Summary
L'amiloide-β (Ap) -injected modello animale consente la somministrazione di una quantità e specie di frammenti Ap definiti e riduce le differenze individuali all'interno di ciascun gruppo di studio. Questo protocollo descrive la intracerebroventricolare (ICV) iniezione di Ap senza strumenti stereotassica, consentendo la produzione di anomalie comportamentali Alzheimer-like nei topi normali.
Introduction
Dato che amiloide-β (Ap) è una caratteristica patologica della malattia di Alzheimer (AD), lo sviluppo di modelli animali di AD si è concentrata sulla sovraespressione neurale di Ap. Poiché le mutazioni nella proteina precursore dell'amiloide (APP) o presenilina (PS) portano a disturbi di Ap equilibrio e, infine, alla patogenesi di AD familiare 1, modelli murini che coinvolgono APP o PS mutazioni del gene sono state generalmente accettata. Tra la vasta gamma di topi transgenici, modelli prototipali di topo sono i seguenti: Tg2576, PDAPP, APP / PS1 e APP23. Nel cervello, questi topi in genere mostrano aggregazione Ap e placche senili alla fine; formazione di placca è seguito da un significativo deterioramento cognitivo tale che essi mostrano scarse prestazioni nei test comportamentali di apprendimento e memoria. La generazione di utilizzare topi transgenici che imitano naturalmente patologia AD umano ha così contribuito alla società di ricerca dC da permettendoci di monitorare la progressione della diSease. Tuttavia, utilizzando topi transgenici è antieconomica e richiede molto tempo perché ci vogliono mesi per i topi di sviluppare placche Ap e anche di più per mostrare sinaptica Ap-indotto o anomalie comportamentali 2,3. Originariamente sviluppato come alternativa per superare le carenze di modelli di topi transgenici, modelli non transgenici sono comunemente utilizzati a causa della loro vantaggi. modelli AD patogeno-indotta possono essere ottenuti mediante iniezione diretta di Ap nel cervello, che deficit cognitivi AD-simili possono anche essere attivati da altri chimici e fisici mezzi, ad esempio l'iniezione di composti neurotossici come scopolamina, l'induzione di lesioni nelle zone cognizione legati, come l'ippocampo, o da danni corticale 4. Tuttavia, l'induzione non patogeno di deterioramento cognitivo non riflette accuratamente la fisiopatologia fondamentale di AD; invece, imita solo i suoi risultati sintomatici. Al contrario, un modello AD patogeno-indotta, l'A46; il modello -injected del mouse, può non solo mostrare anomalie comportamentali AD-like, ma può anche esporre patologia Ap, la caratteristica comune condiviso da AD familiare e sporadica.
Nonostante la difficoltà di visualizzare placche Ap nel tessuto cerebrale, il più grande vantaggio del modello di Ap-iniettato che lo rende attraente per le indagini AD è la sua controllabilità. I ricercatori possono estirpare le differenze individuali nel modelli murini che possono portare a dati erronei in studi legati alla droga. trattamento farmacologico attuale è abilitato a seconda del meccanismo del farmaco candidato; di elaborare, un inibitore di Ap aggregazione può essere applicato prima l'iniezione di Ap. Inoltre, i ricercatori possono assumere che la trasformazione patogeno che sorge dopo l'iniezione Ap deriva dall'esposizione Ap perché gli altri fattori sono strettamente controllate, compresa differenze individuali.
In questo protocollo, una vivida descrizione di how per indurre un fenotipo AD-come in topi normali via Ap intracerebroventricolare (ICV) di iniezione senza strumenti stereotassica è presentato. Riducendo al minimo i danni inserimento-provocati al tessuto cerebrale è essenziale per evitare la possibilità di danni strutturali e infiammazione lesione indotta. La mancanza di abilità nel maneggiare il mouse porta a danno neuronale inaspettato. Inoltre, le tecniche che consentono l'inclinazione e profondità appropriata da raggiungere durante l'iniezione sono particolarmente importanti per aggirare errori frequenti. Oltre ad una dettagliata spiegazione vivido della iniezione ICV, l'affidabilità del modello prodotto dalla seguente protocollo è anche illustrata nelle seguenti sezioni. Il seguente protocollo potrebbe essere uno strumento affidabile e di facile comprensione che contribuisce alla ricerca dC, fornendo in tal modo un trampolino di lancio che potrebbe in ultima analisi portare ad una scoperta significativa per la società AD.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio (NIH Pubblicazioni n ° 8023, riveduta 1978) e con il Comitato cura e l'uso degli animali del Comitato Cura e uso istituzionale degli animali di KIST (Seoul, Corea).
1. Preparazione degli animali
- Preparare un gruppo di 7 settimane di età topi ICR maschi (o C57BL / 6).
- Lasciate che i topi passare attraverso un processo di acclimatazione per 3-7 giorni dopo il trasporto per ristabilire l'omeostasi. In generale, posizionare un gruppo di 4-5 topi in ogni gabbia e mantenerli a 22-23 ° C e 40% di umidità, con un ciclo di 12/12 ore luce / buio. Fornire acqua e cibo ad libitum.
Nota: Il processo di acclimatazione è fondamentale per consentire il recupero dallo stress della spedizione e l'adeguamento alle nuove abitazioni, cibo, acqua, e l'odore così come una nuova gabbia e ciclo di luce. In questo esperimento, i topi sono stati alloggiati in gabbie ventilazione individuale (IVCS) situato nella Spefica patogeno libero (SPF) impianto grade - Pesare ogni mouse ed escludere i soggetti il cui peso si discosta ± 10% rispetto alla media.
- Dividere i soggetti in due gruppi: un gruppo di veicoli ad iniezione (Ap (-)) e un gruppo Ap-iniettato (Ap (+)). Se l'esperimento è testare l'efficacia di un particolare farmaco candidato, dividere i topi in quattro gruppi: (1) Ap (-) / farmaco (-), (2) Ap (-) / farmaco (+), (3) Ap (+) / farmaco (-) e (4) Ap (+) / farmaco (+).
2. A? Peptide Preparazione
- Trattare i peptidi Ap, derivati mediante sintesi chimica 5 o da fonti commerciali, con pre-raffreddata 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo (HFIP) per sciogliere eventuali aggregati e per rendere i peptidi omogenee 6 .
- Sonicare la soluzione Ap / HFIP in un sonicatore bagnomaria per 5 minuti (a temperatura ambiente), delicatamente vortex, e incubare la soluzione per 30 minuti a RT. Rimuovere il HFIP completamente tramite l'evaporazione con azotoe memorizzare il omogeneo Ap a -80 ° C fino al momento dell'uso.
- Preparare i monomeri Ap: (. 100 micron Ap, 10% DMSO, 90% PBS) fare 1 mM Ap dimetilsolfossido (DMSO) stock e diluirlo 10 volte in tampone fosfato salino (PBS)
- Preparare oligomeri Ap.
- Incubare la soluzione monomero Ap (contenente Ap (1-42) o Ap (1-40)) (passo 2.2.) A 37 ° C per 3 o 7 giorni, rispettivamente.
- Posizionare la soluzione Ap in un tubo sigillato in un sacchetto di cerniera contenente carta umida per fornire un ambiente umidificato per evitare l'evaporazione di acqua durante il periodo di incubazione.
- Conferma oligomeri Ap preparati tramite sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE) con foto-indotta cross-linking delle proteine non modificate 6.
- Preparare la soluzione PBS di controllo contenente il 10% di DMSO per l'iniezione ICV veicolo.
3. Siringa Preparazione
Nota: La compressione del Parafilm porterà alla profondità dell'iniezione superiore a 3,6 millimetri ventrale. Per evitare che il Parafilm da essere compresso durante l'inserimento degli aghi, densamente avvolgere l'ago più volte.
4. Ap-iniettato Mouse Model Preparazione
Nota: Pulire il campo operatorio con un disinfettante per mantenere condizioni di sterilità e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici per l'iniezione ICV utilizzando etanolo al 70% e l'esposizione ai raggi UV.
- Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di xilazina (20 mg / kg) e tiletamina · HCl / zolazepam · HCl (80 mg / kg) prima dell'iniezione ICV. Posizionare il mouse su una stuoia di caldo per mantenere la sua temperatura corporea mentre anestetizzato e confermare un'anestesia adeguata valutando la risposta del piede-pizzico.
- Applicare PBS sterile scende a entrambi gli occhi per prevenire la secchezza della cornea durante la procedura (Figura 1B).
- Preparare due specchi tracciando più rette verticali sulla loro superficie in caso di difficuLTY iniettare la siringa perpendicolarmente.
- Mettere una specchio (M1) accanto al corpo del mouse e l'altra (M2) davanti alla testa. Mantenere M1 parallelamente alla linea mediana immaginaria tra i due occhi del mouse e organizzare M2 perpendicolare M1, in modo che i due piani formano un angolo di 90 ° (Figura 1C). Posizionare M1 sul lato sinistro del mouse se il ricercatore è destro. Posizionare M1 sul lato destro del mouse se il ricercatore è mancino.
- Spray etanolo al 70% sul centro della fronte del mouse e strofinare con tamponi di cotone asciutti. Non bagnare troppo grande di una zona della fronte per evitare la diminuzione della temperatura corporea dovuto evaporazione dell'alcool.
- Pulire la stessa area sulla fronte con soluzione di clorexidina al 2% utilizzando un ambiente pulito tamponi di cotone. scrubbings Ripetere con l'alcol e clorexidina per un totale di tre volte ciascuno.
Nota: Se necessario, radere i peli sulla fronte del mouse per minimizzare la possibilità di contaminazione - Individuare bregma.
- Usando il pollice e l'indice, strettamente tenere premuto il pelle della fronte, direttamente sopra i due occhi al grado che entrambi gli occhi sporgono. Trascinare la pelle torna a fare fronte tesa e ridurre al minimo i movimenti del cranio sotto la pelle.
- Formare un triangolo invisibile mediante l'assegnazione di tre vertici: i due occhi del mouse e il punto in cui si incontrano il pollice e l'indice, il bregma. (Figure 1B, Freccia rossa: bregma)
- Individuare il punto di iniezione con nastro adesivo di misurazione: -1.0 ± 0.06 mm posteriormente al bregma, 1,8 ± 0,1 mm lateralmente alla sutura sagittale, e 2.4 mm di profondità (Figura 1D, stelle blu: punti di iniezione in ogni emisfero). (Per i topi B6: -0.9 mm posteriori, 1,7 mm laterali, e 2,2 mm di profondità)
- Riempire la siringa con 10 microlitri soluzione Ap o veicolo, con la soluzione in eccesso per evitare l'iniezione di aria accidentale.
- Posizionare la siringa a Thpunto e iniezione (descritto nel protocollo 4.7). Effettuare la siringa perpendicolare al piano del punto di iniezione. Allineare riflette le immagini della siringa in entrambi gli specchi con le linee disegnate su specchi da una prospettiva fissa (Figura 1C).
- Iniziare inserendo l'ago finché l'involucro parafilm raggiunge la pelle.
- Tenere la siringa mano che tiene ferma e usare invece per iniettare 5 ml di soluzione di Ap o di un veicolo, lentamente nel corso di 5 secondi senza pause. Assicurarsi che la siringa rimane perpendicolare tutto. Dopo aver completato l'iniezione, attendere da 3 a 5 secondi prima di rimuovere la siringa per diffusione.
- Assumendo la posizione del triangolo originale, esercitare una moderata pressione per proteggere il cranio da eventuali movimenti non necessari. Rimuovere la siringa senza inclinare.
- Posizionare il mouse Ap-iniettato sul rilievo caldo per il recupero e mantenere la sua decubito sternale. Non lasciare il mouse senza sorveglianza fino a quando non riprende conoscenza e non rimettere il mOuse ad una gabbia contenente topi non chirurgica finché non è completamente recuperato.
- Lavare la siringa secondo passi 3.3-3.6.
- Dopo l'intervento di monitorare la mobilità dei topi e verificare la presenza di qualsiasi segno di infezione o malattia in topi per 5-7 giorni.
Figura 1. Ap iniezione nella regione ICV (A) Parafilm-avvolto ago della siringa rispetto ad un ago della siringa non modificato.; (B) PBS scende sul occhi per prevenire la secchezza; triangolo formato sulla fronte del mouse con pollice, indice, e due occhi del topo e la linea mediana immaginaria equidistante da ciascun occhio; (C) due specchi (M1 e M2) con più linee verticali disegnate sulle superfici di assistere perpendicolari iniezione della siringa; (D) il triangolo con i punti di iniezione, indicated come stelle blu (-1.0 ± 0.06 mm dal bregma e 1,8 ± 0,1 millimetri sagittalmente) su ogni emisfero del mouse; Freccia verde: parafilm, Freccia rossa: bregma Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
5. Conferma di Ap Injection da Y-labirinto e analisi del cervello
- Valutare la memoria di lavoro di topi Ap-iniettati dai test Y-labirinto 3,7,8
- Attendere 3 giorni dopo l'iniezione per l'insorgenza di deficit di memoria.
- Eseguire i test Y-labirinto utilizzando un labirinto di plastica nera con tre bracci identici etichettati A, B, e C, ciascuno dei quali si dirama ad un angolo dal centro del labirinto 120 ° (altezza x larghezza x lunghezza, 10 cm x 40 cm x 12 cm).
- Posizionare il mouse al braccio di partenza (braccio A) e permettere al soggetto di esplorare liberamente il labirinto per 8 min.
- Misurare il numero di voci in ogni braccio e calcolare il alterntasso zione di ciascun soggetto 3,9.
- Direttamente esaminare il cervello post-mortem per verificare se l'iniezione di mira la regione ICV in modo appropriato.
- Anestetizzare il mouse con la stessa procedura come descritto nel paragrafo 4.1. Poi sacrificare il mouse per dislocazione cervicale.
- Decapitare il mouse e togliere la pelle per esporre il cranio con le forbici chirurgiche. Rimuovere i tessuti e muscoli dal cranio.
- Effettuare tagli la sutura lambdoidea (tra il parietale e ossa interparietale) senza danneggiare il cervello. Rimuovere occipitale e ossa interparietale, poi il parietale e ossa frontali. Rimuovere l'osso cranico con pinze e isolare il cervello dal cranio sollevando le meningi.
- Lavare il cervello in refrigerate soluzione fisiologica sterile e tagliare la regione ICV del cervello nella direzione coronale con un bisturi (Figura 2).
- Conferma la regione di iniezione sulla base della traccia dell'inserimento dell'ago sullatessuto cerebrale (Figura 2). Controllare se la traccia ago ha raggiunto uno dei ventricoli. Se la traccia ago non soddisfa o passare attraverso i ventricoli, escludere i dati del soggetto dall'analisi dei risultati sperimentali.
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Representative Results
Questa sezione illustra esempi dei risultati ottenibili da una conferma di aggregazione Ap e valutazione Y-labirinto di deficit di memoria. Utilizzando il full-length Ap (1-42) peptide di 42 aminoacidi, miscela di monomeri, oligomeri, Ap e fibrille (Figura 3) è stato prodotto. Attraverso il passo monomerization HFIP indotta, sono stati ottenuti monomeri relativamente omogenee (Corsia B). Dopo l'incubazione di 7 giorni, diversi formati di aggregati Ap (corsia C) sviluppato. Trimeri e tetrameri sono state le specie dominanti tra le forme oligomeriche di Ap. memoria di lavoro spaziale è stato valutato nei topi Ap-iniettato tramite alternanze nel test Y-labirinto. La sequenza di scelte del braccio e il numero di voci totale del braccio sono state registrate mentre ogni mouse è stato permesso di esplorare liberamente il labirinto. Più intatta la capacità cognitive, più il mouse dovrebbe avere la tendenza a immettere il braccio meno recente visitato, alternating sua scelta braccio. Il gruppo del mouse Ap-iniettato mostrato tassi alternanza significativamente più bassi, indicando lo sviluppo di deficit cognitivi (Figura 4).
Figura 2. Esempi di iniezioni ICV (A) Illustrazione delle sezioni del cervello in direzione coronale che rappresentano la posizione del bregma 10 e la gamma di iniezione accettabile (-1,0 ± 0.06 mm dal bregma e 1,8 ± 0,1 millimetri sagittalmente). (B - C) un caso di iniezione ICV di successo (B: vista dall'alto di tutto il cervello, C: sezione coronale che mostra ventricoli laterali piene di colorante blu); (D - E) un caso di iniezione ICV successo (D: vista dall'alto del cervello intero, E: sezione coronale che mostra la terza e quarta ventricles pieni di colorante blu) Cerchio blu e la freccia: iniettato sito, stella blu:. potenziale punto di iniezione Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. La conferma della preparato una specie di beta tramite SDS-PAGE. Peptidi Ap sono stati separati mediante SDS-PAGE con foto-indotta cross-linking delle proteine non modificati. bande Peptide sono state visualizzate mediante colorazione argento; Lane (A) proteina marker, corsia (B) A? monomero (prima della incubazione), e Lane (C) specie Ap incubate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. test Y-labirinto comportamentali. Percentuale alternanza del Aβ- o gruppi di topi di veicoli a iniezione sul test Y-labirinto. grafico bianco solido: veicolo (Ap (-), n = 10). grafico a righe: Ap-iniettato (Ap (+), n = 9). Le analisi statistiche sono state effettuate con un ANOVA seguito dal confronto post-hoc di Bonferroni (* P <0.05, ** P <0,01, *** p <0.001). Le barre di errore rappresentano le SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il passo più importante in questo protocollo è l'iniezione ICV di Ap. Questo protocollo è progettato per iniettare Ap nella regione ICV di topi senza strumenti stereotassica 11,12. Prima di iniziare un esperimento, un periodo preliminare di iniezioni di pratica con un colorante blu invece di Ap dovrebbe avvenire per raggiungere destrezza sufficiente. Subito dopo l'iniezione, è necessario verificare se l'iniezione di pigmento è stato eseguito correttamente. Estrarre con attenzione il cervello e verificare se la regione appropriata è stata tinta blu. La linea pigmentata dovrebbe raggiungere, ma non superare la profondità della regione ICV. Un minimo di un tasso di successo del 90%, che è generalmente raggiunto dopo 50 o più iniezioni ICV, è suggerito. Durante l'iniezione ICV, evitare di danneggiare i vasi sanguigni iniettando seno sagittale (vicino al bregma punto zero).
Dopo l'iniezione Ap, statisticamente significativa compromissione della memoria era osservared tra il gruppo Ap-iniettato e il gruppo di controllo con Y-labirinto test comportamentali. Diversi tipi di esperimenti comportamentali possono essere applicate per verificare il grado di deterioramento cognitivo, come ad esempio l'acqua Morris labirinto 13, riconoscimento di oggetti, e test di evitamento passivo nonché paura condizionata. Il labirinto d'acqua di Morris è utilizzata per esaminare dell'ippocampo deficit di memoria spaziale, mentre la paura condizionata è utilizzato per testare apprendimento associativo ippocampo-dipendente e la comunicazione amigdala-ippocampo. Il riconoscimento di oggetti di un oggetto particolare è adatto per la misura del deterioramento cognitivo AD-correlati, e evitamento passivo può essere usato per testare la capacità di un animale per ricordare lo stimolo avversivo 3. È importante preparare topi di peso ed età simili se saranno sottoposti a test comportamentali utilizzano scariche elettriche, come la paura condizionata e test di evitamento passivo. Si raccomanda che le prove suddette devono essere eseguiteentro 10 giorni dalla comparsa dei deficit di memoria. Dal momento che si conferma che Ap si trova nella iniezione ippocampo post-ICV 14, ulteriori indagini sono garantiti per trovare test comportamentali che coinvolgono altre regioni del cervello con affinità di ICV-iniettato Ap.
La preparazione dei peptidi Ap ed il tempo di somministrazione ICV devono essere accuratamente progettati a seconda dello scopo sperimentale, e dovrebbero includere la considerazione: (1) le specie di Ap (monomeri, oligomeri, fibrille, o una miscela); (2) l'isoforma di Ap (Aβ40, Aβ42, troncato Aβ25-35, e altri) 15-18; (3) i punti di tempo di iniezione Ap; e (4) il tempo di ritardo dopo l'esposizione Ap. Ad esempio, l'iniezione di monomeri Ap è raccomandato se i topi saranno sottoposti a somministrazione di farmaci che inibiscono l'attività anormali di monomeri Ap, come aggregazione. L'iniezione di oligomeri solubili Ap è suggested se lo studio si propone di valutare la neurotossicità o l'infiammazione indotta da oligomeri. L'iniezione di specie Ap altamente aggregati è consigliato se l'indagine si propone di studiare insolubile Ap e le relative patologie 7,19. Se un esperimento ha lo scopo di testare la potenza di inibitori dell'aggregazione Ap, il composto deve essere generalmente applicato prima o insieme, la Ap, mentre gli agenti Ap-compensazione o composti anti-infiammatori deve essere somministrato dopo l'iniezione Ap.
Rispetto ai transgenici o modelli cronici di AD, il modello di topo Ap-iniettato permette ricercatori di controllare la concentrazione di Ap, l'insorgenza di fenotipi AD-like, e lo sviluppo simultanea di un gran numero di topi affetti da demenza. Questi vantaggi offrono la libertà rispetto al disegno sperimentale e una vasta gamma di opportunità per i ricercatori. Considerando la patogenesi di AD più strettamente riferisce ad esposizione cronica piuttosto che un improvviso aumento A &# 946; concentrazione nel cervello, esperimenti aggiuntivi utilizzando modelli transgenici raccomanda di rafforzare le conclusioni derivate da utilizzando modelli murini Ap-iniettati. Inoltre, dal momento che la proteina tau è un'altra delle principali cause di AD, lo sviluppo di tau e modelli di topi iniezione Ap può avanzare ulteriormente la società di ricerca dC.
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Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione della Corea del Health Technology R & S del progetto attraverso la Corea Health Industry Development Institute (Khidi), finanziato dal Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (codice di autorizzazione: H14C04660000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 27-29 g of body weight | |
| C57BL/6 mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 21-23 g of body weight | |
| Amyloid-beta1-42 | in house synthesis | stock concentration: 1 mM/DMSO, injected concentration: 100 μM/10% DMSO and 90% PBS | |
| ICV injection syringe (26s gauge) | Hamilton | 80308 | |
| Evans blue dye (EBD) | abcamBIochemicals | ab120869 | 1% EBD in PBS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| PBS | gibco | 10010-023 | |
| Gradi-GelTM II Gradient PAGE Analysis Kit | ELPiS Biotech | EBS-1056 | 15% Gel |
| Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards | Bio-Rad | 161-0377 | |
| Silver-Staining Kit | GE-Healthcare | 17-1150-01 | |
| LabDiet | Orientbio | 5053 |
References
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