβ وفي نهاية المطاف إلى التسبب في العائلي 1 م، نماذج الماوس التي تنطوي على APP أو PS الطفرات الجينية تم المقبولة عموما. من بين مجموعة واسعة من الفئران المعدلة وراثيا، وتشمل نماذج الماوس نموذجية ما يلي: TG2576، PDAPP، APP / PS1 وAPP23. في الدماغ، هذه الفئران تظهر عادة تجميع Aβ لويحات خرف في نهاية المطاف. ويتبع تشكيل لوحة من الضعف الادراكي كبير بحيث أنها تظهر ضعف الأداء في الاختبارات السلوكية في التعلم والذاكرة. وهكذا ساهمت توليد باستخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تحاكي بشكل طبيعي علم الأمراض AD الإنسان في مجتمع البحث AD من خلال السماح لنا لرصد التقدم من ديsease. ومع ذلك، باستخدام الفئران المعدلة وراثيا غير اقتصادية وتستغرق وقتا طويلا لأنه يستغرق شهورا للفئران لتطوير لويحات Aβ وحتى وقتا أطول لتظهر متشابك الناجم عن Aβ أو الانحرافات السلوكية 2،3. وضعت أصلا كبديل للتغلب على أوجه القصور في نماذج الفئران المعدلة وراثيا، كما تستخدم نماذج غير المعدلة وراثيا عادة بسبب مزاياها متميزة. نماذج AD-الناجم عن العوامل المسببة للأمراض يمكن أن تنتج عن طريق الحقن المباشر للAβ في الدماغ، في حين يمكن أيضا أن تسبب العجز المعرفي مثل م من قبل الكيميائية والفيزيائية وسائل أخرى مثل الحقن المركبات السمية العصبية مثل سكوبولامين، تحريض الآفات في المجالات ذات الصلة الإدراك مثل الحصين، أو الضرر القشرية 4. ومع ذلك، لا تعكس تحريض غير المسببة للأمراض من الضعف الادراكي بدقة الفيزيولوجيا المرضية الأساسي للم. بدلا من ذلك، فإنه يحاكي فقط نتائجها الأعراض. في المقابل، نموذج AD-الناجم عن العوامل المسببة للأمراض، وهناك46؛ نموذج الفأر -injected، لا يمكن إلا أن تظهر الانحرافات السلوكية مثل م ولكن يمكن أيضا يحمل علم الأمراض Aβ، الميزة المشتركة بين العائلي ومتفرقة م.
وعلى الرغم من صعوبة تصور لويحات Aβ في أنسجة المخ، أكبر فائدة من طراز حقن Aβ أن يجعلها جذابة للتحقيق م هي التحكم فيها. يمكن للباحثين تخلص من الفروق الفردية في نماذج الفئران يمكن أن يؤدي إلى بيانات خاطئة في الدراسات المتعلقة بالمخدرات. يتم تمكين العلاج من تعاطي المخدرات في الوقت المناسب اعتمادا على آلية للعقار مرشح. أن تضع، يمكن تطبيق المانع من Aβ التجميع قبل حقن Aβ. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمحققين أن نفترض أن تحول الممرض الذي يطرح نفسه بعد حقن Aβ مشتق من التعرض Aβ لأن العوامل الأخرى لرقابة مشددة، بما في ذلك الفروق الفردية.
في هذا البروتوكول، وصفا حيا من حآه للحث على النمط الظاهري مثل م في الفئران العادية عبر Aβ intracerebroventricular (ICV) حقن بدون الات المجسم يرد. تقليل الضرر الناجم عن أنشطة الإدراج إلى أنسجة المخ ضروري لمنع احتمال الضرر الهيكلي والتهاب الناجم عن الآفة. وعدم وجود مهارة في التعامل مع الماوس يؤدي إلى الإصابة العصبية غير متوقعة. وعلاوة على ذلك، والتقنيات التي تمكن من زاوية وعمق المناسبة لتحقيقها خلال حقن ذات أهمية خاصة للتحايل على الأخطاء المتكررة. وبالإضافة إلى ذلك، شرح حية مفصل لحقن ICV، ويتضح أن الاعتماد على نموذج التي تنتجها بروتوكول التالي أيضا في الأقسام التالية. بروتوكول التالية يمكن أن تكون أداة موثوقة وسهلة الفهم الذي يسهم في البحوث م، وبالتالي توفير وسيلة للتقدم التي يمكن أن تؤدي في نهاية المطاف إلى اكتشاف معنى للمجتمع الميلادي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمعاهد القومية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (NIH النشر رقم 8023، منقحة 1978) ومع لجنة رعاية واستخدام الحيوان لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية كيغالي (سيول، كوريا).
1. إعداد الحيوان
- إعداد مجموعة من الذكور الفئران مجلس النواب البالغ من العمر 7 أسابيع (أو C57BL / 6).
- السماح الفئران تذهب من خلال عملية التأقلم لمدة 3-7 أيام بعد النقل لاستعادة التوازن. بشكل عام، وضع مجموعة من 4-5 الفئران في كل قفص والمحافظة عليها في 22-23 درجة مئوية و 40٪ الرطوبة، مع 12/12 ساعة دورة الضوء / الظلام. توفير الماء والغذاء الإرضاع بحسب الرغبة.
ملاحظة: عملية التأقلم أمر بالغ الأهمية للسماح التعافي من الإجهاد الشحن والتكيف في السكن الجديد، والغذاء، والمياه، ورائحة وكذلك قفص جديد ودورة الخفيفة. في هذه التجربة، تم إيواء الفئران في اقفاص التهوية بشكل فردي (IVCs) الواقعة في جمعية مهندسي البترولcific الممرض الحرة (SPF) منشأة -grade - وزن كل فأر واستبعاد المواد التي ينحرف ± 10٪ من متوسط الوزن.
- تقسيم الموضوعات إلى مجموعتين: مجموعة حقن سيارة (Aβ (-)) والمجموعة التي حقنت Aβ (Aβ (+)). إذا كانت التجربة هي لاختبار فعالية من عقار مرشح معين، تقسيم الفئران إلى أربع مجموعات هي: (1) Aβ (-) / المخدرات (-)، (2) Aβ (-) / المخدرات (+)، (3) Aβ (+) / المخدرات (-)، و (4) Aβ (+) / المخدرات (+).
2. إعداد الببتيد Aβ
- علاج الببتيد Aβ، والمستمدة من خلال التركيب الكيميائي 5 أو من مصادر تجارية، مع قبل المبردة 1،1،1،3،3،3-hexafluoro-2-بروبانول (HFIP) بحل أي وحدات العمل ولجعل الببتيدات متجانسة 6 .
- يصوتن الحل Aβ / HFIP في sonicator حمام مائي لمدة 5 دقائق (في RT)، بلطف دوامة، واحتضان الحل لمدة 30 دقيقة في RT. إزالة HFIP تماما عن طريق التبخر مع النيتروجينوتخزين Aβ متجانسة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد مونومرات Aβ: (100 ميكرومتر Aβ، 10٪ DMSO، و 90٪ PBS) جعل 1 ملي Aβ ثنائي ميثيل سلفوكسيد الأسهم ([دمس])، وتمييع 10 أضعاف في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)
- إعداد الأوليغومرات Aβ.
- احتضان حل مونومر Aβ (التي تحتوي على Aβ (1-42) أو Aβ (1-40)) (الخطوة 2.2) عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أو 7 أيام، على التوالي.
- وضع حل Aβ في أنبوب مختومة في كيس انغلق تحتوي على منشفة ورقية مبللة لتوفير بيئة ترطيب لمنع تبخر المياه خلال فترة الحضانة.
- تأكيد الأوليغومرات Aβ مستعدة عبر دوديسيل الصوديوم وكبريتات إس دي إس بايج (SDS-PAGE) مع الصورة التي يسببها عبر ربط بروتينات معدلة 6.
- إعداد برنامج تلفزيوني حل التحكم التي تحتوي على 10٪ DMSO لحقن ICV السيارة.
3. إعداد الحقنة
ملاحظة: سوف ضغط من بارافيلم يؤدي إلى عمق حقن تزيد على 3.6 ملم بطني. لمنع بارافيلم من يتم ضغطها أثناء إدخال الإبرة، المكتظة التفاف إبرة عدة مرات.
4. حقن Aβ ماوس إعداد نموذج
ملاحظة: تنظيف ميدان التشغيل مع مطهر للحفاظ على ظروف معقمة وتعقيم جميع الأدوات الجراحية لحقن ICV باستخدام الايثانول 70٪ والتعرض للأشعة فوق البنفسجية.
- تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من خليط من زيلازين (20 ملغ / كلغ) وتلييتامين · حمض الهيدروكلوريك / zolazepam · حمض الهيدروكلوريك (80 ملغ / كلغ) قبل الحقن ICV. ضع الماوس على حصيرة الدافئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم في حين تخدير وتأكيد التخدير الكافي من خلال تقييم استجابة القدم قرصة.
- تطبيق برنامج تلفزيوني العقيمة قطرات لكلتا العينين لمنع جفاف القرنية أثناء العملية (الشكل 1B).
- إعداد اثنين من المرايا عن طريق رسم متعددة الخطوط المستقيمة الرأسية على سطوحها في حالة difficuLTY حقن حقنة عموديا.
- وضع مرآة واحدة (M1) بجوار جسم الفأر والآخر (M2) في مقدمة الرأس. الحفاظ M1 بالتوازي مع خط الوسط وهمي بين عينيه من الفأرة وترتيب M2 عمودي على M1، حتى أن الطائرتين تشكل زاوية 90 درجة (الشكل 1C). وضع M1 على الجانب الأيسر من الفأرة إذا كان الباحث هو اليد اليمنى. وضع M1 على الجانب الأيمن من الفأرة إذا أعسر الباحث.
- رذاذ الايثانول 70٪ على منتصف الجبهة من الفأرة وفرك مع قطعة قطن جافة. لا تبلل كبيرة جدا من مساحة الجبين لتجنب خفض درجة حرارة الجسم بسبب التبخر من الكحول.
- مسح المنطقة نفسها على الجبهة مع 2٪ محلول الكلورهيكسيدين باستخدام قطعة قطن نظيفة. كرر scrubbings مع الكحول وchlorohexidine لمجموعه ثلاث مرات لكل منهما.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، حلاقة الشعر على الجبين من الفأرة من أجل تقليل possiبيليتي من التلوث - تحديد موقع bregma.
- باستخدام الإبهام والسبابة، وعقد بإحكام أسفل الجلد في الجبين، مباشرة فوق اثنين العينين إلى درجة أن تبرز كلتا العينين. سحب الجلد مرة أخرى إلى جعل جبهته مشدود وتقليل الحركات الجمجمة تحت الجلد.
- تشكيل مثلث غير مرئية عن طريق تعيين ثلاثة رؤوس: اثنان أعين من الفأرة ونقطة حيث الإبهام والسبابة لقاء، وbregma. (أرقام 1B، أحمر السهم: bregma)
- تحديد موقع نقطة حقن مع شريط قياس: -1.0 ± 0.06 ملم الخلفي إلى bregma، 1.8 ± 0.1 مم الجانبي لالدرز السهمي، و 2.4 ملم في العمق (1D الشكل، النجوم الزرقاء: نقاط حقن في كل نصف الكرة الأرضية). (بالنسبة للفئران B6: -0.9 مم الخلفي، 1.7 مم الجانبية، و 2.2 ملم في العمق)
- ملء الحقنة مع 10 ميكرولتر حل Aβ أو مركبة مع حل الزائد من أجل تجنب حقن الهواء بطريق الخطأ.
- وضع حقنة في عشرنقطة حقن ه (كما هو موضح في بروتوكول 4.7). جعل حقنة عمودي على الطائرة من نقطة الحقن. ينعكس محاذاة الصور من الحقنة في كل من المرايا مع الخطوط المرسومة على المرايا من منظور ثابت (الشكل 1C).
- بدء إدخال الإبرة حتى يصل إلى التفاف بارافيلم الجلد.
- الحفاظ على حقنة جهة عقد ثابت واستخدام اليد الأخرى لحقن 5 ميكرولتر من حل Aβ أو مركبة، ببطء على مدى 5 ثانية دون التوقف. تأكد من تبقى حقنة عمودي طوال الوقت. بعد الانتهاء من الحقن، وانتظر 3-5 ثانية قبل إزالة حقنة لنشرها.
- وإذا افترضنا أن موقف مثلث الأصلي، الضغط المعتدل لحماية الجمجمة من أي تحركات غير ضرورية. إزالة حقنة دون إمالة.
- ضع الماوس حقن Aβ على وسادة دافئة لاستعادة والحفاظ على الاستلقاء على القصية. لا تترك الماوس غير المراقب حتى يستعيد وعيه ولا يعودون م[أوس] إلى قفص يحتوي على الفئران غير الجراحية حتى تعافى تماما.
- غسل حقنة وفقا لخطوات 3،3-3،6.
- مراقبة بعد العمل الجراحي التنقل من الفئران والتحقق من وجود أي علامة على الإصابة أو المرض في الفئران لمدة 5-7 أيام.
الشكل 1. Aβ حقن في المنطقة ICV (A) إبرة حقنة ملفوفة بارافيلم-مقارنة مع إبرة حقنة معدلة؛ (ب) برنامج تلفزيوني يسقط على العينين لمنع جفاف. المثلث على جبين الفأر مع الإبهام، السبابة، وعيون اثنين من الماوس، فضلا عن خط الوسط وهمي على مسافة واحدة من كل عين. (C) اثنين من المرايا (M1 و M2) مع خطوط عمودية متعددة رسمها على السطوح لمساعدة عمودي حقن إبرة حقنة. (د) مثلث مع نقاط حقن، الهنديةATED من النجوم الزرقاء (-1.0 ± 0.06 ملم من bregma و 1.8 ± 0.1 مم sagittally) على كل الكرة الأرضية من الماوس. الأخضر السهم: بارافيلم، السهم الأحمر: bregma الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. تأكيد Aβ حقن بواسطة Y-متاهة وتحليلات الدماغ
- تقييم الذاكرة التي تعمل لدى الفئران المحقونة Aβ من قبل الاختبارات Y-متاهة 3،7،8
- انتظر 3 أيام بعد الحقن لظهور العجز في الذاكرة.
- أداء الاختبارات Y-متاهة باستخدام متاهة بلاستيكية سوداء مع ثلاثة الأسلحة متطابقة المسمى A، B، و C، ولكل منها فروع خارج على 120 درجة زاوية من وسط المتاهة (العرض × الارتفاع × طول، 10 سم × 40 سم × 12 سم).
- ضع الماوس في بداية ذراع (الذراع أ) ويسمح هذا الموضوع لاستكشاف بحرية المتاهة لمدة 8 دقائق.
- قياس عدد الإدخالات في كل ذراع وحساب alternمعدل أوجه كل موضوع 3،9.
- دراسة مباشرة العقول بعد الوفاة لمعرفة ما اذا كان يستهدف حقن المنطقة ICV بشكل مناسب.
- تخدير الماوس عن طريق نفس الإجراء على النحو المبين في القسم 4.1. ثم التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
- قطع رأس الماوس وإزالة الجلد لفضح الجمجمة باستخدام مقص جراحي. إزالة أنسجة وعضلات من الجمجمة.
- إجراء تخفيضات على الدرز اللامي (بين جداري والعظام الجداريين) دون الإضرار الدماغ. إزالة القذالي والعظام الجداريين، ثم جداري والعظام الأمامية. إزالة العظام في الجمجمة باستخدام ملقط وعزل الدماغ من الجمجمة عن طريق رافعين السحايا.
- غسل الدماغ في ملحي معقم المبردة وقطع المنطقة ICV من الدماغ في اتجاه الاكليلية بسكين الجراحة (الشكل 2).
- تأكيد المنطقة حقن استنادا إلى أثر للإبرة علىأنسجة المخ (الشكل 2). تحقق مما إذا كان أثر إبرة وصلت واحدة من البطينين. إذا لم تتبع إبرة تلبي أو تمر من خلال البطينين، واستبعاد بيانات هذا الموضوع من تحليل النتائج التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح هذا القسم أمثلة من النتائج التي يمكن الحصول عليها عن طريق تأكيد Aβ تجميع وتقييم Y-متاهة من العجز في الذاكرة. باستخدام كامل طول Aβ كانت تنتج (1-42) الببتيد من 42 الأحماض الأمينية، وخليط من مونومرات Aβ، الأوليغومرات، والألياف (الشكل 3). من خلال خطوة monomerization الناجم عن HFIP، تم الحصول على أحادية متجانسة نسبيا (لين B). بعد الحضانة 7 أيام، وأحجام متنوعة من المجاميع Aβ (لين C) وضعت. كانت Trimers وtetramers الأنواع السائدة بين أشكال بلازميدة قليلة القسيمات من Aβ. تم تقييم عمل الذاكرة المكانية في الفئران المحقونة Aβ عبر التناوبات في اختبار Y-المتاهة. وسجلت سلسلة من الخيارات الذراع وإجمالي عدد الإدخالات الذراع بينما سمح لكل الماوس لاستكشاف بحرية المتاهة. أكثر سليمة والقدرة الإدراكية، يجب أن يكون أكثر الماوس ميل لدخول أقل زار مؤخرا الذراع، العبوة البديلةrnating اختيار ذراعها. أظهرت مجموعة الماوس حقن Aβ أقل بكثير معدلات التداول، مما يدل على تطور العجز المعرفي (الشكل 4).
الشكل 2. أمثلة من الحقن ICV (A) رسم توضيحي لأقسام الدماغ في الاتجاه الاكليلية يمثل موقع bregma 10 ومجموعة حقن مقبول (-1.0 ± 0.06 ملم من bregma و 1.8 ± 0.1 مم sagittally). (B - C) حالة نجاح الحقن ICV (B: عرض الجزء العلوي من الدماغ كله، C: قسم الاكليلية تبين البطينات الجانبية مليئة صبغة زرقاء)؛ (D - E) حالة حقن ICV ناجحة (D: عرض الجزء العلوي من الدماغ كله، E: قسم الاكليلية تظهر الثالث والرابع هاء ntricles مليئة صبغة زرقاء) دائرة زرقاء والسهم: حقن الموقع، بلو ستار: نقطة حقن المحتملة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. التأكيد من إعداد الأنواع بيتا عبر SDS-PAGE. تم فصل الببتيد Aβ بواسطة SDS-PAGE مع الصورة التي يسببها عبر ربط بروتينات معدلة. وتصور العصابات الببتيد من تلطيخ الفضة. حارة (أ) البروتين علامة، حارة (ب) Aβ مونومر (قبل الحضانة)، وحارة (C) الأنواع Aβ المحتضنة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ف together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 4. Y-متاهة الاختبارات السلوكية. المئة التناوب على Aβ- أو مجموعة الفئران التي حقنت السيارة على اختبار Y-المتاهة. الرسم البياني الأبيض الصلبة: سيارة (Aβ (-)، ن = 10). مخطط الرسم البياني: Aβ حقن (Aβ (+)، ن = 9). تم إجراء التحليلات الإحصائية مع اتجاه واحد أنوفا تليها المقارنات بعد خاصة بونفيروني ل(* P <0.05، ** P <0.01، *** P <0.001). أشرطة الخطأ تمثل محترفو التسويق عبر محركات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أهم خطوة في هذا البروتوكول هو حقن ICV من Aβ. تم تصميم هذا البروتوكول لحقن Aβ في المنطقة ICV من الفئران بدون الات المجسم 11،12. قبل بدء التجربة، يجب أن فترة أولية من الحقن الممارسة مع صبغة زرقاء بدلا من Aβ تتم لتحقيق البراعة الكافية. مباشرة بعد الحقن، فمن الضروري للتحقق ما إذا تم إجراء حقن الصبغة بشكل صحيح. تأخذ بعناية الدماغ وتحقق ما إذا كانت المنطقة مناسبة ومصبوغة باللون الأزرق. خط المصطبغة ينبغي أن تصل، ولكن لا تتجاوز، في عمق المنطقة ICV. وهناك حد أدنى من نسبة نجاح 90٪، وهو ما يتحقق عادة بعد 50 أو أكثر من الحقن ICV، ويقترح. خلال حقن ICV، تجنب إتلاف الأوعية الدموية عن طريق حقن الجيب السهمي (على مقربة من bregma نقطة الصفر).
بعد حقن Aβ، وضعف الذاكرة ذات دلالة إحصائية مراقبةد بين المجموعة التي حقنت Aβ والمجموعة الضابطة باستخدام Y-المتاهة الاختبارات السلوكية. أنواع مختلفة من التجارب السلوكية يمكن تطبيقها لاختبار درجة من الضعف الادراكي، مثل الماء موريس المتاهة 13، التعرف على الأشياء، واختبارات تجنب السلبية وكذلك تكييف الخوف. ويستخدم متاهة موريس المائية لدراسة الحصين العجز في الذاكرة المكانية، في حين يستخدم تكييف الخوف لاختبار التعلم النقابي تعتمد على الحصين والاتصالات اللوزة الحصين. الاعتراف كائن من كائن واحد بعينه هو مناسبة لقياس ضعف القوى المعرفية المتعلقة الميلادي، وتجنب السلبي يمكن استخدامها لاختبار قدرة الحيوان على تذكر التحفيز مكره 3. من المهم إعداد الفئران من الوزن والعمر مماثل إذا كانت ستخضع لاختبارات سلوكية باستخدام الصدمات الكهربائية، مثل تكييف الخوف والاختبارات تجنب السلبية. فمن المستحسن أن الاختبارات المذكورة أعلاه هي التي يتعين القيام بهافي غضون 10 يوما من ظهور العجز في الذاكرة. منذ تأكيد أن Aβ وجدت في حقن الحصين بعد ICV 14، هناك ما يبرر اجراء مزيد من التحقيقات للعثور على الاختبارات السلوكية التي تشمل مناطق أخرى من الدماغ مع تقارب من Aβ حقن ICV.
إعداد الببتيد Aβ وتوقيت الحقن ICV يجب أن تكون مصممة بعناية تبعا للغرض التجريبي، ويجب أن تتضمن النظر في: (1) نوع من Aβ (أحادية، الأوليغومرات، الألياف، أو خليط)؛ (2) الإسوي من Aβ (Aβ40، Aβ42، اقتطاع Aβ25-35، وغيرها) 15-18. (3) نقاط وقت حقن Aβ. و (4) والفارق الزمني بعد التعرض Aβ. على سبيل المثال، ينصح حقن مونومرات Aβ إذا كان سيتم إخضاع الفئران لإدارة الأدوية التي تمنع الأنشطة غير طبيعية من مونومرات Aβ، مثل التجميع. حقن الأوليغومرات Aβ القابلة للذوبان هو suggesteد إذا وتهدف هذه الدراسة إلى تقييم السمية العصبية أو التهاب الناجمة عن الأوليغومرات. ينصح حقن الأنواع Aβ المجمعة للغاية إذا يهدف إلى دراسة غير قابلة للذوبان Aβ وعلم الأمراض ذات الصلة 7،19. فإذا كان هدف التجربة لاختبار فاعلية مثبطات تجميع Aβ، ينبغي عموما أن تطبق المجمع من قبل، أو جنبا إلى جنب مع وAβ، في حين أن وكلاء Aβ إزالة أو المركبات المضادة للالتهابات وينبغي أن تدار بعد حقن Aβ.
مقارنة المعدلة وراثيا أو نماذج المزمنة م، نموذج الفأر حقن Aβ يسمح للباحثين للسيطرة على تركيز Aβ، بداية من الظواهر مثل م، ووضع في وقت واحد من عدد كبير من الفئران الجنونية. توفر هذه الفوائد حرية فيما يتعلق التصميم التجريبي ومجموعة واسعة من الفرص للباحثين. وبالنظر إلى التسبب في AD الأكثر ارتباطا التعرض المزمن بدلا من الزيادة المفاجئة في A &# 946؛ ، فمن المستحسن التركيز في الدماغ تجارب إضافية باستخدام النماذج المعدلة وراثيا لتعزيز النتائج المستخلصة من استخدام نماذج الماوس حقن Aβ. بالإضافة إلى ذلك، منذ بروتين تاو هو سبب رئيسي آخر للم، ووضع تاو وAβ نماذج حقن الفئران قد يواصل دفع المجتمع البحوث م.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من خلال منحة من كوريا صحة التكنولوجيا R & D المشروع من خلال معهد صناعة الصحة الكورية للتنمية (KHIDI)، بتمويل من وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية، وجمهورية كوريا (رقم المنحة: H14C04660000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 27-29 g of body weight | |
| C57BL/6 mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 21-23 g of body weight | |
| Amyloid-beta1-42 | in house synthesis | stock concentration: 1 mM/DMSO, injected concentration: 100 μM/10% DMSO and 90% PBS | |
| ICV injection syringe (26s gauge) | Hamilton | 80308 | |
| Evans blue dye (EBD) | abcamBIochemicals | ab120869 | 1% EBD in PBS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| PBS | gibco | 10010-023 | |
| Gradi-GelTM II Gradient PAGE Analysis Kit | ELPiS Biotech | EBS-1056 | 15% Gel |
| Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards | Bio-Rad | 161-0377 | |
| Silver-Staining Kit | GE-Healthcare | 17-1150-01 | |
| LabDiet | Orientbio | 5053 |
References
- Kam, T. I., Gwon, Y., Jung, Y. K. Amyloid beta receptors responsible for neurotoxicity and cellular defects in Alzheimer's disease. Cell Mol Life Sci. 71, 4803-4813 (2014).
- Elder, G. A., Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R. Transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Mt Sinai J Med. 77, 69-81 (2010).
- Bryan, K. J., Lee, H., Perry, G., Smith, M. A., Casadesus, G. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience Frontiers in Neuroscience. Buccafusco, J. J. , (2009).
- Van Dam, D., De Deyn, P. P. Animal models in the drug discovery pipeline for Alzheimer's disease. Br J Pharmacol. 164, 1285-1300 (2011).
- Choi, J. W., Kim, H. Y., Jeon, M., Kim, D. J., Kim, Y. Efficient access to highly pure beta-amyloid peptide by optimized solid-phase synthesis. Amyloid. 19, 133-137 (2012).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides. J Vis Exp. , (2009).
- Kim, H. V., et al. Amelioration of Alzheimer's disease by neuroprotective effect of sulforaphane in animal model. Amyloid. 20, 7-12 (2013).
- Jackson, L. L. VTE on an elevated T-maze. J Comp Psychol. 36, 9 (1943).
- Kim, H. Y., et al. Taurine in drinking water recovers learning and memory in the adult APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease. Sci Rep. 4, 7467 (2014).
- Paxinos, G., Franklin, B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2nd edn. , Academic Press. (2001).
- Ledo, J. H., et al. Amyloid-beta oligomers link depressive-like behavior and cognitive deficits in mice. Mol Psychiatry. 18, 1053-1054 (2013).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. J Pharmacol Methods. 16, 355-357 (1986).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. J Vis Exp. , (2011).
- Figueiredo, C. P., et al. Memantine rescues transient cognitive impairment caused by high-molecular-weight abeta oligomers but not the persistent impairment induced by low-molecular-weight oligomers. J Neurosci. 33, 9626-9634 (2013).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. Br J Pharmacol Chemother. 12, 12-15 (1957).
- Harkany, T., et al. Neuroprotective approaches in experimental models of beta-amyloid neurotoxicity: relevance to Alzheimer's disease. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 23, 963-1008 (1999).
- Wang, D., et al. The allosteric potentiation of nicotinic acetylcholine receptors by galantamine ameliorates the cognitive dysfunction in beta amyloid25-35 i.c.v.-injected mice: involvement of dopaminergic systems. Neuropsychopharmacology. 32, 1261-1271 (2007).
- Yamada, K., Nabeshima, T. Animal models of Alzheimer's disease and evaluation of anti-dementia drugs. Pharmacol Ther. 88, 93-113 (2000).
- Cho, S. M., et al. Correlations of amyloid-beta concentrations between CSF and plasma in acute Alzheimer mouse model. Sci Rep. 4, 6777 (2014).
