Summary
העמילואיד-β (Aβ) -injected במודל חיה מאפשרת לממשל של כמות לבין מינים מוגדרים של שברי Aβ ומפחית הבדלים אינדיבידואליים בתוך כל קבוצת לימוד. פרוטוקול זה מתאר את intracerebroventricular (ICV) הזרקה של Aβ ללא מכשירים stereotactic, המאפשרת הפקה של ליקויים התנהגותיים אלצהיימר דמויי בעכברים נורמליים.
Introduction
בהתחשב עמילואיד-β כי (Aβ) הוא סימן היכר פתולוגיים של מחלת אלצהיימר (AD), פיתוח מודלים בעלי חיים לספירה התמקד ביטוי יתר עצבי של Aβ. בגלל מוטציות בחלבון מקדים עמילואיד (APP) או presenilin (PS) להוביל הפרעה של שיווי משקל Aβ ובסופו של דבר בפתוגנזה של משפחתי AD 1, מודלי עכבר המעורבים מוטציות גנטיות APP או PS כבר מקובלים. בין המגוון הרחב של עכברים טרנסגניים, במודלים של עכברים אבטיפוס כוללים: TG2576, PDAPP, APP / PS1 ו APP23. במוח, עכברים אלה מציגים בדרך כלל צבירה Aβ ושלטי סנילי בסופו של דבר; היווצרות הפלאק ואחריו ליקוי קוגניטיבי משמעותי כך הם מראים ביצועים ירודים במבחני התנהגות של למידה וזיכרון. הדור באמצעות עכברים מהונדסים המחקים פתולוגיה לספירת אדם באופן טבעי ובכך תרם חברה למחקר לספירה בכך שהוא מאפשר לנו לעקוב אחר ההתקדמות של disease. עם זאת, באמצעות עכברים מהונדסים הוא לא כלכלי וזמן רב, מכיוון שהיא לוקחת חודשים על העכברים לפתח פלאק Aβ ואף יותר על מנת להציג מושרה הסינפטי Aβ או מומים התנהגותי 2,3. פותח במקור כחלופה כדי להתגבר על החסרונות של דגמי עכבר מהונדסים, שאינם מהונדסים דגמים גם משמשים בדרך כלל בשל היתרונות הברורים שלהם. הפתוגן- המושרה מודלים לספירה יכול להיות מיוצר על ידי הזרקה ישירה של Aβ לתוך המוח, ואילו ליקויים קוגניטיביים לספירה דמוי יכול גם להיות מופעלות על ידי כימיות ופיסיקליות דרך אחרת, כגון הזרקה של תרכובות הנוירו כגון סקופולמין, אינדוקציה של נגעים באזורים הקשורים קוגניציה כגון ההיפוקמפוס, או על ידי פגיעה בקליפת המוח 4. עם זאת, בדומה להשפעה שאינה פתוגניים של ליקוי קוגניטיבי אינה משקפת במדויק את הפתופיזיולוגיה הבסיסית של מחלת אלצהיימר; במקום זאת, רק מחקה תוצאות סימפטומטי שלה. לעומת זאת, מודל AD המושרה לפתוגן, א46; במודל עכבר -injected, לא יכולים רק להראות ליקויים התנהגותיים לספירה דמוית אלא גם יכולים להפגין פתולוגיה Aβ, התכונה המשותפת לספירה משפחתית ספורדי.
למרות הקושי לדמיין פלאק Aβ ברקמת המוח, את התועלת הגדולה ביותר של המודל מוזרק-Aβ כי הופכת אותו לאטרקטיבי עבור חקירת AD היא יכולת השליטה שלה. החוקרים יכולים לשרש הבדלים אישיים בעכברי מודל שיכול להוביל נתונים שגויים במחקרים הקשורים לסמים. טיפול תרופתי בזמן מופעל בהתאם למנגנון של התרופה המועמדת; ניתן ליישם לפרט, מעכב של הצטברות Aβ לפני הזריקה של Aβ. בנוסף, חוקרים יכולים להניח כי השינוי פתוגניים המתעורר לאחר הזרקת Aβ נגזר חשיפת Aβ כי הגורמים האחרים נשלטים בחוזקה, כולל הבדלים אישיים.
בפרוטוקול זה, תיאור חי של how לגרום פנוטיפ AD-כמו בעכברים נורמליים באמצעות Aβ intracerebroventricular (ICV) הזרקה ללא מכשירים stereotactic מוצג. מזעור הנזק על שיבוץ עורר ברקמות המוח הוא חיוני כדי למנוע אפשרות של נזק מבני ודלקת הנגרמת הנגע. חוסר המיומנות בטיפול עכבר מוביל לפגיעה עצבית לא צפויה. יתר על כן, טכניקות המאפשרות הזווית ועומק המתאימה כדי להיות מושגות במהלך ההזרקה חשובות במיוחד כדי לעקוף טעויות תכופות. בנוסף להסבר מפורט, חיה של הזרקת ICV, על מהימנותם של המודל היוצר על ידי הפרוטוקול הבא מודגמת גם בסעיפים הבאים. הפרוטוקול הבא יכול להיות כלי אמין והבין בקלות שתורם מחקר לספירה, ובכך לספק קרש קפיצה כי בסופו של דבר להוביל תגלית משמעותית עבור חברה לספירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם המכונים הלאומיים מדריך הבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (מס 'פרסומים NIH 8023, מתוקנת 1978) ועם ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השימוש KIST (בסיאול, קוריאה).
1. הכנת בעלי חיים
- כן קבוצה של 7 שבועות בן עכברי זכרי ICR (או C57BL / 6).
- תן העכברים לעבור תהליך הסתגלות במשך 3-7 ימים לאחר התחבורה לשחזר הומאוסטזיס. באופן כללי, למקום קבוצה של 4-5 עכברים בכל כלוב ולשמור אותם ב- C ° 22-23 ו -40% לחות, עם מחזור 12/12 שעות אור / חושך. ספק כרצונך מים ומזון.
ההערה: תהליך ההסתגלות הוא קריטי כדי לאפשר התאוששות מן הלחץ של משלוח והתאמת דיור חדשות, מזון, מים, ולהריח כמו גם כלוב חדש ו מחזור האור. בניסוי זה, עכברים שוכנו כלובי מאווררים אישית (IVCs) ממוקמים Speפתוגן cific חינם (SPF) מתקן -grade - לשקול כל עכבר או לא לכלול נושאים שמשקלה חורג ± 10% מן הממוצע.
- מחלקים את הנבדקים לשתי קבוצות: קבוצת מוזרק-רכב (Aβ (-)) וקבוצה Aβ-מוזרק (Aβ (+)). אם הניסוי היא לבחון את היעילות של מועמד תרופה מסוימת, לחלק את העכברים לארבע קבוצות: (1) Aβ (-) / סמים (-), (2) Aβ (-) / סמים (+), (3) Aβ (+) / סמים (-), ו (4) Aβ (+) / סמים (+).
2. Aβ פפטיד כן
- פנקו את פפטידים Aβ, הנגזרים באמצעות סינתזה כימית 5 או ממקורות מסחריים, עם טרום צונן 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) כדי לפזר כל אגרגטים לעשות פפטידים 6 הומוגנית .
- Sonicate הפתרון Aβ / HFIP בתוך sonicator מים באמבטיה במשך 5 דקות (ב RT), מערבולת בעדינות, דגירה הפתרון למשך 30 דקות ב RT. הסר את HFIP לחלוטין באמצעות אידוי עם חנקןולאחסן את Aβ הומוגנית ב -80 ° C עד השימוש.
- הכן את מונומרים Aβ: (. 100 מיקרומטר Aβ, 10% DMSO, 90% PBS) לעשות 1 מ"מ Aβ dimethylsulfoxide (DMSO) המניות לדלל אותו פי 10 ב בופר פוספט (PBS)
- כן oligomers Aβ.
- דגירת פתרון מונומר Aβ (המכיל Aβ (1-42) או Aβ (1-40)) (שלב 2.2.) ב 37 מעלות צלזיוס במשך ימים 3 או 7, בהתאמה.
- מניח את פתרון Aβ בתוך שפופרת אטומה בתוך שקית רוכסן המכילה מגבת נייר רטובה כדי לספק סביבת humidified כדי למנוע אידוי מים בתקופת הדגירה.
- אשר oligomers Aβ מוכן באמצעות ג'ל אלקטרופורזה גופרה-polyacrylamide dodecyl נתרן (SDS-PAGE) עם 6 חלבונים פוטו-induced cross-linking של שינוי.
- הכן את תמיסת הבקרה PBS המכיל 10% DMSO עבור הזרקת הרכב ICV.
3. הכנת מזרק
הערה: דחיסה של Parafilm תוביל את עומק ההזרקה עולה גחון 3.6 מ"מ. כדי למנוע את Parafilm מלהיות דחוס במהלך החדרת המחט, בצפיפות לעטוף את המחט מספר פעמים.
4. מוזרק Aβ כן במודל עכבר
הערה: נקה את שדה ההפעלה עם חומר חיטוי כדי לשמור על תנאים סטריליים לעקר את כל מכשירי הניתוח להזרקת ICV באמצעות אתנול 70% וחשיפת UV.
- להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal מתערובת של xylazine (20 מ"ג / ק"ג) ו tiletamine · HCl / zolazepam · HCl (80 מ"ג / ק"ג) לפני הזריקה ICV. מניח את העכבר על מחצלת חמימה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה תוך מורדם לאשר הרדמה נאותה על ידי הערכת תגובת קמצוץ רגל.
- החל PBS סטרילי יורד בשני העיניים כדי למנוע יובש קרני במהלך ההליך (האיור 1B).
- הכן שני מראה על ידי ציור קווים אנכיים ישר מרובים על פני השטח שלהם במקרה של difficulty הזרקת המזרק בניצב.
- מניח במראה אחד (M1) ממש ליד גופת העכבר והשני (M2) מול הראש. שמור במקביל M1 אל קו האמצע דמיוני בין שתי העיניים של העכבר ולסדר M2 בניצב M1, כך ששני המטוסים יוצרים זווית 90 ° (תרשים 1C). מניח M1 בצד השמאלי של העכבר אם החוקר הוא ימני. מניח M1 בצד הימני של העכבר אם החוקר הוא שמאלי.
- תרסיס אתנול 70% על באמצע המצח של העכבר ולשפשף אותו עם צמר גפן יבש. אין להרטיב מדי גדול האיזור של המצח, כדי למנוע ולהקטין את טמפרטורת הגוף עקב התאדות של אלכוהול.
- נגב באותו אזור על המצח עם פתרון כלורהקסידין 2% באמצעות צמר גפן נקי. scrubbings חוזר עם אלכוהול chlorohexidine עבור בסך הכל שלוש פעמים כל אחד.
הערה: אם יש צורך, לגלח את השיער על המצח של העכבר על מנת למזער את possibility של זיהום - אתר גבחת.
- באמצעות האגודל והאצבע המורה, בחוזקה החזק את העור של המצח, ישירות מעל שתי העיניים עד לדרגה שבה שתי העיניים בולטות. גרור את העור לאחור כדי להפוך את המצח מתוח למזער תנועות הגולגולת מתחת לעור.
- מהווים משולש בלתי נראה על ידי הקצאת שלושה קודקודים: שתי העיניים של העכבר לנקודה שבה נפגשים האגודל והאצבע המורה, גבחת. (1B הדמוית, חץ אדום: גבחת)
- אתר את נקודת הזרקה עם סרט מדידה: -1.0 ± 0.06 מ"מ אחורי גבחת, 1.8 ± 0.1 מ"מ לרוחב תפר sagittal ו -2.4 מ"מ עומק (איור 1D, כוכבי כחולים: נקודות הזרקה בכל חץ כדור). (עבור עכברי B6: אחורי -0.9 מ"מ, 1.7 מ"מ לרוחב ו -2.2 מ"מ עומק)
- מלא את המזרק עם 10 μl Aβ פתרון או רכב עם פתרון עודף על מנת למנוע הזרקת אוויר בשוגג.
- יש להכניס את המזרק ב הנקודת הזרקת דואר (המתואר בפרוטוקול 4.7). הפוך את המזרק בניצב למישור של נקודת ההזרקה. יישר שקף תמונות של המזרק בשני מראה עם הקווים המשורטטים על מראות מנקודת מבט קבוע (התרשים 1C).
- בגין החדרת המחט עד גלישת parafilm מגיעה העור.
- שמור את המזרק מחזיק יד יציבה ולהשתמש מצד שני להזריק 5 μl של פתרון או הרכב Aβ, לאט מעל 5 שניות ללא השהיה. ודא מזרק נשאר בניצב לאורך כל הדרך. לאחר השלמת הזריקה, לחכות 3 עד 5 שניות לפני הסרת מזרק דיפוזיה.
- בהנחת עמדת המשולש המקורית, להפעיל לחץ מתון כדי להגן על הגולגולת מכל תנועות מיותרות. הסר את המזרק ללא הטיה.
- מניחים את העכבר Aβ-מוזרק על כרית חמה להתאוששות ולתחזק שכיבה sternal שלה. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חוזר להכרה לא מחזיר את מ 'Ouse כדי כלוב ובו עכברים לא ניתוחיים עד שהוא התאושש לחלוטין.
- לשטוף את המזרק לפי שלבי 3.3-3.6.
- לאחר ניתוח לפקח על הניידות של העכברים ולבדוק עבור כל סימן לזיהום או מחלה בעכברים 5-7 ימים.
הזרקת באיור 1. Aβ לאזור ICV (א) מחט מזרק עטוף Parafilm לעומת מחט מזרק ללא שינוי.; (ב) PBS צונח עיניים כדי למנוע יובש; במשולש על המצח של עכבר עם אגודל, אצבע מורה, ואת שתי עיניים של עכבר כמו גם קו האמצע הדמיוני במרחק שווה מכל עין; (ג) שתי מראות (M1 ו- M2) עם קווים אנכיים מרובים נמשכים על המשטחים לסייע בניצב הזריקה של מחט המזרק; (ד) את המשולש עם נקודות ההזרקה, הודיated כמו כוכבים כחולים (-1.0 ± 0.06 מ"מ מן גבחת ו 1.8 ± 0.1 מ"מ sagittally) על כל חצי הכדור של העכבר; חץ ירוק: parafilm, חץ אדום: גבחת אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
5. אישור של הזרקת Aβ ידי Y-מבוך ניתוח מוח
- להעריך את זיכרון העבודה של עכברים שהוזרק Aβ ידי בדיקות Y-מבוך 3,7,8
- חכה 3 ימים לאחר ההזרקה עבור תחילתה של גירעונות זיכרון.
- לבצע את בדיקות Y-המבוך באמצעות מבוך פלסטיק שחור עם שלוש זרועות זהות שכותרתו A, B, ו- C, שכל אחד מהם הסניפים בזווית 120 מעלות מהמרכז במבוך (גובה x אורך x רוחב, 10 סנטימטרים x 40 ס"מ x 12 ס"מ).
- מניח עכבר בזרוע ההתחלה (הזרוע) ולאפשר את הנושא כדי לחקור את המבוך בחופשיות במשך 8 דקות.
- מדדו את מספר הכניסות לכל זרוע ולחשב את alternשיעור ation של כל נושא 3,9.
- ישירות לבחון המוח שלאחר המוות כדי לבדוק אם הזריקה ממוקד באזור ICV כראוי.
- להרדים את העכבר על ידי אותו נוהל כמו המפורטים בסעיף 4.1. ואז להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
- לערוף את העכבר להסיר את העור כדי לחשוף את הגולגולת באמצעות מספריים כירורגיות. הסר רקמות שרירים מן הגולגולת.
- לבצע חתכים על תפר lambdoid (בין הקודקודית ועצמות interparietal) מבלי לפגוע במוח. הסר את העורפית ועצמות interparietal, אז הקודקודית ועצמות חזיתיות. הסר את העצם גולגולתי באמצעות מלקחיים לבודד את המוח מהגולגולת על ידי הרמת קרומי המוח.
- שטפו את המוח מלח סטרילית צונן לחתוך באזור ICV של המוח בכיוון העטרה עם סכין כירורגית (איור 2).
- אשר את אזור ההזרקה המבוסס על העקבות של החדרת המחט עלברקמת המוח (איור 2). בדוק אם זכר מחט הגיע אחד החדרים. אם עקבות המחט אינה עומדת או לעבור דרך החדרים, לכלול נתונים של הנושא כי מניתוח תוצאות הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף זה ממחיש דוגמאות של התוצאות כי ניתן להשיג על ידי אישור של צבירת Aβ ו- Y-מבוך הערכת גירעונות זיכרון. שימוש באורך מלא Aβ (1-42) פפטיד של 42 חומצות אמינו, תערובת של מונומרים Aβ, oligomers, ואת הסיבים (איור 3) הופק. באמצעות צעד monomerization הנגרמת HFIP, מונומרים הומוגנית יחסית (Lane B) התקבלו. לאחר דגירת 7 היום, בגדלים שונים של אגרגטים Aβ (Lane C) פתחו. Trimers ו tetramers היה המין השולט בין צורות oligomeric של Aβ. זיכרון עבודת מרחבים הוערך ב העכברים שהוזרק-Aβ באמצעות חילופים במבחן Y-המבוך. הרצף של בחירות זרוע ואת מספר הערכים הזרועים כוללים נרשמו בעוד כל עכבר ההורשה לחקור את המבוך בחופשיות. ככל כנה את היכולת הקוגניטיבית, ככל העכבר צריכה יש נטייה להיכנס זרוע פחות ביקר לאחרונה, אלטעrnating בחירת הזרוע שלה. קבוצת העכבר מוזרק Aβ הראתה באופן משמעותי שיעורי לסירוגין נמוכים, המציין את הפיתוח של ליקויים קוגניטיביים (איור 4).
דוגמאות איור 2. של זריקות ICV (א) איור של חלקים במוח בכיוון העטרה המייצג את המיקום של גבחת 10 וטווח הזריקה מקובל (-1.0 ± 0.06 מ"מ מן גבחת ו 1.8 ± 0.1 מ"מ sagittally). (ב - ג) במקרה של הזרקת ICV המוצלחת (B: מבט מלמעלה של המוח כולו, C: סעיף עטרה מראה חדרים לרוחב מלאי צבע כחול); (D - E) במקרה של הזרקת ICV המוצלחת (D: מבט מלמעלה של כל המוח, E: מראה סעיף עטרה השלישי והרביעי ve ntricles מלא צבע כחול) עיגול כחול חץ: אתר מוזרק, כוכב כחול:. נקודת הזרקה פוטנציאל אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. אישור הכינו מיני β באמצעות SDS-PAGE. פפטידים Aβ הופרדו על ידי SDS-PAGE עם חלבוני פוטו-induced cross-linking של שינוי. להקות פפטיד היו דמיינו ידי צביעת כסף; שביל (א) סמן חלבון, ליין (B) מונומר Aβ (לפני הדגירה), והליין (C) מיני Aβ וטופחו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
p-together.within-page = "1"> 
איור 4. Y-מבוך בדיקות התנהגותיות. לסירוגין אחוז של Aβ- או קבוצות עכברים מוזרקות רכב במבחן Y-המבוך. גרף מוצק לבן: רכב (Aβ (-), n = 10). גרף פסים: מוזרק Aβ (Aβ (+), n = 9). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו עם ANOVA חד כיווני ואחריו השוואות פוסט הוק של Bonferroni (* P <0.05, ** P <0.01, *** p <0.001). ברי השגיאה מייצגים את האנשים SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצעד החשוב ביותר פרוטוקול זה הוא הזרקת ICV של Aβ. פרוטוקול זה נועד להזרים Aβ לאזור ICV של עכברים ללא מכשירים stereotactic 11,12. לפני שמתחיל ניסוי, תקופה ראשונית של זריקות בפועל עם צבע כחול במקום Aβ צריכה להתבצע כדי להשיג כשרון מספיק. מייד לאחר ההזרקה, יש צורך לבדוק אם זריקת פיגמנט בוצעה כהלכה. בזהירות להוציא את המוח ולבדוק אם האזור המתאים היה צבוע כחול. שורת פיגמנט צריכה להגיע, אבל לא תעלה, העומק באזור ICV. מינימום של שיעור הצלחה של 90%, אשר מושג בדרך כלל לאחר 50 או יותר זריקות ICV, הוא הציע. במהלך הזרקת ICV, למנוע נזק לכלי הדם על ידי הזרקת סינוס sagittal (קרוב לנקודת גבחת אפס).
לאחר ההזרקה Aβ, פגיעה בזיכרון מובהק סטטיסטית היה לצפותד בין קבוצת Aβ-מוזרק לבין קבוצת הביקורת באמצעות Y-מבוך בדיקות התנהגותיות. סוגים שונים של ניסויים התנהגותיים ניתן ליישם על מנת לבחון את מידת ליקוי קוגניטיבי, כגון מי מוריס מבוך 13, והכרת אובייקט, ובדיקות הימנעות פסיביות וכן מיזוג פחד. מבוך המים של מוריס הוא מנוצל כדי לבחון גירעונות זיכרון מרחבים בהיפוקמפוס, ואילו מיזוג פחד משמש לבדיקת למידה אסוציאטיבית תלויה בהיפוקמפוס ותקשורת בהיפוקמפוס-האמיגדלה. זיהוי אובייקט של אובייקט אחד מסוים מתאים לשקילת ליקוי קוגנטיבי הקשורות לספירה, והוא יכול לשמש הימנעות פסיבית לבחון את יכולתו של בעל חיים לזכור את הגירוי המרתיע 3. חשוב להכין עכברים של משקל דומה וגיל אם הם יהיו כפופים לבדיקות התנהגותיים ניצול שוקים חשמליים, כגון מיזוג פחד בדיקות הימנעות פסיביות. מומלץ כי הבדיקות האמורות הנן להתבצעבתוך 10 ימים מיום תחילתו של גירעונות זיכרון. מאז הוא אישר כי Aβ נמצא הזרקת ההיפוקמפוס שלאחר ICV 14, חקירות נוספות מוצדקים למצוא בדיקות התנהגותיות מעורבים אזורי מוח אחרים עם זיקה של Aβ ICV מוזרק.
הכנת פפטידים Aβ ועיתוי ההזרקה ICV צריך להיות מתוכנן בקפידה בהתאם לצורך הניסוי, וצריך לכלול בחינה של: (1) מינים של Aβ (מונומרים, oligomers, הסיבים, או תערובת); (2) איזופורם של Aβ (Aβ40, Aβ42, מקוצץ Aβ25-35, ואחרים) 15-18; (3) נקודות בזמן ההזרקה Aβ; ו (4) זמן ההשהיה לאחר חשיפת Aβ. לדוגמה, את הזריקה של מונומרים Aβ מומלץ אם עכברים יהיה נתון הממשל של תרופות המעכבות את פעילות חריגה של מונומרים Aβ, כגון צבירת. ההזרקה של oligomers המסיס Aβ היא suggesteד אם המחקר נועד להעריך neurotoxicity או דלקת הנגרמת על ידי oligomers. ההזרקה של מיני Aβ מצטברים מאוד מומלצת אם החקירה שואפת ללמוד מסיס Aβ וצדדים קשור פתולוגיה 7,19. אם ניסוי שמטרתו לבדוק את העצמה של מעכבי צבירת Aβ, במתחם יש להחיל בדרך כלל לפני, או יחד עם, Aβ, ואילו סוכני Aβ סליקה או תרכובות אנטי דלקתיות צריכים להינתן לאחר הזרקת Aβ.
לעומת מהונדס או מודלים כרוניים של מחלת אלצהיימר, במודל העכבר מוזרק Aβ מאפשר לחוקרים לשלוט ריכוז Aβ, תחילתה של פנוטיפים AD-כמו, לבין ההתפתחות סימולטני של מספר רב של עכברים מטורפים. יתרונות אלה מספקים חופש ביחס תכנון ניסוי ומגוון רחב של הזדמנויות חוקרות. בהתחשב בפתוגנזה של מחלת אלצהיימר יותר מקרוב מתייחס לחשיפה כרונית ולא התפרצות פתאומית A &# 946; ריכוז במוח, ניסויים נוספים באמצעות מודלים מהונדסים מומלץ לחזק את המסקנות נגזרות ניצול מודלי עכבר מוזרק Aβ. בנוסף, מאז חלבון הטאו הוא גורם עיקרי אחר של מחלת אלצהיימר, פיתוח טאו ומודלי עכברי הזרקת Aβ עשוי להמשיך לקדם את החברה למחקר לספירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענק של R בריאות טכנולוגיה קוריאה & D הפרויקט באמצעות המוסד פיתוח תעשיית הבריאות קוריאה (KHIDI), במימון משרד הבריאות והרווחה, הרפובליקה של קוריאה (מספר מענק: H14C04660000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 27-29 g of body weight | |
| C57BL/6 mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 21-23 g of body weight | |
| Amyloid-beta1-42 | in house synthesis | stock concentration: 1 mM/DMSO, injected concentration: 100 μM/10% DMSO and 90% PBS | |
| ICV injection syringe (26s gauge) | Hamilton | 80308 | |
| Evans blue dye (EBD) | abcamBIochemicals | ab120869 | 1% EBD in PBS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| PBS | gibco | 10010-023 | |
| Gradi-GelTM II Gradient PAGE Analysis Kit | ELPiS Biotech | EBS-1056 | 15% Gel |
| Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards | Bio-Rad | 161-0377 | |
| Silver-Staining Kit | GE-Healthcare | 17-1150-01 | |
| LabDiet | Orientbio | 5053 |
References
- Kam, T. I., Gwon, Y., Jung, Y. K. Amyloid beta receptors responsible for neurotoxicity and cellular defects in Alzheimer's disease. Cell Mol Life Sci. 71, 4803-4813 (2014).
- Elder, G. A., Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R. Transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Mt Sinai J Med. 77, 69-81 (2010).
- Bryan, K. J., Lee, H., Perry, G., Smith, M. A., Casadesus, G. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience Frontiers in Neuroscience. Buccafusco, J. J. , (2009).
- Van Dam, D., De Deyn, P. P. Animal models in the drug discovery pipeline for Alzheimer's disease. Br J Pharmacol. 164, 1285-1300 (2011).
- Choi, J. W., Kim, H. Y., Jeon, M., Kim, D. J., Kim, Y. Efficient access to highly pure beta-amyloid peptide by optimized solid-phase synthesis. Amyloid. 19, 133-137 (2012).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides. J Vis Exp. , (2009).
- Kim, H. V., et al. Amelioration of Alzheimer's disease by neuroprotective effect of sulforaphane in animal model. Amyloid. 20, 7-12 (2013).
- Jackson, L. L. VTE on an elevated T-maze. J Comp Psychol. 36, 9 (1943).
- Kim, H. Y., et al. Taurine in drinking water recovers learning and memory in the adult APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease. Sci Rep. 4, 7467 (2014).
- Paxinos, G., Franklin, B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2nd edn. , Academic Press. (2001).
- Ledo, J. H., et al. Amyloid-beta oligomers link depressive-like behavior and cognitive deficits in mice. Mol Psychiatry. 18, 1053-1054 (2013).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. J Pharmacol Methods. 16, 355-357 (1986).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. J Vis Exp. , (2011).
- Figueiredo, C. P., et al. Memantine rescues transient cognitive impairment caused by high-molecular-weight abeta oligomers but not the persistent impairment induced by low-molecular-weight oligomers. J Neurosci. 33, 9626-9634 (2013).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. Br J Pharmacol Chemother. 12, 12-15 (1957).
- Harkany, T., et al. Neuroprotective approaches in experimental models of beta-amyloid neurotoxicity: relevance to Alzheimer's disease. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 23, 963-1008 (1999).
- Wang, D., et al. The allosteric potentiation of nicotinic acetylcholine receptors by galantamine ameliorates the cognitive dysfunction in beta amyloid25-35 i.c.v.-injected mice: involvement of dopaminergic systems. Neuropsychopharmacology. 32, 1261-1271 (2007).
- Yamada, K., Nabeshima, T. Animal models of Alzheimer's disease and evaluation of anti-dementia drugs. Pharmacol Ther. 88, 93-113 (2000).
- Cho, S. M., et al. Correlations of amyloid-beta concentrations between CSF and plasma in acute Alzheimer mouse model. Sci Rep. 4, 6777 (2014).
