Summary
O amilóide-β (Ap) -injected modelo animal permite a administração de uma quantidade e espécie de fragmentos de Ap definidos e reduz as diferenças individuais dentro de cada grupo de estudo. Este protocolo descreve a injecção intracerebroventricular (ICV) de Ap sem instrumentos estereotáxicas, permitindo a produção de anormalidades comportamentais Alzheimer-like em ratinhos normais.
Introduction
Dado que amilóide-β (Ap) é uma característica patológica da doença de Alzheimer (AD), o desenvolvimento de modelos animais AD tem incidido sobre a superexpressão neural de Ap. Por causa mutações na proteína precursora de amilóide (APP) ou presenilina (PS) levar a distúrbios de Ap equilíbrio e, finalmente, para a patogênese da familial AD 1, modelos de ratos que envolvem mutações no gene APP ou PS foram geralmente aceite. Entre o vasto leque de ratinhos transgénicos, modelos de ratinho prototípicas incluem o seguinte: Tg2576, PDAPP, APP / PS1 e APP23. No cérebro, estes ratinhos apresentam geralmente agregação de Ap e, eventualmente, as placas senis; formação de placas é seguido por comprometimento cognitivo significativo de tal forma que eles mostram um fraco desempenho em testes comportamentais de aprendizagem e memória. A geração de usar camundongos transgênicos que, naturalmente, imitar AD patologia humana contribuiu, assim, para a sociedade AD pesquisa, permitindo-nos para monitorar a progressão da diSease. No entanto, utilizando ratinhos transgénicos não é económico e demorado porque leva meses para que os ratos desenvolvem placas de Ap e ainda mais tempo para mostrar sináptica induzida com Ap ou anormalidades comportamentais 2,3. Originalmente desenvolvido como uma alternativa para ultrapassar as deficiências dos modelos de ratinho transgénicos, modelos não transgénicas são também vulgarmente utilizado devido às suas vantagens distintas. modelos AD induzida pelo agente patogénico pode ser produzida através da injecção directa de Ap no cérebro, ao passo que os défices cognitivos ad como também pode ser desencadeada por outras químicas e físicas meios, tais como a injecção de compostos neurotóxicos como a escopolamina, a indução de lesões em áreas relacionadas com a cognição, como o hipocampo, ou por danos cortical 4. No entanto, a indução não patogênico de comprometimento cognitivo não reflete com precisão a fisiopatologia fundamental da AD; em vez disso, ele só imita seus resultados sintomáticos. Em contraste, um modelo de AD induzida pelo agente patogénico, o A46; modelo -injected rato, não só pode mostrar anormalidades comportamentais AD-like, mas também podem apresentar patologia Aâ, a característica comum compartilhada por AD familiar e esporádica.
Apesar da dificuldade para visualizar as placas de Ap no tecido cerebral, o maior benefício do modelo com injecção de Ap, que faz com que seja atraente para investigação AD é a sua controlabilidade. Pesquisadores podem eliminar as diferenças individuais em modelos de ratos que podem levar a dados errados nos estudos relacionados com a droga. tratamento medicamentoso oportuna é activado dependendo de o mecanismo da droga candidata; para elaborar, um inibidor de agregação de Ap pode ser aplicada antes da injecção de Ap. Além disso, os investigadores podem assumir que a transformação patogénico que surge após a injecção Ap é derivada da exposição Ap porque os outros factores sejam estritamente controladas, incluindo diferenças individuais.
Neste protocolo, uma vívida descrição de how para induzir um fenótipo AD-como em ratos normais via Ap intracerebroventricular injecção (ICV) sem instrumentos estereotáxica é apresentado. Minimizando os danos provocados-inserção para o tecido cerebral é essencial para evitar a possibilidade de danos estruturais e a inflamação induzida pela lesão. A falta de habilidade no manuseio do mouse leva à lesão neuronal inesperado. Além disso, as técnicas que permitem o ângulo e profundidade adequada para ser alcançado durante a injecção são especialmente importantes para contornar erros frequentes. Em adição a uma explicação detalhada, vivas da injecção ICV, a fiabilidade do modelo produzido pelo seguinte protocolo é também ilustrado nas secções seguintes. O protocolo a seguir poderia ser uma ferramenta confiável e de fácil compreensão que contribua para a investigação AD, proporcionando assim um degrau que poderia levar a uma descoberta significativa para a sociedade AD.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publicações No. 8023, revisto 1978) e com o Comitê de Cuidado e Uso do animal do Comitê Cuidado e Uso Institucional animal de KIST (Seul, Coréia).
1. Preparação de animais
- Prepara-se uma grupo de ratinhos ICR machos com 7 semanas de idade (ou C57BL / 6).
- Deixe os ratos passam por um processo de aclimatação para 3-7 dias após o transporte para restaurar a homeostase. Em geral, colocar um grupo de 4-5 ratos em cada gaiola, e mantê-las a 22-23 ° C e 40% de humidade, com um 12/12 h ciclo de luz / escuro. Fornecer água e comida ad libitum.
Nota: O processo de aclimatação é fundamental para permitir a recuperação do stress da navegação e adaptação à nova moradia, alimentação, água e cheiro, bem como uma nova gaiola e ciclo de luz. Nesta experiência, os ratinhos foram alojados em gaiolas individualmente ventiladas (IVCS) localizados na SPEespe- Pathogen Free (SPF) instalação -grade - Pesar cada mouse e excluir indivíduos cujo peso se desvia ± 10% da média.
- Divida os participantes em dois grupos: um grupo com injecção de veículo (Ap (-)) e um grupo de Ap-injetada (Ap (+)). Se a experiência é testar a eficácia de um fármaco candidato particular, dividir os ratos em quatro grupos: (1) Ap (-) / fármaco (-), (2) Ap (-) / droga (+), (3) Ap (+) / fármaco (-), e (4) Ap (+) / droga (+).
2. Ap Peptide Preparação
- Tratar os peptídeos Ap, derivados através de síntese química ou 5 a partir de fontes comerciais, com pré-refrigerada 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para dissolver quaisquer agregados e para tornar os péptidos homogéneas 6 .
- Sonicar a solução Ap / HFIP num sonicador de banho-maria durante 5 min (a temperatura ambiente), gentilmente vórtice, e incubar a solução durante 30 min à TA. Remover o HFIP completamente por meio de evaporação com azotoe armazenar o Ap homogénea à temperatura de -80 ° C até à sua utilização.
- Prepare os monómeros de Ap: (. 100 uM Aâ, 10% de DMSO, 90% de PBS) fazer um estoque Ap mM dimetilsulfóxido (DMSO) e diluir 10 vezes em tampão fosfato salino (PBS)
- Prepare oligômeros de Ap.
- Incubar a solução de monómero de Ap (contendo Ap (1-42) ou de Ap (1-40)) (passo 2.2.) A 37 ° C durante 3 ou 7 dias, respectivamente.
- Coloque a solução de Ap num tubo selado num saco de zíper contendo uma toalha de papel húmido para proporcionar um ambiente humidificado para evitar a evaporação de água durante o período de incubação.
- Confirmar Ap oligómeros preparados por meio de electroforese em dodecil sulfato de sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) com ligação cruzada foto-induzido de proteínas não modificadas 6.
- Preparar a solução de PBS de controlo contendo 10% de DMSO para a injecção ICV veículo.
3. Seringa Preparação
Nota: A compressão do Parafilm conduzirá à profundidade da injecção superior a 3,6 milímetros ventral. Para evitar que o Parafilm de ser comprimida durante a inserção da agulha, densamente envolver a agulha várias vezes.
4. Ap-injetada mouse Preparação Modelo
Nota: Limpar o campo operacional com um desinfectante para manter condições estéreis e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos para injecção ICV usando 70% de etanol e exposição aos raios UV.
- Anestesiar o rato através de injecção intraperitoneal de uma mistura de xilazina (20 mg / kg) e tiletamina HCl / zolazepam HCl (80 mg / kg) antes da injecção ICV. Posicione o mouse sobre um tapete quente para manter a sua temperatura corporal, enquanto anestesiados e confirmar anestesia adequada, avaliando a resposta do pé-pitada.
- Aplicar PBS estéril cai para ambos os olhos para evitar a secura da córnea durante o procedimento (Figura 1B).
- Prepare dois espelhos desenhando várias linhas retas verticais em suas superfícies em caso de difficuLTY injectando a seringa perpendicularmente.
- Coloque um espelho (M1) mesmo ao lado do corpo do mouse eo outro (M2) na frente da cabeça. Manter M1 paralela à linha média imaginária entre os dois olhos do rato e providenciar a M1 M2 perpendicular, de modo que os dois planos formam um ângulo de 90 ° (Figura 1C). Coloque M1 no lado esquerdo do mouse se o pesquisador é destro. Coloque M1 no lado direito do mouse, se o pesquisador é canhoto.
- Spray de etanol a 70% para o meio da testa do mouse e esfregue-o com cotonetes secos. Não molhar muito grande de uma área da testa para evitar a diminuição da temperatura do corpo devido a evaporação do álcool.
- Limpe a mesma área na testa com uma solução de clorexidina a 2% utilizando um cotonetes limpos. scrubbings repetida com álcool e de cloro para o total de três vezes cada.
Nota: Se necessário, raspar o cabelo na testa do mouse, a fim de minimizar a possidade de contaminação - Localize bregma.
- Usando o polegar eo dedo indicador, firmemente mantenha a pele da testa, logo acima dos dois olhos, a ponto de ambos os olhos salientes. Arraste a pele de volta para fazer a testa tenso e minimizar os movimentos do crânio sob a pele.
- Formar um triângulo invisível através da atribuição de três vértices: os dois olhos do rato e do ponto onde o polegar eo dedo indicador se encontram, o bregma. (Figuras 1B, seta vermelha: bregma)
- Localizar o ponto de injecção com fita de medição: ± 0,06 -1,0 mm posterior ao bregma, 1,8 mm lateral ± 0.1 para a sutura sagital, e 2,4 mm de profundidade (Figura 1D, estrelas azuis: pontos de injecção em cada hemisfério). (Para ratinhos B6: -0,9 mm posterior, 1,7 mm lateral, e 2,2 mm de espessura)
- Encher a seringa com 10 ul de solução de Ap ou veículo com a solução em excesso, a fim de evitar a injecção de ar acidental.
- Coloque a seringa no thalínea e injeção (descrita no protocolo 4.7). Adicione a seringa perpendicular ao plano do ponto de injecção. Alinhar reflectida imagens da seringa em ambos os espelhos com as linhas traçadas nos espelhos de uma perspectiva fixo (Figura 1C).
- Comece a inserção da agulha até que a embalagem atinge a pele parafilme.
- Manter a seringa segurando a mão firme e usar outro lado para injectar 5 ml da solução de Ap ou veículo, lentamente ao longo de 5 segundos sem pausa. Certifique-se a seringa permanece perpendicular por toda parte. Depois de completar a injecção, aguarde 3 a 5 segundos antes de retirar a seringa para a difusão.
- Assumindo a posição de triângulo original, exercer uma pressão moderada para proteger o crânio de quaisquer movimentos desnecessários. Retire a seringa sem inclinação.
- Posicione o mouse Ab-injectado na almofada quente para a recuperação e manter sua decúbito esternal. Não deixe o mouse sem vigilância até que ele recupera a consciência e não devolver o mOuse a uma gaiola contendo os ratos não-cirúrgico até que ele se recuperou totalmente.
- Lava-se a seringa de acordo com os passos 3,3-3,6.
- monitorar No pós-operatório a mobilidade dos ratinhos e verificar se há qualquer sinal de infecção ou doença nos ratos por 5-7 dias.
Figura 1. Injection Aâ na região do ICV (A) agulha da seringa Parafilm envolto em comparação com uma agulha de seringa sem modificações.; (B) PBS gotas para os olhos para evitar a secura; o triângulo formado na testa de rato com o polegar, o dedo indicador, e os dois olhos de rato, bem como a linha média imaginária equidistante de cada olho; (C) dois espelhos (M1 e M2) com múltiplas linhas verticais desenhadas nas superfícies para ajudar perpendicular injeção da agulha da seringa; (D) o triângulo com os pontos de injeção, indicated como estrelas azuis (-1,0 ± 0,06 mm do bregma e 1,8 ± 0,1 milímetros sagital) em cada hemisfério do rato; Seta verde: parafilme, seta vermelha: bregma Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Confirmação de Ap Injection por Y-labirinto e Análises do cérebro
- Avaliar a memória de trabalho de ratos Ap-injetados por meio de testes Y-maze 3,7,8
- Esperar 3 dias após a injecção para o aparecimento de défices de memória.
- Realizar os testes Y-maze usando um labirinto de plástico preto, com três braços idênticos marcados A, B, e C, cada um dos quais se ramifica num ângulo a partir do centro do labirinto 120 ° (largura x comprimento x altura, 10 cm x 40 cm x 12 cm).
- Coloque um mouse no braço de partida (braço A) e permitir que o sujeito a explorar livremente o labirinto de 8 min.
- Medir o número de entradas em cada braço e calcular o Alterntaxa de ração de cada sujeito 3,9.
- examinar diretamente cérebros post-mortem para verificar se a injeção alvo a região do ICV adequadamente.
- Anestesiar o rato com o mesmo procedimento como descrito na secção 4.1. Então sacrificar o mouse por deslocamento cervical.
- Decapitar o mouse e remover a pele para expor o crânio usando uma tesoura cirúrgica. Remover tecidos e músculos do crânio.
- Fazer cortes na sutura lambdóide (entre os ossos parietais e interparietais) sem danificar o cérebro. Remova o occipital e ossos interparietais, em seguida, o parietal e ossos frontais. Remova o osso craniano usando uma pinça e isolar o cérebro do crânio, levantando as meninges.
- Lavar o cérebro em solução salina estéril gelada e cortar o ICV região do cérebro no sentido coronal com uma faca cirúrgica (Figura 2).
- Confirmar zona de injecção segundo o traçado da inserção da agulha notecido cerebral (Figura 2). Verifique se o traço agulha atingiu um dos ventrículos. Se o traço agulha não atender ou passar através dos ventrículos, excluir dados que do sujeito a partir da análise dos resultados experimentais.
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Representative Results
Esta seção ilustra exemplos dos resultados que podem ser obtidos pela confirmação da agregação de Ap e avaliação Y-labirinto de déficits de memória. Usando o comprimento total de Ap (1-42) péptido de 42 aminoácidos, mistura de monómeros, oligómeros de Ap, e fibrilas (Figura 3) foi produzido. Através do passo monomerization induzida por HFIP, foram obtidos monómeros relativamente homogéneos (pista B). Após a 7 dias de incubação, diversas tamanhos de agregados Ap (pista C) desenvolvido. Trímeros e tetrâmeros foram as espécies dominantes entre as formas oligoméricas de Ap. memória de trabalho espacial foi avaliada em camundongos injetados com Ap via alternâncias no teste Y-maze. A sequência de escolhas do braço e o número de entradas totais braço foram registados, enquanto cada ratinho foi deixada a explorar livremente o labirinto. Quanto mais intacta a capacidade cognitiva, mais o mouse deve ter uma tendência a entrar no braço menos visitou recentemente, alternating sua escolha braço. O grupo de rato injectado com Ap mostraram taxas significativamente mais baixas de alternância, indicando o desenvolvimento de défices cognitivos (Figura 4).
Figura 2. Exemplos de injecções ICV (A) Ilustração de seções do cérebro em sentido coronal que representam a localização do bregma 10 e faixa de injecção aceitável (-1,0 ± 0,06 mm do bregma e 1,8 ± 0,1 milímetros sagital). (B - C) um caso de injecção ICV sucesso (B: vista superior de todo o cérebro, C: corte coronal mostrando ventrículos laterais preenchidas com corante azul); (D - E) um caso de injecção ICV vencida (D: vista superior de todo o cérebro, E: corte coronal mostrando a terceira e quarta ventricles preenchidos com corante azul) Círculo azul e flecha: injetados local, estrela azul:. potencial ponto de injecção Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A confirmação da preparou uma espécie beta através de SDS-PAGE. Peptídeos Ap foram separados por SDS-PAGE com cross-linking foto-induzido de proteínas não modificados. bandas peptídicas foram visualizadas por coloração com prata; pista (A) marcador de proteína, a linha (B) monômero AP (antes da incubação), e as espécies de Ap incubados pista (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Y-maze testes comportamentais. Alternância por cento dos Aβ- ou grupos ratos injectados com o veículo no teste Y-maze. Branco gráfico sólido: veículo (Ap (-), n = 10). gráfico listrada: Ap-injectado (Ap (+), N = 9). As análises estatísticas foram realizadas com ANOVA de uma via seguido por comparações post-hoc de Bonferroni (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). As barras de erro representam os SEMs. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O passo mais importante neste protocolo é a injeção ICV de Ap. Este protocolo é projetado para injetar Aâ na região do ICV de camundongos sem instrumentos estereotaxia 11,12. Antes de iniciar uma experiência, um período preliminar de injeções de prática com um corante azul em vez de Ap deve ocorrer para atingir destreza suficiente. Imediatamente após a injecção, é necessário verificar se a injecção de pigmento foi realizada correctamente. Cuidadosamente retire o cérebro e verificar se a região apropriada foi tingida azul. A linha de pigmentado deve chegar a, mas não exceder, a profundidade da região do ICV. Um mínimo de uma taxa de sucesso de 90%, o que é geralmente conseguido depois de 50 ou mais injecções ICV, é sugerido. Durante a injecção ICV, não danificar os vasos sanguíneos através da injecção do seio sagital (perto do ponto bregma zero).
Após a injeção de Ap, diminuição da memória estatisticamente significativa foi observard entre o grupo de Ap-injetado e do grupo de controle usando Y-maze testes comportamentais. Diferentes tipos de experiências comportamentais podem ser aplicados para testar o grau de comprometimento cognitivo, tais como o labirinto de água de Morris 13, reconhecimento de objectos, e testes de esquiva passiva, bem como medo condicionado. O labirinto aquático de Morris é utilizado para examinar os déficits de memória espacial do hipocampo, enquanto que o condicionamento do medo é usado para testar a aprendizagem associativa dependente do hipocampo e comunicação amígdala-hipocampo. Reconhecimento de objectos de um objecto particular é adequado para a medição de disfunção cognitiva relacionada com DA, e de evitamento passivo pode ser utilizado para testar a capacidade de um animal para se lembrar do estímulo aversivo 3. É importante para preparar os ratos com peso e idade semelhante, se eles serão submetidos aos testes comportamentais, utilizando choques elétricos, como o medo condicionado e testes de esquiva passiva. Recomenda-se que os testes acima mencionados estão a ser realizadosdentro de 10 dias do início da déficits de memória. Desde confirma-se que Ap é encontrado na injeção hipocampo pós-ICV 14, novas investigações são necessárias para encontrar testes comportamentais que envolvem outras regiões do cérebro com afinidade de Ap ICV-injetado.
A preparação dos peptídeos Ap e o momento da injecção ICV deve ser cuidadosamente desenhado dependendo da finalidade experimental, e deve ter em consideração: (1) as espécies de Ap (monómeros, oligómeros, fibrilas, ou uma mistura); (2) a isoforma de Ap (Aβ40, Aβ42, Aβ25-35 truncado, e outros) 15-18; (3) os pontos de tempo de injecção de Ap; e (4) o intervalo de tempo após a exposição de Ap. Por exemplo, a injecção de monómeros Ap é recomendado se ratos serão submetidos à administração de fármacos que inibem as actividades anormais de monómeros de Ap, tal como agregação. A injeção de oligômeros de Ap solúveis é suggested se o estudo tem como objetivo avaliar a neurotoxicidade ou inflamação induzida por oligômeros. A injeção de espécies de Ap altamente agregadas é recomendado se a investigação visa estudar insolúvel Aâ e patologia relacionada 7,19. Se uma experiência pretende testar a potência de inibidores de agregação de Ap, o composto deve, geralmente, ser aplicada antes de, ou juntamente com, o Ap, enquanto os agentes de limpeza de Ap ou compostos anti-inflamatórios devem ser administradas após a injecção de Ap.
Em comparação com transgénico ou modelos crónicos de AD, o modelo de ratinho injectado com Ap permite aos investigadores para controlar a concentração de Ap, o aparecimento de fenótipos AD-semelhantes, e o desenvolvimento simultâneo de um grande número de ratinhos dementes. Esses benefícios proporcionam a liberdade com respeito ao delineamento experimental e uma ampla gama de oportunidades para os investigadores. Considerando a patogênese da AD mais de perto diz respeito à exposição crônica ao invés de um aumento súbito no A &# 946; concentração no cérebro, experiências adicionais usando modelos transgénicos é recomendado para reforçar as conclusões derivadas utilizando modelos de ratos injectados com Ap. Além disso, uma vez que a proteína de tau é uma outra causa principal de AD, a tau e desenvolvimento de modelos de ratinhos injecção de Ap pode avançar ainda mais a sociedade AD pesquisa.
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Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Coréia Saúde Tecnologia R & D projeto através do Instituto Coreano Indústria Saúde para o Desenvolvimento (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde e Bem-Estar, República da Coreia (número de concessão: H14C04660000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 27-29 g of body weight | |
| C57BL/6 mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 21-23 g of body weight | |
| Amyloid-beta1-42 | in house synthesis | stock concentration: 1 mM/DMSO, injected concentration: 100 μM/10% DMSO and 90% PBS | |
| ICV injection syringe (26s gauge) | Hamilton | 80308 | |
| Evans blue dye (EBD) | abcamBIochemicals | ab120869 | 1% EBD in PBS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| PBS | gibco | 10010-023 | |
| Gradi-GelTM II Gradient PAGE Analysis Kit | ELPiS Biotech | EBS-1056 | 15% Gel |
| Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards | Bio-Rad | 161-0377 | |
| Silver-Staining Kit | GE-Healthcare | 17-1150-01 | |
| LabDiet | Orientbio | 5053 |
References
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