Identifizierung von Metalloxid-Nanopartikeln in histologischen Proben durch verbesserte Dunkelfeldmikroskopie und hyperspektrale Kartierung

Introduction

Als Nanomaterialien werden zunehmend in einer Vielzahl von Branchen und Anwendungen verwendet wird, gibt es einen Bedarf für nanoskalige Bildgebung und Charakterisierungsmethoden, die eine schnellere, erschwinglich und bequemer als traditionelle Modalitäten wie Elektronenmikroskopie sind. Nanopartikel (NP) Wechselwirkungen mit Zellen, Geweben und lebenden Systemen viele optische Techniken eingesetzt worden, einschließlich der Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Mikroskopie ^{1 und} abklingende Feld basierte Ansätze, wie beispielsweise innere Totalreflexion (TIR) ​​oder Nah- visualisieren Rasterlichtmikroskopie (NSOM) ^2,3. Allerdings sind diese High-End-Analyseansätze, außerhalb der Reichweite der meisten Nicht-Fachlaboren ^4. Elektronenmikroskopie, einschließlich der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), ist ebenfalls verwendet worden, um NP Wechselwirkung mit Zellen ^5,6,7,8 studieren. Hohe Winkelringdunkelfeld (HAADF) Rastertransmissionselektronenmikroskop wurde genutzt, um die Wechselwirkung von Nanopartikeln untersuchenmit Viren ^9. Konfokale Mikroskopie ist eine weitere beliebte Technik zur NP-Zell-Interaktionen ¹⁰ zu studieren.

In den letzten Jahren haben Dunkelfeld-basierten hyperspektrale Bild (HSI) -Techniken als vielversprechendes Werkzeug zur Untersuchung der analytischen NPs in biologischen Matrizen ¹¹ verwendet. HSI Systeme erzeugen eine dreidimensionale Darstellung der räumlichen und spektralen Daten, als Hypercube oder DATACUBE ¹² bekannt. Die räumliche Karte von spektralen Variation für Materialidentifikation verwendet. Spektralprofile bekannte Materialien erzeugt und als Referenzbibliotheken für den Vergleich mit unbekannten Proben verwendet werden. Einer der großen Vorteile, die mit HSI Systemen ist ihre Fähigkeit, mit Abbildungsspektroskopie kombiniert realisiert und damit die Lage und Verteilung der unbekannten NPs in vivo oder ex vivo sowie deren Verknüpfung mit einem anderen Referenzpartikel von bekannten, ähnlichen Zusammensetzung.

Es gibt mehrere Vorteile dermit HSI-Systeme gegenüber konventionellen bildgebenden Verfahren: minimale Probenvorbereitung erforderlich ist; Probenvorbereitung ist in der Regel nicht-destruktive in der Natur; Bildaufnahme und Analyse schneller ist; die Technik kostengünstig ist ^13; und die räumliche Verteilung und die Analyse von Verbindungen mit gemischter Zusammensetzung und / oder in komplexen Matrizen leichter durchgeführt ^14.

Für Nanomaterialien Forschung mit wertvollen Proben, ist einer der wichtigsten Aspekte der Verfügbarkeit einer zerstörungsfreien bildgebendes Verfahren, das für das Potential wiederholt untersuchen Proben durch eine oder mehrere Methoden ermöglicht. Wiederholte oder mehrere Analysen erwünscht, um umfassende Datenbestände, die nicht wäre von einer einzigen Methode zur Verfügung zu entwickeln. Um dieser Hinsicht studiert seine optischen Eigenschaften ist der sicherste Weg, um die Probe zu analysieren. Durch Verwendung eines verstärkten Dunkelfeldmikroskop (EDFM) und HSI-System, um die optische Antwort der Probe zu untersuchen - nämlich reflectance, aber auch die Absorption und Durchlässigkeit - Funktion Identifizierung und Charakterisierung durchgeführt ¹⁵ werden. Potenzielle Charakterisierung Endpunkte umfassen eine Beurteilung der relativen Größe und Form von Nanopartikeln oder Agglomerate und Verteilung von Nanopartikeln in einer Probe.

In diesem Papier beschreiben wir Mapping-Methoden, die speziell für Metalloxid-Nanopartikeln in post-mortem Gewebe mit einem HSI-System basiert auf einer Pixel-spektrale Übereinstimmung Algorithmus, um als spektraler Winkel Mapper (SAM) bezeichnet. Wir haben uns für diese spezielle Anwendung, weil sie das Potenzial, um in vivo Nanotoxikologie Forschung, bei der Tiermodelle werden verwendet, um die gesundheitlichen Auswirkungen der Exposition gegenüber Nanomaterialien zu bewerten ergänzen aktuelle und zukünftige hat. Anwendung dieses Verfahrens könnte auch nanoskalige Arzneimittelabgabe Forschung, die Gewebe oder Tiermodellen verwendet zu informieren. Insbesondere Nanopartikel-Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung im gesamten organs und Geweben konnte mit diesem System untersucht werden. Eine breite Vielfalt von Anwendungen für die Verwendung in der biomedizinischen Forschung ¹¹ untersucht.

Dieses Verfahren könnte für die Beurteilung der verschiedenen biologischen Proben (wie beispielsweise verschiedene Arten Geweben, Bronchiallavage Proben und Blutausstrichen), die Nanopartikel aus einer Vielzahl von Elementzusammensetzungen ^16-19 ausgesetzt worden sind, verwendet werden. Darüber hinaus ist dieses Verfahren für die Untersuchung Nanopartikel Bioverteilung in vivo und in vitro, die einschlägigen für nanoskalige Arzneimittelverabreichungsstudien ^11. Über biologische Proben kann EDFM und HSI verwendeten Nanopartikel in Umweltproben, wie beispielsweise Abwasser ²⁰ auszuwerten. Berufliche Expositionsbewertung kann durch die Verwendung dieser Technik als auch erleichtert werden, denn es kann verwendet werden, um die Wirksamkeit von persönlicher Schutzausrüstung bei der Verhinderung Nanopartikel Eindringen zu bewerten. Darüber hinaus wird die Forschung teUhr entwickelt derzeit eine ähnliche EDFM und HSI-Protokoll für die Bewertung der Filtermedien Proben von Nanopartikeln aus beruflichen Expositionsbewertungen gesammelt. Während Herstellung dieser verschiedenen Probentypen für EDFM und HSI kann variieren, ist es wichtig, dass sie in einer Weise, dass sie leicht durch das optische System visualisiert werden hergestellt. In der Regel sollte die Probe vorbereitet, als ob es über herkömmliche Hellfeldmikroskopie sichtbar gemacht werden kann. Es gibt mehrere hyperspektrale Bildgebungssysteme im Handel erhältlichen ^11.

Protocol

Tier Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss auf der Ermittler zusammen Institution, Stony Brook University zugelassen. Eine Liste von spezifischen Materialien und Ausrüstung für diesem Papier können in Tabelle 1 gefunden werden.

1. Probenvorbereitung von Geweben

1. Bereiten Sie die Metalloxid-Nanopartikel für die histologische oder immunhistochemische Färbung nach zuvor beschriebenen Verfahren ^21-23 ausgesetzt tierischen Geweben.

2. Imaging

1. Initialisieren des Mikroskop
   HINWEIS: Für diese Studie wurde ein Forschungsqualität Mikroskop verwendet wird, mit einem High-Performance-Dunkelfeld-Lichtquelle ausgestattet, motorisierte XY-Tisch-Controller, 14-Bit-Tiefe hyperspektralen Kamera und mehrere Objektive (10x Luft, 40X Luft, 100X Ölimmersion) . Das hier verwendete System hat eine 64 nm Ortsauflösung bei 100-facher (Öl-Immersion) Vergrößerung. Die für diese Zucht eingesetzt Kondensatory hat sowohl Koehler und kritische Beleuchtung Merkmale und konzentriert sich eine hoch gebündelten Licht in schrägen Winkeln auf die Probe.
   1. Schließen Sie an und schalten Sie die Lichtquelle, XY-Tisch-Controller, optische Kamera (für Dunkelfeld-Bildgebung), hyperspektralen Kamera und Computersystem. Stellen Sie die Lichtquelle zu 75% Energie; heben die Bühne, um maximale Höhe; Verbinden der Lichtleiter mit dem Kondensator für eine verbesserte Dunkelfeld-Abbildung oder zum Kollimator auf der Rückseite des Mikroskops für reflektiertes Hellfeld-Bildgebung.
      HINWEIS: Durch das Einstellen der Lichtquelle auf 75% Leistung, eine ausreichende, gleichmäßige Ausleuchtung aller Pixel innerhalb des gesamten Sichtfeld, die stumpfer Pixel erhöht, während immer noch so dass für Kontrast zwischen matt und helle Pixel.
   2. Heben Sie den Kondensator in die Arbeitsstellung. Bewerben 3-5 Tropfen-Typ-A Immersionsöl auf die Sammellinse sorgfältig, Vermeidung der Bildung von blasen. Wischen Sie das Öl und erneut darauf wenn Blasen bilden.
   3. Positionieren Sie den Schiebe on die Bühne. Langsam heben Sie den Kondensator, bis die Immersionsöl in Kontakt mit der Folie. Dies wird durch die Aufhellung schnell Ring der Beleuchtung in dem das Öl in Kontakt mit der Folie bemerkbar.
2. Legen Sie die 10X-Objektiv vorhanden. Konzentrieren Sie sich und richten Sie den Kondensator durch die Untersuchung durch die Okulare.
   1. Bewegen Sie die Stufe nach oben und unten über die Grobziel Fokusknopf, bis die Helligkeit maximiert wird.
   2. Bewegen Sie den Kondensator Schwerpunkt nach oben und unten über den Kondensator Einstellknopf, bis die maximale Helligkeit gefunden wird. Versuchen, den hellsten zentrale Lage im Sichtfeld möglich zu gestalten.
   3. Stellen Sie den Kühler Ausrichtungsknöpfe wie nötig, um den hellen Punkt zu zentrieren, wenn nötig.
   4. Mit dem Feinziel Fokusknopf, um den hellen Punkt zu fokussieren. Beim Wechsel Ziele, um eine andere Vergrößerung zu erhalten, stellen Sie die Fokusebene. Bei Verwendung des 100X Ziel, einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas, um th zu verbesserne Bild und eine Beschädigung des Objektivs zu vermeiden.
3. Aufnehmen von Bildern
   1. Verwenden Tischsteuerung, um eine Region von Interesse zu finden. Dieser Bereich wird durch die Bedürfnisse des Experiments bestimmt werden. Eine typische Anzeige mit hohem Kontrast mit den umliegenden Regionen, wie Gebiete mit Metalloxid-Nanopartikel durchdrungen heller als Bereiche ohne sie erscheinen oft.
   2. Bringen Sie die Region in den Fokus mit Hilfe der Feinfokusknopf Ziel, die Anpassung der Kondensator Fokus wie nötig, um die Beleuchtung zu äquilibrieren. Erreichen eine kontrastreiche, gut definierten Bereich innerhalb des Sichtfeldes.
   3. Welche bestimmen Bilder (für die optische Kamera) oder datacubes (für den hyper Kamera) erfasst werden soll, und in welcher Reihenfolge. Typischerweise werden optische Bilder mit einem 10X Luftziel, 40X Luftziel und 100X Ölimmersionsobjektiv und einer entsprechenden HSI Datenwürfel mit einer 100X Ölimmersionsobjektiv erhalten.
      1. Öffnen Sie das optische Imaging-Software. Klicken Sie auf "Einstellungen &# 8221; in der Menüleiste. Wählen Sie die "Bild-Capture-Taste für die Aufnahme Ereignis". Wählen der gespeicherten Bildformat (TIFF wurde für dieses Experiment verwendet wird); vergeben Sie einen Dateinamen; durchsuchen und wählen Sie ein gespeichertes Bild Ordner; Halten Standard Zeitraffer; klicken Sie auf "OK".
      2. Wählen Sie die Belichtungseinstellungen, die die höchste Bildkontrast im Menü "Exposure" zu erstellen (für diese Studie, ein Niveau von 0,0%, Gewinn von 3,0 dB, und Verschlusszeit von 35 ms wurden verwendet).
      3. Nehmen Sie das Bild durch Klicken auf die Schaltfläche "Bild" in der Menüleiste. Erfassen mehrerer schwacher Vergrößerung Dunkelfeld-Bilder zusätzlich zu denen bei hoher Vergrößerung durch Änderung der Mikroskopobjektive, um Rahmen zu schaffen.
         HINWEIS: Nehmen Sie optische Bilder bei gleicher Vergrößerung wie alle datacubes, die mit der hyperspektralen Kamera aufgenommen werden, da diese optischen Bilder neigen dazu, ein größeres Sichtfeld und eine bessere Ästhetik zur späteren Sichtkontrolle zu haben. Es ist wichtig, dass jeder datacUBEs die später spektral analysiert wird Verwendung konsistent Vergrößerung, wie es möglich ist, dass eine Änderung des Ziels der Transmissionsspektren der Mikroskopoptik, die Änderung der erfassten Spektren und somit die Genauigkeit der Spektralwinkel Mapper (SAM) Reduzieren verändern. Wenn einer Datenwürfel ist mit einem anderen Datenwürfel mit einem anderen Ziel verglichen, kann der SAM-Funktion nicht.
   4. Wählen Sie das hyperspektrale Kamerabilddetektor durch eine Umschichtung der Lichtquelle Knopf am Mikroskop zu der hyperspektralen Kamera. Wenn das Licht in Richtung der hyperspektralen Kamera gerichtet ist, wird kein Bild in der optischen Kamera-Software angezeigt. Zu minimieren, aber nicht die Imaging-Software-Fenster optischen nicht schließen, wie man es brauchen kann, wie in Schritt 2.4.4 spezifiziert.
4. Capturing Datacubes
   1. Öffnen Sie die hyperspektrale Bildbearbeitungssoftware für den Erwerb von HSI datacubes. Sicherstellen, dass der Lichtleiter ist mit der hyperspektralen Kamera gerichtet ist.
   2. Open "Hyperspectral Microscope "in der Menüleiste und wählen Sie" HSI Mikroskop Controls ".
   3. Stellen Sie die Objektivvergrößerung und den Speicherpfad. Sicherstellen, dass alle Bilder und Dateien unverwechselbar so kein Überschreiben auftritt, zu nennen. Verändern der Fläche Erfassung in Einstellungen durch Einstellen des Sichtfeldes oder der Anzahl von Zeilen (720 Zeilen verwenden für diese Studie), mit einer signifikanten Menge von zusätzlichen Zeit für die Erfassung größerer Flächen erforderlich. Schließlich, stellen Sie die Belichtungszeit (0,25 sec für diese Studie). Lassen Sie alles andere, um die Standard und klicken Sie auf "Vorschau HSI", um das Bild anzuzeigen.
      Hinweis: Der Intensitätsgraph, das angezeigt wird zeigt die HSI Datenwürfel, die in der horizontalen Achse aufgezeichnet wird. Die vertikale Achse repräsentiert die Wellenlängen der Spektren, die in dem Datenwürfel HSI aufgenommen wird. Positionieren des Cursors an einer beliebigen Position auf der Intensitätsgraphen entspricht einer spektralen Wellenlänge bewirkt, daß die Intensitäten aller Punkte über das Bild, bei dieser Wellenlänge, gezeigt werden.
   4. Passen Sie die Intensität dieser Vorschau durch Einstellen Quelle Helligkeit, Kondensor Fokus, oder Abbrechen der Vorschau, um die Belichtungszeit einzustellen. Letztere liefert die besten Ergebnisse, aber erhöhte Belichtungszeit länger, um Bild zu nehmen. Das Ziel ist, die höherwertigen Peaks ausreichend groß, aber die maximale Intensität für den Detektor nicht überschreiten darf; Hier ist der ideale Bereich zwischen 1.000 und 16.000 Einheiten.
   5. Klicken Sie auf "Capture". Das Mikroskop wird zu bitten, eine Dunkelstrombild zu nehmen. Leiten Sie den oberen Schieberegler oder Blende (vorsichtig, um nicht um die Ausrichtung zu störenund Fokus der einen der anderen Optik), und klicken Sie auf "OK". Stellen Sie die Schieberegler oder die Öffnung in die richtige Position, und klicken Sie erneut auf "OK", wenn Aufforderung zum Bild erscheint. Imaging kann bis zu 30 Minuten dauern, wenn auch mal von ca. 5 min sind typisch. Längere Belichtungszeiten führen zu längeren Aufnahmezeiten. Eine Statusanzeige vorhanden ist. Achten Sie darauf, physisch stören den Umfang, bevor die Statusanzeige beendet.
   6. Beachten Sie vier neue Fenster mit den Namen: "Verfügbar Bands Liste", "# 1zoom", "# 1scroll" und "# 1 RGB-Band". Maximieren Sie das Fenster "# 1RGB Band", da dies die Datenwürfel für alle zukünftigen Referenzen.
   7. Rechtsklick auf die Datenwürfel und speichern Sie es als TIFF und klicken Sie auf "OK". Wenn fertig Bildgebung; weggeräumt alle Proben; Reinigen Sie alle Öl-freiliegenden Flächen mit 70% Isopropanol in Wasser; erhöhen Bühne, um maximale Höhe; Unterkühler zur Mindesthöhe und drücken in die Nicht-Betriebsposition; geschlossennach unten oder ziehen Sie die Lichtquelle, Tischsteuerung und Kameras.

3. Erstellung von Referenzspektrenbibliotheken

1. Auswahl von Referenzspektren
   1. Wählen eine positive Kontrolle, die bekanntermaßen das Material in der gleichen Matrix wie die Versuchsproben enthielten Interesse enthalten, da HSI Spektralprofile matrixabhängig.
      1. Für diese Studie verwenden Schweinehaut mit hohen Dosen von Metalloxid-Nanopartikeln als positive Kontrolle für den Vergleich mit dem experimentellen Schweinehautgewebe von einem topischer Studie injiziert. Die spektralen Profile der Metalloxid-Nanopartikel in Suspension erzeugt und untersucht und festgestellt, dass eine unangemessene positive Kontrolle für die histologische experimentellen Proben werden durch die unterschiedlichen Matrizen.
   2. Besorgen Sie sich einen Datenwürfel aus der positiven Kontrolle, wie in Schritt 2.4 beschrieben. Verwendung der hyperspektralen Kamera.
      1. Seien Sie besonders vorsichtig, wenn setting die Intensität, da dies die primäre Metrik mit denen der innere Partikelfilter werden die Materialien zu identifizieren. Etwaige Intensitäten über dem Sättigungspunkt des Detektors (hier 16.000 Einheiten) wird in einem ungültigen Daten führen (siehe Schritt 2.4.5.).
   3. Rechtsklicken Sie im Bildfenster, und klicken Sie links "Z-Profil-Spektrum". Ein Pop-up Spectral Profil-Fenster erscheint. Linksklick auf Pixel von Interesse auf der Datenwürfel, insbesondere den hellsten oder solche, die man getrost als die die Material von Interesse identifiziert werden können. Beachten Sie die Spectral Profil Fenster mit der zugehörigen Spektrums. Beachten Sie vor allem ihrer niedrigsten und höchsten Wert und dem Wellenlänge entspricht es.
      1. Bei der Vermessung der positiven Kontrollprobe, einer Umfrage, indem Sie auf die Regionen von Interesse, die in Bezug auf das umgebende Gewebe sehr hell, vor allem solche mit leicht identifizierbar Teilchen sind. Diese Partikel sind sehr wahrscheinlich die materrialien von Interesse, besonders im Fall von Metallen.
   4. Verwenden Sie die "Partikelfilter" Werkzeug im Menü "Partikelanalyse", um in der Datenwürfel vorhandenen Partikel zu identifizieren. In der neuen Pop-up Fenster, beachten Sie die "Spectral Max überschreiten muss". Dies wird durch Beobachtungen in Schritt 3.1.3 bestimmt werden. Stellen Sie diesen Wert so dass es höher als Hintergrundpixel, aber niedriger als die Materialien von Interesse ist. Die "Valid Data Max" ist die maximale Intensität (hier 16.000 Einheiten).
      1. Lassen Sie andere Parameter auf Default, aber schließen Objekte nach Größe durch Einstellen der "Größenschwelle" ein. Speichern Sie diese Daten entweder an dieser Stelle oder nach der Analyse. Für dieses Experiment wurden die folgenden Parameter: Spectral Max überschreiten muss: 5.000; Valid Data Max: 16.000; Größe Schwelle (Pixel): 400. Wenn alle Parameter eingestellt sind, klicken Sie auf "OK".
   5. Beachten Sie die resultierende Graph mit den DetailsTeilchen im angegebenen Intensitätsschwellenwert festgestellt wird; Diese Daten können exportiert werden. Wenn der Kenn maximalen Reflexionswellenlänge des Materials von Interesse bekannt ist, wählen diese Partikel, die eine ähnliche "Max WL" Wert haben; Andernfalls klicken Sie auf "Alle auswählen". Klicken Sie dann auf "Export"; "Zu Spectral Library". Wählen Sie einen Dateinamen ein und klicken Sie auf "OK".
2. Entfernen Sie falsch-positive Spectra
   1. Wählen Sie eine Probe, die als negative Kontrolle dienen wird. Probe sollte vorbereitet und in gleicher Weise behandelt, wie alle Versuchsproben zu speichern, dass das Fehlen ähnlich oder identisch zu dem Material von Interesse Nanopartikel gewährleistet sein.
      Anmerkung: Es ist wichtig, dass die Matrix der Negativ-Kontrolle ist die gleiche wie die Matrix der Versuchsproben als HSI Spektralprofile matrixabhängig. Für diese Studie verwendeten wir Schweinehaut, die nicht mit Metalloxid Nanomaterialien als Negativ belichtet wurdeKontrollen.
   2. Erhalten mehreren datacubes vom negativen Steuerung wie in Schritt 2.4.7 beschrieben, unter Verwendung des hyperspektralen Kamera. Mindestens eine erforderlich ist, aber mehr können eingefangen, um die Selektivität zu erhöhen (dies ist in dem Fall besonders wichtig, dass einige Kontaminanten können in den Referenzspektren sein).
   3. Verwenden Sie die hyperspektrale Bildbearbeitungssoftware, die spektrale Bibliothek in Schritt 3.1 (Positivkontrolle) gegeneinander Datenwürfel gesammelt Filter in Schritt erfasst 3.2.2 (Negativkontrollen) in Reihe, wie in den folgenden Schritten angewiesen:
      HINWEIS: Speichern Sie die resultierende, gefilterte Spektrenbibliothek in einer separaten Datei, und verwenden Sie als Referenzspektrenbibliothek für das Material von Interesse.
      1. Klicken Sie auf "Filter Spectral Library" unter dem Menü Analyse, an der Hauptprogramm-Symbolleiste. Klicken Sie auf "Öffnen"; "Neue Datei" und wählen Sie die Spektrenbibliothek in Schritt 3.1 erstellt. für die positive Kontrolle wie die Eingabedatei. Klicken Sie auf "OK".
      2. Vordergrundxterne Quelle, wählen Sie "Bild" unter der Spektraldaten Feld. Behalten Sie die Standardeinstellungen unter dem Feld Verarbeitungsparameter. Wählen Sie ein Ausgabename für gefilterte Bibliothek (dies sollte anders sein als das Original, oder den unveränderten Spektrenbibliothek gesammelt gehen verloren). Klicken Sie auf "OK".
      3. Klicken Sie auf "Öffnen"; "Neue Datei" und wählen Sie den ersten Datenwürfel in Schritt 3.2.2 für die Negativkontrolle, wenn Sie aufgefordert, ein Quellbild wählen Sie eingefangen.
         Hinweis: Die Software wird die spektrale Bibliothek analysieren und entfernen Sie jedes Spektrum, das jede Spektrum der negativen Kontrolldatenwürfel entspricht. Entfernen der Hintergrund aus den Auswahlkriterien reduziert dadurch Potenzial für falsch-positive. Eine Zusammenfassung wird verfügbar sein, wenn dies geschehen ist (beachten Sie, dass diese Zusammenfassung wird nicht automatisch gespeichert).
      4. Wenn zusätzliche Filterung erwünscht ist, wiederholen Sie die Schritte 3.2.3.1 Ausnahme: Schritt 3.2.3.2, wählen Sie die letzte gefiltert Spektrenbibliothek erstellt (nach dem Schritt 3.2.3.3 resultierenden co.mpletes); in Schritt 3.2.3.3, wählen Sie die nächste Datenwürfel aus Schritt 3.2.2.
         HINWEIS: Korrigieren und Normalisieren des Lampenspektrums kann notwendig sein, wenn die Proben streuen eine beträchtliche Menge an Licht (zB Kohlenstoffnanoröhren) und / oder Null-Spektren bleiben beim Filtern eine positive Kontrolle Spektralbibliothek gegen eine Negativkontrolle. Diese Umstände nicht für unsere Studie ergeben und so diese Korrektur nicht durchgeführt wurde.

4. Bildanalyse

1. Spectral Angle Mapping
   1. Öffnen Sie die "Spectral Angle Mapper" (SAM) aus der Spectral-Menü Mapping Methoden Untermenü mit der hyperspektralen Imaging-Software, wenn alle experimentellen datacubes wurden folgenden Schritt 2.4 erworben. Die spektrale Winkel Mapper vergleicht Spektren von den Änderungen geometrisch Analysieren der Intensität als Funktion der Wellenlänge (dh es werden zwei Spektren durch Normalisierung ihrer Intensität und Vergleichen der Winkel erneuterforderlich ist, um die Grafik der einzelnen Spektren) ²⁴ zu verfolgen.
   2. Mit dem Datenwürfel öffnen, wählen Sie den Namen der experimentellen Datenwürfel im Popup-Fenster und klicken Sie auf "OK". Wenn keine Dateinamen aufgelistet sind, klicken Sie auf "Öffnen"; "Neue Datei", wählen Sie die experimentelle Datenwürfel, klicken Sie dann auf "OK".
      1. Beachten Sie ein neues Popup-Fenster aufgerufen Endmember Collection: SAM. Klicken Sie auf "Import" in der Menüleiste und wählen Sie dann "von Spectral Library-Datei". Ein Popup-Fenster mit dem Namen Spectral Bibliothek Eingabedatei erscheint. Öffnen Sie die Spectral Library of Referenz, die in Schritt 3.2.3 erstellt wurde. und klicken Sie auf "OK". Beachten Sie ein neues Pop-up-Fenster mit der Bezeichnung "Input Spectral Library".
      2. Klicken Sie auf "Wählen Sie alle Elemente"; klicken Sie auf "OK" klicken Sie rechts auf "Farbe" und wählen Sie "Übernehmen von Standardfarben auf alles." Klicken Sie auf "Alle auswählen", gefolgt von "Übernehmen" und wählen Sie dann den Namen der Ausgabedatei eind Klicken Sie auf "OK". Der Spectral Angle Mapper wird ein paar Sekunden dauern, zu analysieren und speichern Sie die Daten.
   3. Öffnen Sie die Datenwürfel in der hyperspektralen Bildbearbeitungssoftware. Wählen Sie "Klassifikation" in der Overlay-Menü des Bildfensters, dann auf den Dateinamen zu navigieren und klicken Sie auf "OK". Der Benutzer kann nun überlagern jede Spektrum aus der Bibliothek, um zu sehen, wo sie Karte, um in das Bild.
   4. Wählen Sie die Option "Merge Klassen" im Optionsmenü in der "Interaktive Klassen Hilfe" geöffnet durch das Overlay-Menü im Bildfenster, wenn eine einheitliche Farbgebung gewünscht ist, wie beispielsweise für eine einfachere Analyse von anderer Software (wie in Schritt 4.2 beschrieben .).
   5. Markieren Sie alle Klassifikationen zu kombinieren (in der Regel, alles außer "nicht klassifiziert" in den "Klassen, in die Basis zusammenführen" Liste), und wählen Sie ein einzelnes Spektrum aus der Liste "Basisklasse", klicken Sie dann auf "OK". Diese Farbe wird nun REPRESent alle ausgewählten Spektren.
   6. Klicken Sie auf die ausgewählte Farbe und alle passenden Spektren werden in dieser Farbe angezeigt.
   7. Um ein dichromatisches Bild, das die passenden Spektren über einem schwarzen Hintergrund, cIick auf der "nicht klassifiziert" Farben-Box, die schwarz ist standardmäßig zeigen wird, zu erhalten. Beachten Sie einen dichromatisches Bild. Dieser Schritt kann durch erneutes Klicken auf die "nicht klassifiziert" Farben-Box umgekehrt werden.
   8. Rechtsklicken Sie auf, um das Bild als TIFF speichern, darunter alle Overlays aktiv.
      HINWEIS: Für zukünftige Bildverarbeitung wird ein dichromatisches Bild verwendet werden.
   9. Wählen Sie "Klassenverteilung" aus dem Optionsmenü im Fenster "Interaktive Class Tool", um die Mapping-Statistiken zu erwerben. Diese Daten repräsentieren, wie viele Pixel waren nicht zugeordneten (nicht klassifiziert) und wie viele wurden als das Material von Interesse identifiziert. Man beachte, dass die Anzahl der Pixel nicht mit der Anzahl der Partikel abgebildet entsprechen. Diese Informationen sind nicht automatisch recorded.
2. Partikelanalyse in Hyper Mapped Bilder
   1. Öffnen Sie die Bilder in NIH ImageJ Software.
   2. Verwenden Sie das Menü Bild einstellen Untermenü Funktion "Threshold". Wählen Sie Parameter, die Partikel von Interesse von allen anderen Materialien zu unterscheiden. Verwenden Sie die folgenden Schwellenparameter für diese Studie: Standardschwellenmethode, Farbe rot, HSB-Farbraum, überprüft dunklen Hintergrund Kontrollkästchen, geprüft Passkontrollkästchen für Farbton, Sättigung und Helligkeit.
      Hinweis: Dies kann erheblich von Fall zu Fall variieren. Bei der Analyse eines Datenwürfel abgebildet, kann dies durch die Vereinheitlichung aller relevanten Klassen zu einer einzigen Farbe und überlagert diese Farbe mit allen Farben, nicht klassifiziert vor der Erzeugung des Bildes (Schritte 4.1.4 bis 4.1.8) vereinfacht werden.
   3. Verwenden Sie das Menü Analysieren "Analyze Partikel" Funktion, die Informationen zum Bereich abrufen wird, meine, Minimal- und Maximalwerte. Für diese Studie, verwenden Sie die Parameter hier: Größe 0-unendlich, Zirkularität0-1, zeigen nichts, überprüft Anzeige Ergebnisse Checkbox.
   4. Für die statistische Analyse, den Export dieser Daten in eine andere Software-Programm ermöglicht statistische Vergleich mit der Anzahl und Größe der Partikel in ähnliche Kontrollproben entfernt. Wir empfehlen die Verwendung einer Tabelle für die Analyse von ImageJ Daten. In der Ergebnistabelle nach Schritt 4.2.4 angezeigten Daten sollten in eine Tabellenkalkulation kopiert werden. Die MAX-Funktion kann auf dem ersten (ohne Titel) Säule verwendet werden, um die Anzahl von Partikeln zu bestimmen, während der Durchschnittsfunktion kann auf der Spaltenbereich verwendet werden, um den mittleren Größe eines Teilchens zu bestimmen. In Zukunft werden experimentelle Validierung verfolgt werden, um diese Funktion bei der Bestimmung mittlere Größe gegen einen etablierten Standard für die Auslegung (zB TEM) untersucht werden.

Representative Results

Hyperspektraler Mikroskopie nützlich ist für seine Fähigkeit, Materialien in einer ähnlichen Weise wie Spektrophotometrie identifizieren. Wie in Figur 1 angedeutet, hat jede Material mehrere charakteristische Spektren und eine Gesamtform der Reflexionsgrad, die einzigartig ist. Ferner veranschaulicht 1 die Matrix-abhängige Natur der spektralen Profilen: die spektralen Profile für jeden der drei Metalloxide in histologischen Gewebeproben (oberes Feld) verschieden von den spektralen Profilen für jede der drei Metalloxide in wässriger Suspension (sind Bodenplatte). Durch die Zuordnung der charakteristischen spektralen Profile unbekannter Proben in der gleichen Matrix, ist die Technik zum Bestimmen von Anwesenheit oder Abwesenheit eines Materials und kann auch halbquantitativ vergleichen relativen Mengen des Materials in den Proben.

Die Referenzspektrenbibliotheken aus positiven Kontrollhautproben erstellt für die Zuordnung zu experimentellen geeignet sindHautproben. Wie in 2 zu sehen, ordnen die Referenzspektrenbibliotheken auch zu den entsprechenden positiven Kontrollen und nicht zu den entsprechenden Negativkontrollen Karte.

Der wichtigste Vorteil des Verfahrens ist die Möglichkeit, geringe Mengen von Materialien von Interesse in den Proben zu erfassen, sowie um sie von Verunreinigungen zu unterscheiden. . Beispielsweise können einzelne Nanotubes in der Lunge während der Inhalation von Dosen so niedrig wie 40 & mgr; g in einem 20-30 g ^Ratten-25 beobachtet werden Abbildung 3 zeigt dies in histologischen Hautproben: während einige Partikel in der Dunkelfeld-optische Bild ohne weiteres auf der Hand (Spalte 2), andere mit hyperspektrale Bild (Spalte 3) mit Hellfeldmikroskopie (Spalte 1) oder andere Methoden, die verpasst haben könnte nachgewiesen. Die Verwendung von Dunkelfeld HSI dient auch dazu, die Spezifität gegenüber einfachen Hellfeldmikroskopie zu verbessern. Diese Bilder können dann einer mehr quantitativen Analyseformen sein, notably Partikelanalyse mittels ImageJ.

Verbesserte Dunkelfeldmikroskopie hat verschiedene Anwendungen, auch in Abwesenheit von hyperspektrale Bild. Die erste ist die Fähigkeit, hochqualitative, hochkontrastreiche Bilder zu erzeugen. Dies wird am besten durch Figur 3 gezeigt, in der Teilchen von Interesse im Vergleich zu ihren Pendants Hell leicht identifizierbar sind. Diese Bilder können auch mengenPartikelAnalyse, wenn auch in der Abwesenheit von hyperspektrale Kartierung, ist Vorsicht geboten, um nicht zu verwirren eine Verunreinigung Partikel von einem Partikel von Interesse.

Abbildung 1. Bezugsspektrenbibliotheken (Gewebematrix) im Vergleich zu Spektrenbibliotheken (Nanopartikeln in Suspension). Diese Zahl zeigt die Bedeutung der Erzeugung eines Referenzspektrenbibliothek von nanomaterials von Interesse in der gleichen Matrix als Versuchsproben. Die erste Zeile zeigt die Referenzspektrenbibliothek (RSL) für jedes Material in dieser Studie (Aluminiumoxid, Siliciumdioxid und Ceroxid). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diese RSL wurde nach dem in diesem Protokoll in dem positiven Kontrollgewebeproben wurden vor negativen Kontrollgewebeproben filtriert beschriebenen Verfahren erstellt. Die zweite Zeile zeigt Spektrenbibliotheken (SL) von den Nanopartikeln von Interesse in flüssigen Suspension auf einen Objektträger erstellt. Für Aluminiumoxid wurde eine bimodale Peak bei Wellenlängen von 500 und 650 in der RSL gefunden, wohingegen ein gekrümmter und weniger markanten Peak wurde im Aluminiumoxid NP Suspension SL bei etwa 600 für Siliciumdioxid, ein Peak bei einer Wellenlänge von etwa 650 zu sehen war in der RSL vorhanden, während eine gekrümmte und weniger markanten Gipfel wurde in der Silica-NP Suspension SL bei arou gesehennd 600. Ceroxid wurde eine bimodale Peak bei Wellenlängen von 520 und 620 in der RSL gefunden, wohingegen eine geringere Unterscheidungs ​​Peak wurde im Ceroxid NP Suspension SL bei etwa 560. Dies lässt vermuten, dass die Matrix, in der die Nanopartikel eingebettet sind, erzeugt gesehen eine Verschiebung der Spektren, die erheblich sein können, wenn Sie die Steuerelemente, um die SL für so spezifische Experiment erstellen.

Abbildung 2. Referenzspektrenbibliotheken (Gewebematrix) abgebildet auf positive und negative Kontrollschweinehautgewebe. Dieser Wert dient als Bestätigung der RSLs gegebenenfalls für die Zuordnung zu experimentellen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass jedes RSL (linke Spalte) Karten auch zu seinem entsprechenden Positivkontrolle (mittlere Spalte) und nicht zu seinem entsprechenden Negativkontrolle (rechte Spalte) abzubilden. Bitte klicken here um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Die hyperspektrale Kartierung von experimentellen Schweinehautgewebe, um Metalloxid-Nanopartikeln ausgesetzt. Zeilen von oben nach unten entsprechen verschiedenen Schichten der Haut, von oberflächlich tiefste Schicht: Epidermis, Dermis und des subkutanen Gewebes auf. Die erste Zeile zeigt das Stratum corneum der Epidermis, einer Hautprobe, die auf Aluminiumoxid-Nanopartikel in Suspension ausgesetzt war; die zweite Reihe wurde ausgesetzt, um NPs in Suspension Siliciumdioxid; und die dritte Zeile, um NPs in Suspension Ceroxid. Jede Säule stellt den gleichen Bereich der Haut mit verschiedenen Techniken abgebildet. Die erste Spalte entspricht Hellfeldmikroskopie (40X mag .; Skala bar = 50 & mgr; m), wobei der Bereich in einem roten Quadrat mit wurde vergrößert (100X mag; Maßstabsbalken = 10 & mgr; m) mit einer verbesserten Dunkelfeldmikroskopie (EEFM) in der zweiten Spalte, wo weiße Pfeile auf den hohen Kontrast-Nanopartikel zeigen. Die dritte Säule wurde mit einem hyperspektralen Kamera (HSI) erzielt wurden, die die gleichen hohen Kontrast-Nanopartikel (weiße Pfeile). EDFM und HSI-Bilder wurden bei 100-facher Vergrößerung; Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Die vierte Spalte zeigt die HSI Bild gegen den jeweiligen RSL für jede Expositions-Gruppe, in der Aluminiumoxid-Nanopartikel sind in grün, Silica-Nanopartikel in rot und Ceroxid-Nanopartikel in gezeigt abgebildet gelb sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Für Gewebeproben, die herkömmliche histologische Färbung, die Identifizierung und Analyse von Metalloxid-Nanopartikeln unterworfen wurden, durch eine Kombination von EDFM, HSI Mapping und Bildanalysetechniken erreicht werden. Während es die Flexibilität bei der Probenvorbereitung für die Histologie und Immunhistochemie (zB mit festen oder gefrorenen Geweben, die Art der Färbung), ist es wichtig, dass die Proben mit einer Dicke von 5-10 um für eine optimale Visualisierung geschnitten. Proben wurden hier mit Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten vor dem Schneiden mit einem Rotationsmikrotom bis 6 & mgr; m Dicke, die auf Glasobjektträgern angebracht, mit Hematoxylin und Eosin gefärbt und mit einem Deckglas. Schweinehautgewebe von einem Ex-vivo-Hautpenetrations Toxikologie Zusammenarbeit wurden für diese Studie verwendet. Die Gewebe wurden zu Metalloxid-Nanopartikel (Aluminiumoxid, Siliziumdioxid, Ceroxid) in wässrige Suspensionen belichtet. Der Nachweis der Region (en) von Interesse (hoher Kontrast elemeNTS) mit EDFM ist ein entscheidender erster Schritt, die nachfolgenden HSI-Mapping und Analyse erleichtert. Positive und negative Kontrollproben müssen abgebildet werden und zunächst analysiert, um eine spektrale Bibliothek für Referenz erstellen. Die gesammelten Spektren der Positivkontrolle mit einer positiven Steuerspektrenbibliothek exportiert. Dann werden alle Spektren der negativen Kontroll Bilder von Spektrenbibliothek der positiven Kontrolle ist, um die Spezifität zu verbessern subtrahiert (Fehlalarme zu reduzieren). Die sich ergebende gefilterte Spektrenbibliothek gilt als der RSL, die für die Analyse von Materialien von Interesse dient. Alle Gewebeproben durchlaufen die gleichen Abbildungsverfahren und gegen die RSL abgebildet. Das resultierende Bild wird nur Bereiche mit Elementen von Interesse über einen schwarzen Hintergrund enthalten. Dieses Bild könnte dann mit ImageJ mit seinen Schwellenwert und Partikelanalysefunktionen, die Fläche der abgebildeten Partikel pro Sichtfeld zu erhalten, analysiert werden. Von ImageJ erhaltenen numerischen Daten können Export seined in eine Tabellenkalkulation zur weiteren Analyse.

Es ist wichtig zu beachten, dass als biologische Proben sind von Natur aus unterschiedlich voneinander und Färbeverfahren kann Visualisierung durch EDFM und HSI beeinträchtigen, sollten die Belichtungseinstellungen entsprechend, was das beste Bild mit hohem Kontrast für eine bestimmte Art der Probe bestimmt werden. Obwohl Reduktion von Fehlalarmen durch die Filtration von Spektrenbibliotheken erreicht werden kann, ist es von entscheidender Bedeutung, um zuverlässige negative Kontrollen, die Kontamination mit dem Element von Interesse vermieden werden können, zu erhalten, wie die Spektren entsprechend dieser Verunreinigung könnte möglicherweise von Spektrenbibliothek der positiven Kontrolle die gefiltert werden , die Erhöhung der falsch negativen Ergebnisse. Auch kann das Spektrum Intensitätsbereich, der mit der hyperspektralen Bildbearbeitungssoftware nachweisbar ist die Grenze der bestimmten Software nicht überschreiten (für diese Studie ist, dass 16.000 Einheiten): Gebiete mit einer hohen Anzahl von angesammelten Partikel, die sp produzierenectral Intensitäten über der Intensitätsgrenze werden aus der Spektrenbibliothek gelassen, da die Gefahr einer Erhöhung der Anzahl von falschen Negativen.

Während die HSI System verleiht viele Vorteile gegenüber traditionellen Verfahren gibt es einige Nachteile und Einschränkungen zu berücksichtigen. Einer ist, dass die große Menge von optischen Daten gesammelt werden, können erhebliche Rechenleistung erfordern. Ein weiterer Grund ist, dass HSI kann zeitintensiv sein, vor allem im Anfangsstadium, wenn Referenzspektrenbibliotheken werden geschaffen. Auch kann Bildgebungszeit mehrere Minuten pro Bildaufnahme erfordern, so dass es langsamer als einfache Dunkelfeld-Bildgebung; jedoch ist es immer noch schneller als eine Abtastung Herstellung und Visualisieren durch Elektronenmikroskopie. Zusätzlich können komplexe Systeme in mehreren charakteristische Spektren, die die Entwicklung von hochspezialisierten Kontrollen erfordern und machen die Einrichtung von standardisierten, Universalbibliotheken schwierigen ²⁶ führen. Schließlich ist die Tech-nique zu einer geringeren Auflösung als Sonden- oder elektronenmikroskopische Techniken wie Rasterkraftmikroskopie oder Transmissionselektronenmikroskopie, die einzelne Atome auflösen kann. Auflösung dieses Verfahren ist begrenzt aufgrund seiner photonische Natur, die es entfernt, ein hochpräzises Instrument zur Messung der Partikelgrößen im Nanometerbereich oder für die präzise Platzierung von Materialien bei einer Sub-Mikrometer-Ebene verhindert. Während die Technik in der Lage, Partikel in bestimmten Gewebekammern oder Zellorganellen zu lokalisieren größer als 1 um (wie Zellkerne), kleiner Organellen oder Merkmale sind schwierig genau zu diesem Verfahren zu visualisieren. Auch der Hinweis, aufgrund seiner räumlichen Auflösung kann diese Methode nicht zwischen den einzelnen Nanopartikeln und Agglomerate ¹¹ zu differenzieren.

Andere Überlegungen sind: bestimmte Materialien (zB Edelmetalle) haben viel höhere Reflektivität und unterschiedliche spektrale Profile, die machen sie leichter zu Analyze und spektral Karte mit diesem Tool. Andere, wie den Halbmetalloxide in dieser Studie untersucht und Kohlenstoff-Nanomaterialien ^{24, 27} kann eine größere Herausforderung aufgrund ihrer elementaren Zusammensetzung, Form haben, und in Abhängigkeit von der Matrix. In zwei murinen Inhalationsstudien von Mercer et al., Wurde ein ähnliches System, das in dieser Studie verwendet, um Kohlenstoff-Nanoröhren in der Lunge und in sekundäre Organe auf der Grundlage ihrer bemerkenswert hohen Kontrast mit umgebendem Gewebe zu lokalisieren verwendet. Jedoch wurde hyper Zuordnung nicht in beiden Studien zeigten, wahrscheinlich, weil die einzigartige Form von Kohlenstoff-Fasern war eine ausreichende Eigenschaft zur Identifizierung. Eine weitere Überlegung betrifft speziell auf Gewebe: seit Abscheiden Nanopartikeln interessieren bestimmten Organen durch normale biophysikalischen Prozesse unvorhersehbar ist (und oft selbst das Thema der Studie) kann die Bestimmung eines anwendbaren positive Kontrolle schwierig sein und erfordert Überlegung, wie Erzeugung des Steuer might beeinflussen den Zustand eines Materials von Interesse. Wenn beispielsweise ein Spektrenbibliothek aus unberührten Nanopartikel von Interesse erzeugt, kann es schwierig sein, um die Bibliothek zu denselben Nanopartikel in Geweben oder Zellen der Karte aufgrund von Änderungen in den Spektren von Veränderung des Teilchens (z resultiert, aufgrund einer Änderung in pH, Auflösung, Agglomeration, Proteinbindung) und die Gesamtmikroumgebung oder Matrix. Schließlich ist das Verfahren in seiner semi-quantitative Natur beschränkt: sie kann nur als quantitative andere zweidimensionale Mikroskopietechniken ähnlicher Auflösung, das heißt, sie kann nicht einfach verwendet werden, um Aufgaben wie die Charakterisierung Gesamtorgan Last eines Materials durchführen zu können.

Insgesamt EDFM und HSI bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Nano Bildgebung und Charakterisierungstechniken, wie TEM HAADF und DIC. EDFM / HSI ermöglicht eine schnellere Bildaufnahme und Analyse, die Zeit und Kosten spart im Vergleich zu intensiveren convenlen Techniken. Außerdem ist die Probenvorbereitung für EDFM / HSI typischerweise sowohl minimal als auch zerstörungsfrei, das spart Zeit und ermöglicht eine flexiblere Analyse einer bestimmten Probe, da es dann für andere Techniken eingesetzt werden. Weiterhin ist HSI vielseitig, so für die Analyse von nanoskaligen Materialien vieler Zusammensetzungen und in einer Vielzahl von Matrizen. Das Forscherteam arbeitet daran, die für andere Materialien und Probentypen, einschließlich einer eingehenden Beurteilung der Spezifität der Technik beschriebene Verfahren zu verfeinern. Eine kritische nächste Schritt untersuchte das Forscherteam ist die Validierung dieser Verfahren gegen die traditionelle Goldstandards (zB Raman, TEM, SEM) für die Materialien und Gewebetypen von Interesse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CytoViva 150 Unit (condenser)	CytoViva (Auburn, AL)		mounted to Olympus BX43 microscope
Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100X oil immersion objective	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		for use with CytoViva 150 Unit condenser
Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		enhanced darkfield camera and software
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		hyperspectral camera and software
cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides)	Schott NEXTERION	1025087	reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging
cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22 mm x 22 mm x  1.45 mm)	Schott NEXTERION	custom	reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging
type A microscopy immersion oil	Fisher Scientific	12368B	multiple suppliers
70% isopropanol in water			multiple suppliers
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH)		free open-source software online download
metal oxide nanoparticles	supplied to the research team by industrial partners		alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.