Identifisering av Metal Oxide Nanopartikler i Histologiske Samples av Enhanced Darkfield Mikroskopi og Hyperspektral Mapping

Introduction

Som nanomaterialer blir stadig mer brukt i en rekke bransjer og applikasjoner, er det behov for nanoskala bildebehandling og karakterisering metoder som er raskere, rimeligere og praktisk enn tradisjonelle modaliteter, for eksempel elektronmikroskopi. For å visualisere nanopartikkel (NP) interaksjoner med celler, vev og levende systemer, mange optiske teknikker har vært ansatt, inkludert kontrast differensial forstyrrelser (DIC) mikroskopi ^{1 og} flyktige feltbaserte tilnærminger, som total intern refleksjon (TIR) ​​eller nær- feltet skanning optiske mikroskopi (NSOM) ^2,3. Men disse er high-end analytiske tilnærminger, utilgjengelig for de fleste ikke-spesialiserte laboratorier ^4. Elektronmikroskopi, inkludert transmisjonselektronmikroskopi (TEM), har også blitt brukt til å studere NP interaksjon med celler ^5,6,7,8. Høy vinkel ringmørkefelt (HAADF) scanning transmisjonselektronmikroskopi har blitt brukt til å studere samspillet av NPsmed virus ^9. Konfokalmikroskopi er en annen populær teknikk som brukes for å studere NP-celle interaksjoner ^10.

I de senere årene har mørkefelt-baserte hyperspektral avbildning (HSI) teknikker blitt brukt som et lovende analytisk verktøy for å studere NPs i biologiske matriser ^11. HSI-systemer generere en tredimensjonal representasjon av romlig og spektral data, kjent som en hyperkube eller Datacube ^12. Den romlige kartet spektralvariasjonen brukes for material identifikasjon. Spektrale profiler av kjente materialer som kan genereres og brukes som referansebibliotek for sammenligning med ukjente prøver. En av de store fordelene med HSI systemer er dens evne til å kombinere avbildning med spektroskopi, for derved å etablere plasseringen og fordelingen av ukjente NPS in vivo eller ex vivo, så vel som at de kobles til en annen referanse partikkel av kjente, lignende sammensetning.

Det er flere fordelerbruker HSI systemer over konvensjonelle bildeteknikker: minimal prøveopparbeidelse er nødvendig; prøveopparbeidelse er typisk ikke-destruktiv i naturen; image innsamling og analyse er raskere; den teknikk som er kostnadseffektivt ^13; og den romlige fordelingen og analyse av forbindelser av blandet sammensetning og / eller i komplekse matrikser er lettere oppnås ^14.

For nano forskning som involverer kostbare prøver, en av de viktigste hensyn er tilgjengeligheten av en ikke-destruktiv fremgangsmåte for billeddannelse, som gjør det mulig for den potensielle gjentatte ganger å undersøke prøver av en eller flere metoder. Gjentatt eller flere analyser kan være ønskelig å utvikle omfattende datasett som ikke ville være tilgjengelig fra en enkelt metode. Til denne forbindelse, studere sine optiske egenskaper er den tryggeste måten å analysere prøven. Ved å bruke en forbedret mørkefelt mikroskop (EDFM) og HSI system for å studere den optiske responsen av prøven - nemlig Reflectance, men også absorbans og transmisjon - funksjonen identifisering og karakterisering kan utføres ^15. Potensielle karakterisering endepunkter omfatter en vurdering av relativ størrelse og form av nanopartikler eller agglomerater og fordeling av nanopartikler i en prøve.

I denne artikkelen beskriver vi kartleggingsmetoder spesifikt for metalloksid nanopartikler i post-mortem vev ved hjelp av en HSI system basert på en piksel-spektral kamp algoritme referert til som en spektral vinkel mapper (SAM). Vi valgte denne søknaden fordi den har potensial til å komplettere nåværende og fremtidige in vivo nanotoxicology forskning, hvor dyremodeller brukes for å vurdere de helsemessige konsekvensene av eksponering for konstruerte nanomaterialer. Anvendelse av denne metoden kan også informere nanomedikamentavgivelses forskning som utnytter vevs- eller dyremodeller. Spesielt nanopartikler absorpsjon, distribusjon, metabolisme og ekskresjon gjennom organs og vev kan bli undersøkt med dette systemet. Et bredt utvalg av applikasjoner blir undersøkt for bruk i biomedisinsk forskning ^11.

Denne metoden kan benyttes for vurdering av forskjellige biologiske prøver (for eksempel ulike typer vev, bronkoalveolar lavage prøver, og blodutstryk) som har vært utsatt for nanopartikler av en rekke elementære sammensetninger ^16-19. Videre er denne metode som er nyttig for å studere nanopartikkel biodistribusjon in vivo og in vitro, som er relevant for nanomedikamentleverings studier ^11. Utover biologiske prøver, kan EDFM og HSI brukes til å vurdere nanopartikler i miljøprøver, for eksempel avløpsvann ^20. Yrkeseksponering vurdering kan forenkles ved bruk av denne teknikken også, siden det kan brukes til å evaluere effekten av personlig verneutstyr for å hindre nanopartikkel penetrasjon. Videre forskning team utvikler for tiden en lignende EDFM og HSI protokoll for evalueringen av filtermedie prøver av nanopartikler som samles inn fra yrkeseksponering vurderinger. Selv om fremstillingen av disse forskjellige typer prøve for EDFM og HSI kan variere, er det viktig at de er fremstilt på en slik måte at de lett kan visualiseres ved hjelp av det optiske systemet. Vanligvis bør prøven fremstilles som om det ville bli visualisert via tradisjonell lysfelt mikroskopi. Det er flere hyperspektral bildesystemer kommersielt tilgjengelige ^11.

Protocol

Animal protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité på forskernes samarbeide institusjon, Stony Brook University. En liste over konkrete materialer og utstyr som brukes for denne artikkelen finner du i tabell 1.

1. Prøvepreparering av vev

1. Forbered animalsk vev utsettes for metall oksid nanopartikler for histologisk eller immunhistokjemisk farging som per tidligere beskrevne metoder ^21-23.

2. Imaging

1. Initialisering mikroskop
   MERK: For denne studien, ble en forsknings grade mikroskop, utstyrt med et høyytelses mørkefelt lyskilde, motorisert XY stadium kontrolleren, 14-bits dybde hyperspektral kamera, og flere objektiv (10X luft, 40X luft, 100X oljeimmersjon) . Systemet som brukes her har en 64 nm romlig oppløsning på 100 X (olje nedsenking) forstørrelse. Den kondensator som brukes for denne study har både Koehler og kritiske belysning funksjoner og fokuserer en svært kollimert lys på skrå vinkler på prøven.
   1. Plugg inn og slå på lyskilden, XY stadium kontrolleren, optisk kamera (for mørkefelt imaging), hyperspektral kamera, og datasystem. Still lyskilden til 75% effekt; heve scenen til maksimal høyde; koble lyslederen til kondensatoren for forbedret mørkefelt avbildning eller til kollimatoren på baksiden av mikroskopet for reflekterte lysfelt avbildning.
      MERK: Ved å sette lyskilden til 75% effekt, det er tilstrekkelig, jevn belysning av alle piksler innenfor hele synsfeltet som forbedrer duller piksler samtidig gir kontrast mellom kjedelig og lyse piksler.
   2. Hev kondensator til driftsstilling. Påfør 3-5 dråper av type-A nedsenking olje på kondensatoren objektivet nøye, unngå dannelse av noen bobler. Tørk bort olje og bruke den på nytt, hvis bobler bør danne.
   3. Plasser raset on scenen. Sakte heve kondensatoren før nedsenking oljen kommer i kontakt med objektglasset. Dette vil være merkbart gjennom den raskt lysere ring av belysning, hvor oljen kommer i kontakt med objektglasset.
2. Sett 10X objektiv på plass. Fokus og justere kondensatoren ved å undersøke gjennom okularene.
   1. Flytt scenen opp og ned via grov objektiv fokus knotten til lysstyrke er maksimert.
   2. Flytt kondensatoren fokusere opp og ned via kondensatoren justeringsknotten til maksimal lysstyrke er funnet. Forsøk på å skape den lyseste sentrale stedet mulig i synsfeltet.
   3. Juster kondensatoren justeringsknottene som er nødvendig for å sentrere lyspunkt, hvis det er nødvendig.
   4. Bruk den fine mål fokus knotten slik at lyspunktet i fokus. Når du skifter mål å få en annen forstørrelse, justere fokus planet. Når utnytte 100X objektiv, bruke en dråpe nedsenkning olje over dekkglass for å forbedre the image og unngå skade på objektiv.
3. Fange opp bilder
   1. Bruk scenen kontrolleren til å finne et område av interesse. Dette område vil bli bestemt av behovet av eksperimentet. En typisk indikator vil være høy kontrast med omkringliggende områder, som områder preget av metalloksid nanopartikler synes ofte lysere enn områder uten dem.
   2. Bringe regionen i fokus ved å bruke de fine mål fokus knott, justere kondensatoren fokus som er nødvendig for å stabilisere belysning. Oppnå en høy kontrast, veldefinert region innenfor synsfeltet.
   3. Bestem hva bildene (for den optiske kamera) eller datacubes (for hyperspektral kamera) vil bli fanget, og i hvilken rekkefølge. Vanligvis er optiske bilder oppnås med en 10X luft objektiv, luft objektiv 40X og 100X oljeneddyppingsobjektivet og en tilsvarende HSI Datacube med en 100X oljeneddyppingsobjektivet.
      1. Åpne den optiske bildebehandlingsprogrammer. Klikk på "Innstillinger &# 8221; i menylinjen. Velg "Image Capture-knappen for fangst hendelse". Velge den lagrede bildeformatet (TIFF ble brukt for dette eksperiment); tildele et filnavn; bla gjennom og velge et lagret bilde mappe; holde standard timelapse; Klikk på "OK".
      2. Velg eksponeringsinnstillingene som skaper den høyeste kontrasten bildet i "Exposure" -menyen (for denne studien, et nivå på 0,0%, gevinst på 3,0 dB, og lukkeren på 35 ms ble brukt).
      3. Fange bildet ved å klikke på "Image" knappen i menylinjen. Ta flere med lav forstørrelse Darkfield-bilder i tillegg til de med høy forstørrelse ved å endre mikroskop mål, for å gi kontekst.
         MERK: Ta optiske bilder på samme forstørrelse som eventuelle datacubes som vil bli tatt med hyperspektral kamera, da disse optiske bilder har en tendens til å ha et større synsfelt og bedre estetisk utseende for senere visuell inspeksjon. Det er viktig at alle DATACUBE'er som senere vil bli spektralt analysert bruk konsistent forstørrelse, da det er mulig at endring av mål vil endre transmisjonsspektrene av mikroskop optikk, endrer den digitaliserte spektra, og dermed redusere nøyaktigheten av den spektrale vinkel avbilderen (SAM). Hvis en Datacube er sammenlignet med en annen Datacube oppnådd med et annet objektiv, kan SAM funksjon ikke fungerer.
   4. Velg hyperspektral kamera bildedetektor ved å omdirigere lyskilden knotten på mikroskopet til hyperspektral kameraet. Hvis lyset er rettet mot hyperspektral kameraet, så vil intet bilde vises på det optiske kamera programvare. Minimer men ikke lukk den optiske bildeprogramvare vindu, som man kanskje trenger det som er angitt i trinn 2.4.4.
4. Fange Datacubes
   1. Åpne hyperspektral bildebehandlingsprogrammer for erverv av HSI datacubes. Sikre lyset guiden er rettet mot hyperspektral kameraet.
   2. Open "Hyperspectral Microscope "i menylinjen og velg" HSI Mikroskop Controls ".
   3. Sett objektivforstørrelsen og lagre banen. Sørg for å nevne alle bilder og filer utpreget slik at ingen overskriving oppstår. Endre området fange inn innstillinger ved å justere synsfeltet eller flere linjer (bruke 720 linjer for denne undersøkelsen), sammen med en betydelig mengde av ekstra tid som kreves for å fange opp større områder. Endelig satt eksponeringstiden (0,25 sek for denne studien). La alt annet til standard, og klikk på "Preview HSI" for å vise bildet.
      Merk: Intensiteten graf som vises viser HSI Datacube som vil bli tatt opp i den horisontale aksen. Den vertikale aksen representerer bølgelengder av spektra som vil bli tatt i HSI Datacube. Å plassere markøren på en hvilken som helst posisjon på intensiteten kurve som svarer til en spektral bølgelengde forårsaker at intensitetene av alle punkter på tvers av bildet, ved at bølgelengden, for å bli vist.
   4. Justere intensiteten fra denne forhåndsvisningen ved å justere lysstyrken kilde, kondensator fokus, eller ved å kansellere forhåndsvisningen for å justere eksponeringstiden. Sistnevnte gir de beste resultatene, men økt eksponeringstiden kan ta lengre tid å image. Målet er at de mer betydelige topper å være tilstrekkelig stor, men ikke overstiger maksimal intensitet for detektoren; her, er den ideelle området mellom 1000 og 16.000 enheter.
   5. Klikk "fange". Mikroskopet vil be om å ta en mørk gjeldende bilde. Omdirigere den øvre glide eller blenderåpning (forsiktig, for ikke å forstyrre justeringenog fokus på noen av de andre optikk), og klikk "OK". Gjenopprette glide eller blenderåpning til riktig posisjon, og klikk "OK" igjen når ledeteksten til bildet vises. Imaging kan ta opptil 30 minutter, selv om tider med ca 5 min er mer typisk. Lengre eksponeringstider føre til lengre bildebehandlings ganger. En fremdriftsindikator er til stede. Vær forsiktig så du ikke fysisk forstyrre omfanget før fremdriftsindikatoren er fullført.
   6. Observere fire nye vinduer med navn: "Tilgjengelige band list", "# 1zoom", "# 1scroll" og "# 1 RGB band". Maksimere "# 1RGB band" vindu som dette er Datacube for alle fremtidige referanser.
   7. Høyreklikk på Datacube og lagre det som en TIFF og klikk "OK". Hvis ferdig bildebehandling; sette bort alle prøvene; rengjøre alle oljeeksponerte flater med 70% isopropanol i vann; heve scenen til maksimal høyde; lavere kondensator til minimumshøyde og trykker til ikke-operativ posisjon; lukkened eller koble fra lyskilden, scene kontrolleren, og kameraer.

3. Opprettelse av spektrale referanse Libraries

1. Valg av referanse Spectra
   1. Velge en positiv kontroll som er kjent for å inneholde det materiale av interesse i den samme matriks som de eksperimentelle prøver, siden HSI spektrale profiler er matriks-avhengig.
      1. For denne studien benytter svinehud injisert med høye doser av metalloksyd-nanopartikler som positive kontroller for sammenligning med den eksperimentelle svinehud vev fra et topisk eksponering studie. De spektrale profiler av metall-oksid nanopartikler i suspensjon, ble samlet og undersøkt og funnet å være en feilaktig positiv kontroll for histologiske eksperimentelle prøver på grunn av de forskjellige matriser.
   2. Oppnå en Datacube fra den positive kontrollen, som beskrevet i trinn 2.4., Ved hjelp av hyperspektralt kameraet.
      1. Vær spesielt forsiktig når du sette intensiteten, da dette er den primære beregningen ved hvilken det indre partikkelfilter vil identifisere materialene. Eventuelle intensiteter over metningspunktet av detektoren (her, 16.000 enheter) vil resultere i ugyldige data (se trinn 2.4.5.).
   3. Høyreklikk i bildevinduet, og venstre klikk "Z-profil spekteret". En pop-up Spectral Profil-vinduet vises. Venstre klikk på piksler av interesse på Datacube, spesielt de mest lyssterke eller de som trygt kan identifiseres som representerer materiale av interesse. Observere Spectral Profile vindu som viser forbundet spekteret. Ta oppmerksom spesielt på sitt laveste og høyeste verdi og hvilken bølgelengde tilsvarer det.
      1. Når kartlegging av positive kontrollprøven, undersøkelse ved å klikke på områder av interesse som er svært lyse i forhold til omkringliggende vev, spesielt de med lett identifiserbare partikler. Disse partiklene er mest sannsynlig å være den materials av interesse, spesielt i tilfelle av metaller.
   4. Bruk "Partikkelfilter" verktøyet under "Particle Analysis" menyen for å identifisere partikler tilstede i Datacube. I den nye pop-up vindu, observere "Spectral Max må overstige". Dette vil bli bestemt ved observasjoner i trinn 3.1.3. Sett denne verdien slik at det er høyere enn bakgrunnselementer, men lavere enn det materiale av interesse. Den "Gyldig data Max" er maksimal intensitet (her, 16.000 enheter).
      1. La andre parametere til standard, men utelukker objekter basert på størrelse ved å justere "Size Threshold" boksen. Lagre disse dataene enten på dette tidspunkt, eller etter å ha kjørt analysen. For dette eksperimentet, kan du bruke følgende parametere: Spectral Max må overstige: 5000; Gyldig data Max: 16000; Størrelse Threshold (piksler): 400. Når alle parameterne er satt, klikk "OK".
   5. Observere den resulterende grafen med detaljenepartikler oppdaget innenfor den indikerte intensitet terskel; disse dataene kan eksporteres. Hvis den karakteristiske maksimal reflektans bølgelengde av materialet av interesse er kjent, velge ut de partikler som har en lignende "Max WL" verdi; ellers, klikk på "Velg alle". Klikk deretter på "Export"; "Å Spectral Library". Velg et filnavn og klikk deretter på "OK".
2. Fjern False-positive Spectra
   1. Velg en prøve som vil fungere som en negativ kontroll. En slik prøve bør ha blitt fremstilt og behandlet på samme måte som alle eksperimentelle prøver bortsett fra at det ikke foreligger nanopartikler lignende eller identisk med materialet av interesse er garantert.
      Merk: Det er viktig at matriksen av den negative kontroll er den samme som den grunnmasse av de eksperimentelle prøver, som HSI spektrale profiler er matriks-avhengig. For denne studien brukte vi svinehud som ikke var utsatt for metalloksyd-nanomaterialer som negativkontroller.
   2. Benytte seg av datacubes fra den negative kontroll som beskrevet i trinn 2.4.7, ved hjelp av hyperspektralt kameraet. I det minste en er nødvendig, men flere kan bli tatt for å øke selektiviteten (dette er spesielt viktig i det tilfelle at noen forurensninger kan være i referanse spektra).
   3. Bruk hyperspektral bildebehandlingsprogrammer for å filtrere spektral biblioteket samlet i trinn 3.1 (positiv kontroll) mot hverandre Datacube fanget i trinn 3.2.2 (negative kontroller) serielt, som beskrevet i følgende trinn:
      MERK: Lagre resulterende, filtrert spektral biblioteket til en egen fil, og bruke som referanse spektral biblioteket for materiale av interesse.
      1. Klikk "Filter Spectral Library" under Analyse-menyen, som ligger på hovedprogrammet verktøylinjen. Klikk "Open"; "Ny fil" og velg spektral bibliotek opprettet i trinn 3.1. for den positive kontrollen som Input-filen. Klikk "OK".
      2. For external kilde, velg "Image" under Spectral Data-boksen. Hold standardinnstillingene under Behandlingsparametere boksen. Velg en Output Name For filtrert Library (dette bør være annerledes enn originalen, eller rå spektrale bibliotek samlet vil gå tapt). Klikk "OK".
      3. Klikk "Open"; "Ny fil" og velg den første Datacube fanget i trinn 3.2.2 for den negative kontrollen, da bedt om å velge et kildebilde.
         MERK: Programvaren vil analysere spektral bibliotek og fjerne hvert spektrum som matcher alle spekteret av den negative kontrollen Datacube. Fjerne bakgrunn fra utvalgskriteriene reduserer dermed muligheten for falske positiver. Et sammendrag vil være tilgjengelig når dette er gjort (merk at dette sammendraget ikke lagres automatisk).
      4. Hvis ytterligere filtrering er ønskelig, gjenta fra trinn 3.2.3.1, unntatt: trinn 3.2.3.2, velg det siste filtrert spektral bibliotek opprettet (resulterende etter trinn 3.2.3.3 co.mpletes); i trinn 3.2.3.3, velge neste Datacube fra trinn 3.2.2.
         MERK: Korrigering og normalisering for lampen spekteret kan være nødvendig dersom prøvene splitte en betydelig mengde lys (for eksempel karbon nanorør), og / eller hvis null-spektra forbli ved filtrering av en positiv kontroll spektral biblioteket mot en negativ kontroll. Disse forholdene ikke oppstår for vår studie og så denne korreksjonen ikke ble utført.

4. Bildeanalyse

1. Spectral Angle Mapping
   1. Åpne "Spectral Angle Mapper" (SAM) fra Spectral menyen, kartleggingsmetoder undermeny, ved hjelp av hyperspektral bildebehandlingsprogrammer når alle de eksperimentelle datacubes er kjøpt følgende trinn 2.4. Den spektrale vinkel avbilderen sammen spektra ved geometrisk å analysere endringer i intensitet som funksjon av bølgelengde (dvs, sammenlignes to spektra ved å normalisere deres intensitet og sammenligne vinklene reves å spore grafen til hver spektra) ^24.
   2. Med Datacube åpen, velger du navnet på den eksperimentelle Datacube i pop-up vinduet og klikk "OK". Hvis ingen filnavn er oppført, klikk på "åpne"; "Ny fil", velg den eksperimentelle Datacube, deretter "OK".
      1. Observere en ny pop-up vindu som heter Endmember Collection: SAM. Klikk på "Import" i menylinjen, og velg deretter "fra Spectral Library-fil". En pop-up vindu som heter Spectral Library Input File vises. Åpne Spectral Library of referanse som ble opprettet i trinn 3.2.3. og klikk "OK". Observere en ny pop-up vindu som heter "Input Spectral Library".
      2. Klikk "Velg alle elementer"; Klikk på "OK" høyreklikk på "Color" og velg "Bruk standardfargene til alle." Klikk "Velg alle", etterfulgt av "Apply" og deretter velge output filnavnet end Klikk på "OK". Spectral Angle Mapper vil ta noen sekunder å analysere og lagre data.
   3. Åpne Datacube i hyperspektral bildebehandlingsprogrammer. Velg "klassifisering" i Overlay menyen i bildevinduet, og deretter navigere til filnavnet og klikk "OK". Brukeren kan nå legge over noen spekteret fra biblioteket for å se hvor de kartlegge til i bildet.
   4. Velg "Slå sammen klasser" fra Option menyen i "Interaktiv klasse funksjonen" åpnet gjennom Overlay menyen i bildevinduet, hvis en enhetlig fargevalg er ønskelig, for eksempel for enklere analyse av annen programvare (som beskrevet i trinn 4.2 .).
   5. Markere alle klassifikasjoner å kombinere (typisk, alt unntatt "kategorier" i "klasser å flette inn base" listen), og velg en enkelt spekteret fra "base klassen" -listen, og klikk "OK". At fargen vil nå represent alle valgte spektra.
   6. Klikk på fargen som er valgt, og alle samsvar spektra vil bli vist i den fargen.
   7. For å få en dichromatic bilde som viser den matchende spektra over en svart bakgrunn, cIick på "Uklassifisert" farger boksen, som er svart som standard. Observere en dichromatic bilde. Dette trinnet kan reverseres ved å klikke en gang på "Uklassifisert" farger boksen.
   8. Høyreklikk for å lagre bildet som en TIFF, inkludert eventuelle overlegg aktiv.
      MERK: For fremtiden bildebehandlings, vil en dichromatic bilde brukes.
   9. Velg "Class Distribution" fra valgmenyen i "Interaktiv Class Tool" vinduet for å erverve kartlegging statistikken. Denne informasjonen representerer hvor mange piksler var ikke kartlagt (kategorier), og hvor mange som ble identifisert som materiale av interesse. Legg merke til at antall piksler ikke korresponderer med antall partikler kartlagt. Denne informasjonen er ikke automatisk recorded.
2. Partikkelanalyse i Hyperspektral kartlagt bilder
   1. Åpne bildene i NIH ImageJ programvare.
   2. Bruk bildemenyen Juster undermeny "Threshold" -funksjon. Velg parametere som skiller partikler av interesse fra alle andre materialer. Bruk følgende terskel parametere for denne studien: default terskel metode, farge rød, fargerom HSB, sjekket mørk bakgrunn boksen, sjekket pass boksene for fargetone, metning og lysstyrke.
      MERK: Dette kan variere betydelig fra sak til sak. Når du analyserer en tilordnet Datacube, kan dette forenkles ved å forene alle relevante klasser til én farge og overliggende den fargen med alle uklassifiserte farger før du genererer bildet (trinn 4.1.4 til 4.1.8).
   3. Bruk Analyser menyen, "Analyze partikler" -funksjonen, som vil hente informasjon for området, mener, minimums- og maksimumsverdier. For denne studien, bruker parametrene her: størrelse 0-uendelig, circularity0-1, viser ingenting, sjekket vise resultater sjekkheftet.
   4. For statistisk analyse, eksportere disse dataene til et annet program som gjør det mulig statistisk sammenligning med antallet og størrelsen av partiklene som ligger i tilsvarende kontrollprøver. Vi foreslår at du bruker et regneark for analyse av ImageJ data. Dataene som vises i resultattabellen etter trinn 4.2.4 skal kopieres til et regneark. MAX-funksjonen kan brukes på den første (uten navn) kolonne for å bestemme antall partikler, mens den gjennomsnittlige funksjonen kan brukes på området kolonnen for å bestemme midlere størrelse på en partikkel. I fremtiden vil eksperimentell validering bli forfulgt for å undersøke denne funksjonen for å bestemme gjennomsnittlig størrelse mot en etablert standard for dimensjonering (f.eks TEM).

Representative Results

Hyperspektralt mikroskopi er nyttig for dens evne til å identifisere materialene på en måte som ligner på spektrofotometri. Som indikert i figur 1, har hvert material flere karakteristiske spektra og en generell form av dets reflektans, som er unik. Videre Figur 1 illustrerer matrise avhengige natur av de spektrale profiler: spektral-profiler for hver av de tre metall-oksidene i histologiske vevsprøver (øvre panel) er forskjellige fra de spektrale profiler for hver av de tre metall-oksider i vandig suspensjon ( nedre panelet). Ved å kartlegge de karakteristiske spektrale profilen til ukjente prøver i samme matrise, er teknikken nyttig for å bestemme nærvær eller fravær av et materiale, og kan også semi-kvantitativt sammenligne relative mengder av materiale i prøver.

Referanse spektrale bibliotekene opprettet fra positive kontroll hudprøver som er aktuelle for kartlegging til eksperimentellhudprøver. Som vist i figur 2, er de spektrale referansebibliotek kartlegge godt til de tilsvarende positive kontroller og ikke tilordnes til de tilsvarende negative kontroller.

Den mest betydningsfulle fordel med metoden er dens evne til å påvise lave nivåer av materialer av interesse i prøver, så vel som for å skille dem fra forurensninger. . For eksempel kan enkelte nanorør observeres i lungene ved inhalering av doser så lave som 40 mikrogram i et 20-30 g rotte ²⁵ Figur 3 viser dette i histologiske hudprøver: mens noen partikler er lett åpenbar i mørkefelt optisk bilde (kolonne 2), andre er oppdaget ved hjelp av hyperspektral avbildning (kolonne 3) som kan ha vært savnet ved hjelp av lysfelt mikroskopi (kolonne 1) eller andre metoder. Bruken av mørkefelt HSI tjener også til å øke spesifisitet enn enkel lysfelt-mikroskopi. Disse bildene kan da bli gjenstand for flere kvantitative former for analyse, notably partikkelanalyse via ImageJ.

Forbedret mørkefeltmikroskopi har mange forskjellige anvendelser, selv i fravær av hyperspektral avbildning. Den første er dens evne til å generere høy kvalitet, bilder med høy kontrast. Dette er best vist i figur 3, i hvilket partikler av interesse er lett identifiserbare i forhold til sine motstykker lysfelt. Disse bildene kan også være gjenstand for kvantitativ partikkelanalyse, selv i fravær av hyperspektral kartlegging, er forsiktighet nødvendig for å unngå forvirrende en forurensning partikkel fra en partikkel av interesse.

Figur 1. Referanse spektrale biblioteker (vev matrix) sammenlignet med spektrale bibliotek (nanopartikler i suspensjon). Denne figuren viser betydningen av å generere et referanse spektral-bibliotek fra nanomaterials av interesse i samme matrise som eksperimentelle prøver. Den første raden viser referansen spektral bibliotek (RSL) for hvert materiale i denne studien (alumina, silika og ceriumoxyd). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dette RSL ble opprettet ved fremgangsmåten beskrevet i denne protokollen, hvor positive kontroll vevsprøver ble filtrert mot negative kontroll vevsprøver. Den andre raden viser spektrale biblioteker (SL) opprettet fra nanopartikler av interesse i flytende suspensjon på et objektglass. For aluminiumoksyd, ble en bimodal topp ved bølgelengder på 500 og 650 som finnes i RSL, mens en mer buet og mindre karakteristiske topp ble observert i suspensjonen SL NP alumina på rundt 600. For silika, en topp ved en bølgelengde på omkring 650 var tilstede i RSL, mens en mer buet og mindre karakteristiske topp ble observert i silika NP suspensjonen ved SL rund 600. For ceriumoksyd, ble en bimodal topp funnet ved bølgelengder på 520 og 620 i den RSL, mens en mindre karakteristisk topp ble observert i ceria NP suspensjon SL på rundt 560. Dette tyder på at matriksen hvori de er innstøpt NPS skaper et skifte i spektra som kan være betydelig når du velger kontrollene for å skape SL for så konkret eksperiment.

Figur 2. Referanse spektrale biblioteker (vev matrix) kartlagt på positiv kontroll og negativ kontroll svin hud vev. Figuren tjener som bekreftelse på RSLs som er aktuelle for tilordning til eksperimentelle prøver, ved at hver RSL (venstre kolonne) tilordner vel til sin tilsvarende positiv kontroll (midtre kolonnen), og ikke tilordnes til dens tilsvarende negativ kontroll (høyre kolonne). Vennligst Klikk på here for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Hyperspektral kartlegging av eksperimentell svin hud vev utsettes for metalloksid nanopartikler. Rader fra topp til bunn tilsvarer forskjellige lag av huden, fra overfladisk til dypeste lag: epidermis, dermis og subkutant vev, henholdsvis. Den første raden viser stratum corneum av epidermis fra en hud prøve som ble utsatt for alumina NPS i suspensjon; den andre raden ble eksponert og silisiumdioksyd NPS i suspensjon; og den tredje rad for å ceriumoksid NPs i suspensjon. Hver kolonne viser det samme område av huden avbildes med forskjellige teknikker. Den første kolonnen tilsvarer lysfelt mikroskopi (40X mag .; skala bar = 50 mikrometer), der området omsluttet av en rød firkant ble forstørret (100X mag; skala bar = 10 mikrometer) med forbedret mørkefelt mikroskopi (EDFM) i den andre kolonnen, hvor hvite pilene peker til den høye kontrasten NPs. Den tredje kolonnen ble oppnådd med en hyperspektralt kamera (HSI), som viser de samme NPS høy kontrast (hvite piler). EDFM og HSI bildene ble tatt ved 100X forstørrelse; skala bar = 10 mikrometer. Den fjerde kolonnen viser HSI image kartlagt mot respektive RSL for hver eksponering gruppe, hvor alumina NPs vises i grønt, silika NPs i rødt, og ceria NPs i gult, hhv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

For vevsprøver som har gjennomgått vanlig histologisk farging, identifisering og analyse av metall oksid nanopartikler kan oppnås gjennom en kombinasjon av EDFM, HSI kartlegging og bildeanalyse teknikker. Mens det er fleksibilitet i prøvepreparering for histologi eller immunhistokjemi (for eksempel ved hjelp av faste eller frosne vev, typen flekker), er det viktig at prøvene er seksjonert med en tykkelse på 5-10 um for optimal visualisering. Prøvene som er brukt her var formalinfiksert og parafin-embedded før seksjonering med en rotasjonsmikrotom til 6 mikrometer tykkelse, montert på glass objektglass, farget med hematoxylin og eosin og coverslipped. Svinehud vev fra en ex vivo kutan penetrering toksikologi samarbeid ble anvendt for denne studien. Vevene ble utsatt for metalloksid nanopartikler (alumina, silika, ceria) i vandige suspensjoner. Påvisning av regionen (e) av interesse (høy kontrast elemeNTS) med EDFM er et viktig første skritt som forenkler påfølgende HSI kartlegging og analyse. Positive og negative kontrollprøver skal avbildes og analyseres først for å skape en spektral bibliotek for referanse. Det oppsamlede spektra fra den positive kontrollen blir eksportert til en positiv kontroll spektral bibliotek. Da blir alle spektrene fra de negative kontroll bilder subtraheres fra den positive kontroll spektrale bibliotek for å øke spesifisitet (redusere falske positiver). Det resulterende filtrerte spektrale bibliotek anses RSL som tjener for analyse av materialer av interesse. Alle vevsprøver gjennomgå den samme bildeprosessen og er kartlagt mot RSL. Den resulterende bildet vil bare inneholde områder med elementer av interesse enn en svart bakgrunn. Dette bilde kan så analyseres med ImageJ ved hjelp av sine terskel og partikkelanalysefunksjoner for å oppnå det området av kartlagte partikler pr synsfelt. Numeriske data innhentet fra ImageJ kan være eksported til et regneark for videre analyse.

Det er viktig å tenke på at så biologiske prøver er iboende forskjellige fra hverandre, og fargemetoder kan påvirke visualisering gjennom EDFM og HSI, bør eksponeringsinnstillingene fastsettes i samsvar med hva gir best bilder med høy kontrast for en bestemt type prøve. Selv om reduksjon av falske positiver kan oppnås ved filtrering av spektrale biblioteker, er det avgjørende å oppnå pålitelige negative kontroller som har unngått forurensning med elementet av interesse, som spektrene tilsvarer denne forurensning kan potensielt bli filtrert fra den positive kontroll spektrale bibliotek øker falske negative priser. Dessuten kan spektrum intensiteten som er detekterbart med hyperspektral avbildning programvaren ikke overskrider grensen for den aktuelle programvare (for denne studien, er det 16000 enheter): områder med et høyt antall akkumulerte partikler som frembringer spectral intensiteter over intensitetsgrense er utelatt av den spektrale biblioteket, på grunn av risikoen for å øke antallet av falske negativer.

Mens HSI-systemet overfører mange fordeler fremfor tradisjonelle metoder, er det noen ulemper og begrensninger for å vurdere. Den ene er at den store mengden av optiske data som samles kan kreve betydelig beregningskraft. En annen er at HSI kan være tidkrevende, spesielt i begynnelsen stadier når referanse spektrale bibliotekene blir opprettet. Dessuten kan bildebehandling tid kreve flere minutter per bilde fangst, noe som gjør det tregere enn enkel mørkefelt bildebehandling; Det er imidlertid fortsatt raskere enn å utføre sampling forberedelse og visualisering ved elektronmikroskopi. I tillegg kan komplekse systemer resultere i flere karakteristiske spektra som krever utvikling av høyt spesialiserte kontrollerer og muliggjør etablering av standardiserte, universalreferansebibliotek vanskelige ^26. Endelig technique gir lavere oppløsning enn sonde eller elektronmikroskopi teknikker, for eksempel atomkraftmikroskopi eller transmisjonselektronmikroskopi, som kan løse enkeltatomer. Denne teknikken oppløsning er begrenset på grunn av den fotoniske natur, som hindrer den fra å være en høy presisjon verktøy for måling av partikkelstørrelser på nanonivå eller for nøyaktig plassering av materialet på en sub-mikron-nivå. Mens teknikken kan være i stand til å fastslå partikler innenfor visse vevsområder eller cellulære organ større enn 1 mikrometer (for eksempel celle kjerner), er mindre organeller eller funksjoner utfordrende å visualisere nøyaktig med denne metoden. Også verdt å merke, gitt sin romlig oppløsning, kan denne metoden ikke skille mellom enkeltnanopartikler og agglomerater ^11.

Andre hensyn er: visse materialer (for eksempel edelmetaller) har mye høyere refleksjon og distinkte spektrale profiler, noe som kan gjøre dem lettere å ANALYze og spektralt kart med dette verktøyet. Andre, slik som de semi-metalliske oksyder som er undersøkt i dette studiet og karbon-nanomaterialer ^{24, 27,} kan være mer utfordrende på grunn av deres grunnlegg sammensetning, form, og avhengig av matrisen. I to murine innånding studier av Mercer et al., Ble et tilsvarende system for den ene som anvendes i denne studien anvendes for å lokalisere karbon nanorør i lungene og i sekundære organer, basert på deres bemerkelsesverdig høy kontrast med omgivende vev. Men hyperspektral kartlegging ble ikke påvist i noen av studiene, sannsynligvis fordi den unike formen på karbonfibre var en tilstrekkelig egenskap for identifisering. En annen vurdering gjelder spesielt for vev: siden deponering nanopartikler av interesse for bestemte organer gjennom normale biofysiske prosesser er uforutsigbar (og ofte seg selv gjenstand for studier), kan bestemmelse av en gjeldende positiv kontroll være vanskelig og krever vurdering av hvordan generasjonen av kontroll might påvirke staten av et materiale av interesse. For eksempel, hvis det opprettes en spektral-bibliotek fra uberørte nanopartikler av interesse, kan det være vanskelig å kartlegge biblioteket til de samme nanopartikler i vev eller celler som skyldes endringer i spektrene som følge av forandring av den partikkel (for eksempel på grunn av endringer i pH, oppløsning, agglomerering, proteinbinding), og den totale mikromiljøet eller matrise. Til slutt blir den teknikk begrenset i sin semi-kvantitativ: det kan bare være så kvantitativt som andre to-dimensjonale mikroskopi teknikker av tilsvarende oppløsning, noe som betyr at det ikke lett kan anvendes for å utføre oppgaver som å karakterisere total organ byrden av et materiale.

Totalt sett, EDFM og HSI gir flere fordeler i forhold til konvensjonelle avbildningsnanomaterial og karakteriseringsteknikker, slik som TEM, HAADF og DIC. EDFM / HSI åpner for raskere bildeopptak og analyse, noe som sparer tid og kostnader i forhold til mer intensiv konvensjonelle teknikker. Dessuten er prøvepreparering for EDFM / HSI typisk både minimalt og ikke-destruktiv, noe som sparer tid og også gir mulighet for mer fleksibel analyse av en gitt prøve, siden det kan da brukes for andre teknikker. Videre er HSI allsidig, slik at for analyse av nanoskala materialer av mange sammensetninger og i en rekke matriser. Forskerteamet arbeider for å avgrense metoden beskrevet her for andre materialer og prøvetyper, inkludert en grundig vurdering av spesifisitet av teknologien. Et kritisk neste trinnet under etterforskning av forskerteamet er validering av disse teknikkene mot tradisjonelle gullstandarder (f.eks Raman, TEM, SEM) for materialene og vevstyper av interesse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CytoViva 150 Unit (condenser)	CytoViva (Auburn, AL)		mounted to Olympus BX43 microscope
Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100X oil immersion objective	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		for use with CytoViva 150 Unit condenser
Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		enhanced darkfield camera and software
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		hyperspectral camera and software
cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides)	Schott NEXTERION	1025087	reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging
cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22 mm x 22 mm x  1.45 mm)	Schott NEXTERION	custom	reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging
type A microscopy immersion oil	Fisher Scientific	12368B	multiple suppliers
70% isopropanol in water			multiple suppliers
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH)		free open-source software online download
metal oxide nanoparticles	supplied to the research team by industrial partners		alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.