Summary
amyloid-β (Aβ) -injected पशु मॉडल एक निर्धारित मात्रा और Aβ टुकड़े की प्रजातियों के प्रशासन के लिए सक्षम बनाता है और प्रत्येक अध्ययन समूह के भीतर व्यक्तिगत मतभेदों को कम करता है। इस प्रोटोकॉल स्टीरियोटैक्टिक उपकरणों के बिना Aβ की Intracerebroventricular (आईसीवी) इंजेक्शन का वर्णन करता है, सामान्य चूहों में अल्जाइमर की तरह व्यवहार असामान्यताएं के उत्पादन को सक्षम।
Introduction
यह देखते हुए कि amyloid-β (Aβ) अल्जाइमर रोग (ई) का एक रोग बानगी है, ई पशु मॉडल के विकास के Aβ के तंत्रिका overexpression पर ध्यान केंद्रित किया है। क्योंकि amyloid अग्रदूत साबित प्रोटीन (एपीपी) या presenilin (पीएस) में म्यूटेशन Aβ संतुलन की अशांति और अंततः पारिवारिक ई 1 के रोगजनन के लिए नेतृत्व, माउस एपीपी या पी एस जीन म्यूटेशन से जुड़े मॉडल आम तौर पर स्वीकार किया गया है। ट्रांसजेनिक चूहों की एक विस्तृत श्रृंखला के बीच में, प्रोटोटाइप माउस मॉडल शामिल हैं निम्नलिखित: TG2576, PDAPP, एपीपी / PS1 और APP23। मस्तिष्क में, इन चूहों आम तौर पर Aβ एकत्रीकरण और अंततः बूढ़ा सजीले टुकड़े दिखा रहे हैं; पट्टिका गठन महत्वपूर्ण संज्ञानात्मक हानि द्वारा पीछा किया जाता है जैसे कि वे सीखने और स्मृति के व्यवहार परीक्षण में खराब प्रदर्शन दिखा। ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने की पीढ़ी है कि स्वाभाविक रूप से मानव ई विकृति की नकल इस प्रकार di की प्रगति की निगरानी करने के लिए हमें की अनुमति देकर ई अनुसंधान समाज के लिए योगदान दिया हैSease। हालांकि, ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग अनार्थिक और समय लेने वाली है क्योंकि यह चूहों Aβ सजीले टुकड़े को विकसित करने के लिए महीने लग जाते हैं और यहां तक कि अब Aβ प्रेरित synaptic या व्यवहार असामान्यताएं 2,3 दिखाने के लिए है। मूल रूप से एक विकल्प के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की कमियों को दूर करने के लिए के रूप में विकसित, गैर ट्रांसजेनिक मॉडल भी आमतौर पर उनकी विशिष्ट लाभ के कारण किया जाता है। पैथोजन प्रेरित ई मॉडल-तरह के साधन के रूप में इस तरह के scopolamine न्यूरोटोक्सिक यौगिकों के इंजेक्शन, घावों की प्रेरण के रूप में, मस्तिष्क में Aβ के प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा उत्पादित किया जा सकता है, जबकि ई-जैसे संज्ञानात्मक घाटे भी अन्य रासायनिक और भौतिक द्वारा शुरू किया जा सकता ऐसे हिप्पोकैम्पस, के रूप में या cortical क्षति 4 से अनुभूति से संबंधित क्षेत्रों में। हालांकि, संज्ञानात्मक हानि की गैर रोगजनक प्रेरण सही ई के मौलिक pathophysiology को प्रतिबिंबित नहीं करता है; इसके बजाय, यह केवल अपने ही प्रतीक परिणामों mimics। इसके विपरीत, एक रोगज़नक़ प्रेरित ई मॉडल, एक46; -injected माउस मॉडल, न केवल ई-तरह व्यवहार असामान्यताएं दिखा सकते हैं, लेकिन यह भी Aβ पैथोलॉजी, आम सुविधा पारिवारिक और छिटपुट ई द्वारा साझा प्रदर्शन कर सकते हैं।
कठिनाई मस्तिष्क के ऊतकों में Aβ सजीले टुकड़े कल्पना करने के बावजूद, Aβ इंजेक्शन मॉडल का सबसे बड़ा लाभ यह है कि यह ई जांच के लिए आकर्षक बना देता है अपने controllability है। शोधकर्ताओं ने कहा कि मादक पदार्थों से संबंधित अध्ययन में गलत डाटा को चुरा सकते हैं माउस मॉडल में व्यक्तिगत मतभेदों को साफ़ कर सकते हैं। समय पर दवा इलाज उम्मीदवार दवा की व्यवस्था के आधार पर सक्षम किया गया है; विस्तृत करने के लिए, Aβ एकत्रीकरण के एक अवरोध Aβ के इंजेक्शन से पहले लागू किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, जांचकर्ताओं को मान सकते हैं कि रोगजनक परिवर्तन है कि Aβ इंजेक्शन के बाद पैदा होती है Aβ जोखिम से ली गई है, क्योंकि अन्य कारकों कसकर व्यक्तिगत मतभेदों सहित नियंत्रित कर रहे हैं।
इस प्रोटोकॉल में, एक घंटा की विशद वर्णनओउ स्टीरियोटैक्टिक उपकरणों के बिना Aβ Intracerebroventricular (आईसीवी) इंजेक्शन के माध्यम से सामान्य चूहों में एक विज्ञापन की तरह phenotype प्रेरित करने के लिए प्रस्तुत किया है। कम से कम मस्तिष्क के ऊतकों के लिए सम्मिलन-उकसाया नुकसान संरचनात्मक क्षति और घाव प्रेरित सूजन की संभावना को रोकने के लिए आवश्यक है। माउस से निपटने में कौशल की कमी अप्रत्याशित न्यूरोनल चोट की ओर जाता है। इसके अलावा, तकनीक है कि उचित कोण और गहराई इंजेक्शन के दौरान प्राप्त किया जा करने के लिए सक्षम विशेष रूप से लगातार गलतियों को नाकाम करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। आईसीवी इंजेक्शन का एक विस्तृत, ज्वलंत स्पष्टीकरण के अलावा, मॉडल के बाद प्रोटोकॉल के द्वारा उत्पादित की विश्वसनीयता भी निम्न वर्गों में सचित्र है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक विश्वसनीय और आसानी से समझ में आ रहा है कि उपकरण ई अनुसंधान के लिए योगदान देता है, जिससे एक उन्नति का मार्ग है कि अंततः ई समाज के लिए एक सार्थक खोज करने के लिए ले जा सकता है प्रदान कर सकता है।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार बाहर किया गया (एनआईएच प्रकाशन सं 8023, संशोधित 1978) और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के पशु की देखभाल और उपयोग समिति के साथ केआईएसटी (सोल, कोरिया)।
1. पशु तैयारी
- 7 सप्ताह पुराने नर चूहों आईसीआर (या C57BL / 6) का एक समूह तैयार करें।
- चूहों homeostasis बहाल करने के लिए परिवहन के बाद 3-7 दिनों के लिए एक दशानुकूलन प्रक्रिया के माध्यम से चलते हैं। सामान्य तौर पर, प्रत्येक पिंजरे में 4-5 चूहों के एक समूह के लिए जगह और, 22-23 डिग्री सेल्सियस और 40% आर्द्रता में उन्हें बनाए रखने के एक 12/12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र के साथ। पानी और भोजन जी भरकर प्रदान करें।
नोट: दशानुकूलन प्रक्रिया नए आवास, भोजन, पानी के लिए शिपिंग और अनुकूलन के तनाव से वसूली की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण है, और एक नया पिंजरे और प्रकाश चक्र के रूप में भी बू आ रही है। इस प्रयोग में, चूहों व्यक्तिगत रूप से हवादार पिंजरों (IVCs) विशेष में स्थित में रखे थेcific पैथोजन मुक्त (एसपीएफ) ग्रेड सुविधा - प्रत्येक माउस वजन और विषयों जिसका वजन औसत से 10% ± भटक बाहर।
- दो समूहों में विषयों विभाजित: एक वाहन इंजेक्शन समूह (Aβ (-)) और एक Aβ इंजेक्शन समूह (Aβ (+))। प्रयोग एक विशेष दवा उम्मीदवार की प्रभावकारिता परीक्षण करने के लिए है, तो चार समूहों में विभाजित चूहों: (1) Aβ (-) / दवा (-), (2) Aβ (-) / दवा (+), (3) Aβ (+) / दवा (-), और (4) Aβ (+) / दवा (+)।
2. Aβ पेप्टाइड तैयारी
- Aβ पेप्टाइड्स, रासायनिक संश्लेषण के माध्यम से 5 या वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त समझो, पूर्व ठंडा 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) किसी भी समुच्चय को भंग करने और पेप्टाइड्स समरूप बनाने के लिए 6 से ।
- (आरटी) पर 5 मिनट, धीरे भंवर के लिए एक पानी में स्नान sonicator में Aβ / HFIP समाधान Sonicate, और आरटी पर 30 मिनट के लिए समाधान सेते हैं। HFIP हटाये पूरी तरह से नाइट्रोजन के साथ वाष्पीकरण के माध्यम सेऔर उपयोग करें जब तक डिग्री सेल्सियस -80 में समरूप Aβ की दुकान।
- Aβ monomers तैयार: (। 100 माइक्रोन के Aβ, 10% DMSO, 90% पीबीएस) 1 मिमी Aβ dimethylsulfoxide (DMSO) शेयर कर सकते हैं और यह पतला 10 गुना फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में
- Aβ oligomers तैयार करें।
- Aβ मोनोमर समाधान (2.2 कदम।) (Aβ (1-42) या Aβ (1-40) युक्त), क्रमशः 3 या 7 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- एक गीला कागज तौलिया युक्त ऊष्मायन अवधि के दौरान पानी के वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक humidified वातावरण प्रदान करने के लिए एक zippered बैग में एक मोहरबंद ट्यूब में Aβ समाधान रखें।
- सोडियम सल्फेट dodecyl-जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) तस्वीर प्रेरित असंशोधित प्रोटीन 6 के पार से जोड़ने के साथ के माध्यम से तैयार Aβ oligomers की पुष्टि करें।
- वाहन आईसीवी इंजेक्शन के लिए 10% DMSO युक्त नियंत्रण पीबीएस समाधान तैयार है।
3. सिरिंज तैयारी
नोट: Parafilm के संपीड़न इंजेक्शन 3.6 मिमी उदर से अधिक की गहराई को बढ़ावा मिलेगा। सुई प्रविष्टि के दौरान संकुचित किया जा रहा से Parafilm रोकने के लिए, घनी सुई कई बार लपेटो।
4. Aβ इंजेक्शन माउस मॉडल तैयारी
ध्यान दें: एक कीटाणुनाशक बाँझ स्थिति बनाए रखने और 70% इथेनॉल और यूवी जोखिम का उपयोग कर आईसीवी इंजेक्शन के लिए सभी सर्जिकल उपकरणों बाँझ के साथ ऑपरेटिंग क्षेत्र को साफ करें।
- xylazine (20 मिलीग्राम / किग्रा) और tiletamine का एक मिश्रण की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize · एचसीएल / zolazepam · एचसीएल (80 मिलीग्राम / किग्रा) आईसीवी इंजेक्शन से पहले। अपने शरीर का तापमान बनाए रखने के समय anesthetized और पैर चुटकी प्रतिक्रिया का आकलन करने से पर्याप्त संज्ञाहरण पुष्टि करने के लिए एक गर्म चटाई पर माउस रखें।
- लागू बाँझ पीबीएस प्रक्रिया (चित्रा 1 बी) के दौरान कार्निया सूखापन को रोकने के लिए दोनों आंखों के लिए चला जाता है।
- difficu के मामले में उनके सतहों पर कई सीधे खड़ी रेखा खींचने से दो दर्पण तैयारlty सिरिंज लंबरूप इंजेक्शन।
- एक दर्पण (एम 1) सही सिर के सामने माउस के शरीर और अन्य (M2) के बगल में रखें। माउस के दो आंखों के बीच काल्पनिक midline के लिए एम 1 समानांतर रखें और एम 1 के लिए सीधा M2 की व्यवस्था है, ताकि दो विमानों को एक 90 डिग्री के कोण (चित्रा 1 सी) के रूप में। माउस के बाएं किनारे पर एम 1 की जगह यदि शोधकर्ता दाएं हाथ है। माउस के सही पक्ष पर एम 1 की जगह यदि शोधकर्ता बाएं हाथ है।
- माउस के माथे के बीच पर 70% इथेनॉल स्प्रे और सूखी कपास swabs के साथ रगड़। माथे के एक क्षेत्र की बहुत बड़ी शराब के वाष्पीकरण के कारण शरीर के तापमान को कम करने से बचने के लिए गीला मत करो।
- एक स्वच्छ कपास swabs का उपयोग कर 2% chlorhexidine समाधान के साथ माथे पर एक ही क्षेत्र साफ कर लें। शराब और प्रत्येक तीन बार की कुल के लिए chlorohexidine साथ दोहराएँ scrubbings।
नोट: यदि आवश्यक हो, आदेश possi कम करने के लिए माउस के माथे पर बाल दाढ़ीसंदूषण की साख - शीर्षस्थान का पता लगा।
- अंगूठे और तर्जनी का प्रयोग, कसकर, माथे की त्वचा के नीचे पकड़ सीधे डिग्री है कि दोनों आंखों बहर करने के लिए दो आँखों से ऊपर। त्वचा वापस खींचें माथे तना हुआ करते हैं और त्वचा के नीचे खोपड़ी आंदोलनों को कम करने के लिए।
- तीन कोने बताए द्वारा एक अदृश्य त्रिकोण फार्म: माउस के दो आँखें और इस मुद्दे पर जहां अंगूठे और तर्जनी से मिलो, शीर्षस्थान। (आंकड़े 1 बी, लाल तीर: पर्वबिन्दु)
- शीर्षस्थान के लिए -1.0 ± 0.06 मिमी पीछे, गहराई में 1.8 ± 0.1 मिमी बाण सीवन के लिए पार्श्व, और 2.4 मिमी (चित्रा -1, नीले तारे: इंजेक्शन अंक प्रत्येक गोलार्द्ध में) को मापने टेप के साथ इंजेक्शन बिंदु का पता लगा। (बी -6 चूहों के लिए: -0.9 पीछे मिमी, 1.7 मिमी पार्श्व, और 2.2 गहराई में मिमी)
- आदेश आकस्मिक हवा इंजेक्शन से बचने के लिए 10 μl Aβ समाधान या अतिरिक्त समाधान के साथ वाहन के साथ सिरिंज भरें।
- वें पर सिरिंज रखेंई इंजेक्शन बिंदु (प्रोटोकॉल 4.7 में वर्णित)। इंजेक्शन बिंदु के विमान को सीधा सिरिंज बनाओ। संरेखित एक निश्चित परिप्रेक्ष्य (चित्रा 1 सी) से दर्पण पर तैयार की लाइनों के साथ दोनों दर्पण में सिरिंज की छवियों को परिलक्षित।
- सुई डालने तक parafilm लपेटकर त्वचा तक पहुँच शुरू करो।
- हाथ पकड़े सिरिंज स्थिर रखें और रोक के बिना, Aβ समाधान या वाहन के 5 μl इंजेक्षन करने के लिए धीरे-धीरे 5 सेकंड से अधिक दूसरी ओर का उपयोग करें। यकीन सिरिंज भर में सीधा रहता है। इंजेक्शन पूरा करने के बाद, प्रसार के लिए सिरिंज को हटाने से पहले 3 से 5 सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें।
- मूल त्रिकोण स्थिति संभालने के लिए, किसी भी अनावश्यक आंदोलनों से खोपड़ी की रक्षा के लिए मध्यम दबाव डालती है। झुकने के बिना सिरिंज निकालें।
- गर्म पैड पर Aβ इंजेक्शन माउस वसूली के लिए जगह और उसके स्टर्नल लेटना बनाए रखें। माउस छोड़ पहुंच से बाहर नहीं है, जब तक यह चेतना आएगा और एम वापस नहीं हैएक पिंजरे गैर सर्जिकल चूहों युक्त जब तक यह पूरी तरह से ठीक हो गया है करने के लिए OUSE।
- कदम 3.3-3.6 के अनुसार सिरिंज धो लें।
- ऑपरेशन के बाद चूहों की गतिशीलता पर नजर रखने और 5-7 दिनों के लिए चूहों में संक्रमण या बीमारी के किसी भी हस्ताक्षर के लिए जाँच करें।
चित्रा 1. आईसीवी क्षेत्र में Aβ इंजेक्शन (ए) Parafilm लिपटे सिरिंज सुई एक असंशोधित सिरिंज सुई की तुलना में।; (बी) पीबीएस आंखों में सूखापन को रोकने के लिए पर चला जाता है; त्रिकोण अंगूठे, तर्जनी के साथ माउस के माथे पर गठित, और माउस के दो आंखों के रूप में अच्छी तरह से काल्पनिक midline हर आंख से समान दूरी पर; (सी) दो दर्पण (एम 1 और एम 2) कई ऊर्ध्वाधर सिरिंज सुई का इंजेक्शन सीधा सहायता के लिए सतहों पर तैयार की लाइनों के साथ; (डी) त्रिकोण इंजेक्शन अंक के साथ, Indicपैदा रूप में नीले सितारों (शीर्षस्थान से -1.0 ± 0.06 मिमी और 1.8 ± 0.1 मिमी sagittally) माउस के प्रत्येक गोलार्द्ध पर; ग्रीन तीर: parafilm, लाल तीर: पर्वबिन्दु कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
वाई-भूलभुलैया और ब्रेन विश्लेषण द्वारा Aβ इंजेक्शन की पुष्टि 5.
- वाई-भूलभुलैया परीक्षण 3,7,8 द्वारा Aβ इंजेक्शन चूहों का काम स्मृति का आकलन
- स्मृति घाटे की शुरुआत के लिए इंजेक्शन के बाद 3 दिन तक प्रतीक्षा करें।
- तीन समान हथियारों के साथ एक काले रंग की प्लास्टिक भूलभुलैया का उपयोग कर y भूलभुलैया परीक्षण प्रदर्शन लेबल ए, बी, और सी, जिनमें से प्रत्येक शाखाओं बाहर भूलभुलैया के केंद्र से एक 120 डिग्री के कोण पर (चौड़ाई x लंबाई x ऊँचाई के 10 सेमी x 40 सेमी x 12 सेमी)।
- प्रारंभ भुजा (हाथ एक) में माउस प्लेस और इस विषय को स्वतंत्र रूप से 8 मिनट के लिए भूलभुलैया का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं।
- प्रत्येक हाथ में प्रविष्टियों की संख्या को मापने और altern की गणनाप्रत्येक विषय 3,9 के व्यावहारिक दर।
- सीधे इंजेक्शन उचित रूप से आईसीवी क्षेत्र को लक्षित करता है, तो जाँच करने के लिए पोस्टमार्टम के दिमाग की जांच।
- एक ही प्रक्रिया से माउस anesthetize धारा 4.1 में उल्लिखित। तब गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस बलिदान।
- माउस सिर काटना और शल्य कैंची का उपयोग खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए त्वचा को हटा दें। कपाल से ऊतकों और मांसपेशियों को हटा दें।
- मस्तिष्क को नुकसान पहुँचाए बिना (पार्श्विका और interparietal हड्डियों के बीच) lambdoid सीवन पर कटौती करें। पश्चकपाल और interparietal हड्डियों, तो पार्श्विका और ललाट हड्डियों निकालें। संदंश का उपयोग कपाल हड्डी निकालें और तानिका ऊपर उठाने के द्वारा खोपड़ी से मस्तिष्क को अलग।
- ठंडा बाँझ खारा में मस्तिष्क धोने और एक सर्जिकल चाकू (चित्रा 2) के साथ राज्याभिषेक दिशा में मस्तिष्क के आईसीवी क्षेत्र काटा।
- इंजेक्शन पर सुई प्रविष्टि के निशान के आधार पर क्षेत्र की पुष्टिमस्तिष्क के ऊतकों (चित्रा 2)। अगर सुई का पता लगाने निलय में से एक पर पहुंच गया है की जाँच करें। सुई का पता लगाने को पूरा नहीं करता है या निलय के माध्यम से गुजरती हैं, प्रयोगात्मक परिणामों के विश्लेषण से उस विषय के डेटा को बाहर।
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Representative Results
यह खंड परिणाम है कि Aβ एकत्रीकरण और स्मृति घाटे के वाई-भूलभुलैया आकलन की पुष्टि के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है के उदाहरण दिखाता है। पूर्ण लंबाई Aβ का उपयोग करना (1-42) 42 अमीनो एसिड, Aβ monomers, oligomers का मिश्रण है, और तंतुओं (चित्रा 3) के पेप्टाइड उत्पादन किया गया था। HFIP प्रेरित monomerization कदम के माध्यम से, अपेक्षाकृत सजातीय मोनोमर (लेन बी) प्राप्त किया गया। 7 दिन के ऊष्मायन के बाद, Aβ समुच्चय (लेन सी) की विभिन्न आकारों में विकसित किया है। Trimers और tetramers Aβ की oligomeric रूपों के बीच प्रमुख प्रजातियों थे। स्थानिक काम स्मृति वाई-भूलभुलैया परीक्षण में alternations के माध्यम से Aβ इंजेक्शन चूहों में मूल्यांकन किया गया था। जबकि प्रत्येक माउस के लिए स्वतंत्र रूप से भूलभुलैया का पता लगाने के लिए अनुमति दी गई थी बांह विकल्प के अनुक्रम और कुल हाथ प्रविष्टियों की संख्या दर्ज किए गए। अधिक बरकरार संज्ञानात्मक क्षमता, अधिक माउस हाथ कम हाल ही में दौरा किया, Alte दर्ज करने की प्रवृत्ति होनी चाहिएअपनी बांह पसंद rnating। Aβ इंजेक्शन माउस समूह काफी कम प्रत्यावर्तन दरों दिखाया, संज्ञानात्मक घाटे (चित्रा 4) के विकास का संकेत है।
चित्रा 2. आईसीवी इंजेक्शन (ए) राज्याभिषेक दिशा में मस्तिष्क वर्गों पर्वबिन्दु 10 और स्वीकार्य इंजेक्शन रेंज (शीर्षस्थान से -1.0 ± 0.06 मिमी और 1.8 ± 0.1 मिमी sagittally) के स्थान का प्रतिनिधित्व करने का चित्रण के उदाहरण हैं। (बी - सी) सफल आईसीवी इंजेक्शन का मामला (बी: पूरे मस्तिष्क, सी के शीर्ष दृश्य: पार्श्व निलय नीले रंग के साथ भरा दिखा राज्याभिषेक अनुभाग); (डी - ई) असफल आईसीवी इंजेक्शन (डी का मामला: पूरे मस्तिष्क के शीर्ष दृश्य, ई: राज्याभिषेक अनुभाग तीसरे और चौथे दिखा veइंजेक्शन साइट, ब्लू स्टार: नीले रंग की डाई) ब्लू सर्किल और तीर के साथ भरा ntricles। संभावित इंजेक्शन बिंदु यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. तैयार एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से एक β प्रजातियों की पुष्टि। Aβ पेप्टाइड्स तस्वीर प्रेरित असंशोधित प्रोटीन के पार से जोड़ने के साथ एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे। पेप्टाइड बैंड चांदी धुंधला द्वारा कल्पना थे; लेन (ए) प्रोटीन मार्कर, (ऊष्मायन से पहले) लेन (बी) Aβ मोनोमर, और लेन (सी) incubated Aβ प्रजातियों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. Y भूलभुलैया व्यवहार परीक्षण। Aβ- का प्रतिशत प्रत्यावर्तन या वाहन इंजेक्शन चूहों समूहों वाई-भूलभुलैया परीक्षण पर। व्हाइट ठोस ग्राफ: वाहन (Aβ (-), एन = 10)। धारीदार ग्राफ: Aβ इंजेक्शन (Aβ (+), एन = 9)। सांख्यिकीय विश्लेषण एक तरह से एनोवा Bonferroni पद अस्थायी तुलना द्वारा पीछा के साथ प्रदर्शन किया गया (* पी <0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001)। त्रुटि सलाखों एसईएम प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम Aβ की आईसीवी इंजेक्शन है। इस प्रोटोकॉल स्टीरियोटैक्टिक उपकरणों 11,12 बिना चूहों के आईसीवी क्षेत्र में Aβ इंजेक्षन करने के लिए बनाया गया है। एक प्रयोग शुरू करने से पहले, Aβ के बजाय एक नीले रंग के साथ अभ्यास इंजेक्शन की एक प्रारंभिक अवधि के लिए जगह लेने के लिए पर्याप्त निपुणता हासिल करने के लिए करना चाहिए। तुरंत इंजेक्शन के बाद, यह जाँच करने के लिए है कि क्या वर्णक इंजेक्शन ठीक से प्रदर्शन किया गया था आवश्यक है। ध्यान से मस्तिष्क बाहर ले और जाँच करें कि क्या उचित क्षेत्र नीले रंग से रंगा गया था। pigmented लाइन तक पहुँचने चाहिए, लेकिन अधिक नहीं, आईसीवी क्षेत्र की गहराई। एक 90% सफलता दर है, जो आम तौर पर 50 या उससे अधिक आईसीवी इंजेक्शन के बाद हासिल की है की एक न्यूनतम, सुझाव दिया है। आईसीवी इंजेक्शन के दौरान, बाण साइनस (पर्वबिन्दु शून्य बिंदु के करीब) इंजेक्शन लगाने के द्वारा रक्त वाहिकाओं को नुकसान पहुँचाए से बचें।
Aβ इंजेक्शन के बाद, सांख्यिकीय महत्वपूर्ण स्मृति हानि का निरीक्षण थाAβ इंजेक्शन समूह और नियंत्रण समूह व्यवहार परीक्षण Y भूलभुलैया का उपयोग कर के बीच घ। व्यवहार प्रयोगों के विभिन्न प्रकार के ऐसे मॉरिस पानी के रूप में संज्ञानात्मक हानि, की डिग्री का परीक्षण भूलभुलैया 13, मान्यता आपत्ति करने के लिए लागू किया जा सकता है, और निष्क्रिय परिहार परीक्षण के साथ ही भय का वातावरण है। जबकि डर कंडीशनिंग हिप्पोकैम्पस पर निर्भर साहचर्य सीखने और प्रमस्तिष्कखंड हिप्पोकैम्पस संचार का परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है मॉरिस पानी भूलभुलैया, हिप्पोकैम्पस स्थानिक स्मृति घाटे की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक विशेष वस्तु की वस्तु मान्यता ईसवी से संबंधित संज्ञानात्मक हानि की माप के लिए उपयुक्त है, और निष्क्रिय परिहार एक जानवर के 3 प्रतिकूल प्रोत्साहन को याद करने की क्षमता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह एक समान वजन और उम्र के चूहों को तैयार करने के लिए यदि वे इस तरह के डर कंडीशनिंग और निष्क्रिय परिहार परीक्षण के रूप में बिजली के झटके, उपयोग व्यवहार परीक्षण के अधीन हो जाएगा महत्वपूर्ण है। यह सिफारिश की है कि ऊपर उल्लिखित परीक्षण प्रदर्शन हो रहे हैंस्मृति घाटे के शुरू होने के 10 दिनों के भीतर। चूंकि यह पुष्टि की है कि Aβ हिप्पोकैम्पस के बाद आईसीवी इंजेक्शन 14 में पाया जाता है, आगे की जांच के व्यवहार आईसीवी इंजेक्शन Aβ की आत्मीयता के साथ मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों से जुड़े परीक्षण लगाने के लिए warranted रहे हैं।
Aβ पेप्टाइड्स की तैयारी और आईसीवी इंजेक्शन के समय ध्यान प्रयोगात्मक उद्देश्य के आधार पर तैयार किया जाना चाहिए, और के विचार को शामिल करना चाहिए: (1) Aβ (monomers, oligomers, तंतुओं, या एक मिश्रण) की प्रजातियों; (2) Aβ (Aβ40, Aβ42, छोटा Aβ25-35, और अन्य) 15-18 के isoform; (3) Aβ इंजेक्शन के समय अंक; और (4) Aβ प्रदर्शन के बाद समय अंतराल। उदाहरण के लिए, Aβ monomers के इंजेक्शन अगर चूहों दवाओं है कि इस तरह के एकत्रीकरण के रूप में Aβ monomers, की असामान्य गतिविधियों को बाधित कर के प्रशासन के अधीन हो जाएगा सिफारिश की है। घुलनशील Aβ oligomers के इंजेक्शन suggeste हैडी अध्ययन न्यूरोटॉक्सिटी या सूजन oligomers से प्रेरित का आकलन करना है। अत्यधिक एकत्रित Aβ प्रजातियों के इंजेक्शन जांच अघुलनशील Aβ और संबंधित विकृति 7,19 का अध्ययन करना है, तो सिफारिश की है। एक प्रयोग Aβ एकत्रीकरण अवरोधकों की शक्ति का परीक्षण करना है, तो यौगिक आम तौर पर पहले Aβ समाशोधन एजेंट या विरोधी भड़काऊ यौगिकों Aβ इंजेक्शन के बाद प्रशासित किया जाना चाहिए, जबकि लागू किया जाना चाहिए, या के साथ, Aβ साथ।
ट्रांसजेनिक या विज्ञापन की पुरानी मॉडल की तुलना में, इंजेक्शन Aβ माउस मॉडल शोधकर्ताओं Aβ की एकाग्रता, ई-तरह phenotypes की शुरुआत है, और बावला चूहों की एक बड़ी संख्या का एक साथ विकास को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है। इन लाभों को प्रयोगात्मक डिजाइन और शोधकर्ताओं के लिए अवसरों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए सम्मान के साथ स्वतंत्रता प्रदान करते हैं। ई के रोगजनन ध्यान में रखते हुए और अधिक बारीकी से पुरानी जोखिम के बजाय एक और में अचानक वृद्धि से संबंधित है# 946; मस्तिष्क में एकाग्रता, ट्रांसजेनिक मॉडल का उपयोग अतिरिक्त प्रयोगों के निष्कर्ष Aβ इंजेक्शन माउस मॉडल के उपयोग से प्राप्त होता मजबूत करने के लिए सिफारिश की है। इसके अलावा, क्योंकि ताऊ प्रोटीन ईस्वी का एक और प्रमुख कारण है, ताऊ और Aβ इंजेक्शन चूहों मॉडल के विकास के लिए आगे ई रिसर्च सोसायटी अग्रिम कर सकते हैं।
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Acknowledgments
इस शोध कोरिया स्वास्थ्य उद्योग विकास संस्थान (KHIDI), स्वास्थ्य और कल्याण मंत्रालय, गणराज्य कोरिया (: H14C04660000 अनुदान संख्या) द्वारा वित्त पोषित के माध्यम से कोरिया स्वास्थ्य प्रौद्योगिकी अनुसंधान एवं विकास परियोजना का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 27-29 g of body weight | |
| C57BL/6 mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 21-23 g of body weight | |
| Amyloid-beta1-42 | in house synthesis | stock concentration: 1 mM/DMSO, injected concentration: 100 μM/10% DMSO and 90% PBS | |
| ICV injection syringe (26s gauge) | Hamilton | 80308 | |
| Evans blue dye (EBD) | abcamBIochemicals | ab120869 | 1% EBD in PBS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| PBS | gibco | 10010-023 | |
| Gradi-GelTM II Gradient PAGE Analysis Kit | ELPiS Biotech | EBS-1056 | 15% Gel |
| Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards | Bio-Rad | 161-0377 | |
| Silver-Staining Kit | GE-Healthcare | 17-1150-01 | |
| LabDiet | Orientbio | 5053 |
References
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