Summary

Gen İfade Etkileyen Sinyal İletimi Pathways tanımak Tavuk Embriyo uzuvlar Geliştirme içine Boncuk eklenme

Published: January 17, 2016
doi:

Summary

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Abstract

Tavuk embriyo kullanarak doğrudan büyüme faktörleri ya da gen ekspresyonu ve sinyal transdüksiyon yollarının aktivasyonu ile ilgili sinyal yollarının spesifik inhibitörleri ya da etkilerini test etmek mümkündür. Bu teknik, belirli zamanlarda için kesin olarak tanımlanmış gelişim aşamalarında sinyal molekülleri teslim izin verir. Bu embriyolar, hasat edilmiştir ve gen ekspresyonu in situ melezleme ya da immün ile gözlemlenen sinyal transdüksiyon yollarının aktivasyonu, örneğin, incelenebilir sonra.

U0126, bir MEK inhibitörü batırılmış bu FGF18 batırılmış bir video heparin boncuk veya AG 1-X2 boncuk, ovo ekstremite tomurcuk içine aşılı edilir. Bu FGF18 U0126 tarafından inhibe edilir MyoD ve ERK fosforilasyonu ve endojen ve FGF18 kaynaklı hem MyoD ekspresyonunu uyardığını göstermektedir. Bir retinoik asit antagonisti batırılmış Boncuk FGF18 tarafından prematüre MyoD indüksiyon potansiyalize edebilir.

Bu yaklaşım bize olabilirFarklı büyüme faktörleri ve inhibitörleri ve geniş bir yelpazesi ile ed de gelişmekte olan embriyonun diğer dokularda uyarlanmıştır.

Introduction

Kuş embriyolar yıllardır 1 gelişim çalışma için güçlü bir araç sağladı. Bunların en yararlı özelliklerinden biri bunların manipüle edilmeleri nispeten kolay olmasıdır. Dış gelişimi, hücre kaderine 2,3 çalışmak için klasik bir bıldırcın piliç kimera sistemi olarak örnekler dahil olmak üzere çeşitli micromanipulations embriyo ulaşmak için yumurta açıp gerçekleştirmek mümkün kılar, geliştirme 4,5 sırasında belirli dokularda aşırı ekspresyona yönelik retrovirüslerin enjeksiyonu ve eksplant kültürü gelişimsel sinyal kaynaklarını 6 tanımlamak için. Daha yakın zamanlarda GFP ifade transgenik tavuk hattından greft ile etiketsiz bilgisayarlar arasında oluşturulan kimeralardır klasik aşılama ve genetik modifikasyon kombinasyonu gelişimi 7,8 dair önemli bilgiler sağlayabilir göstermiştir.

Kuş embriyo manipüle edilebilir kolaylığı uzuv incelemek için o mükemmel bir model yapmıştırgelişimi 9. In vivo gelişmekte bacaklarda özgü büyüme faktörlerinin uygulanması bacak desenlendirme 10,11 değiştirebilir ve bu sürecin 12 içgörü sağlamaya devam faktörlerin belirlenmesinde etkili olmuştur. Bu yaklaşım aynı zamanda, kas gelişimini düzenleyen faktörleri incelemek için kullanılır olmuştur ve böyle Wnts 13, BMP 14 ve HGF 15 gibi sayısız sinyaller için roller ortaya çıkardı.

Son zamanlarda bu teknik, bacak tomurcuk miyojenik gen ekspresyonunu kontrol sinyalleri araştırmak için kullanılmıştır ve FGF18 ve retinoik asit arasındaki etkileşimler MyoD ekspresyonu 16 zamanlamasını kontrol göstermiştir. Boncuklar üzerine yüklendi ve daha sonra belirlenen gelişim aşamalarında spesifik dokular doğrudan aşılanabilir büyüme faktörleri ve küçük moleküllerin bir kombinasyon kullanılarak gelişimi esnasında hemen hemen her zaman ve bölge müdahale imkanı verir. Bu inve için kullanılmıştırhücre gruplarının desenlendirme 17,18, nöral şartnamede 19, nöral krest göç 20 ve eksen uzantısı 21 dahil olmak üzere birçok süreçleri stigate.

Burada tavuk bacaklarda gelişmekte olan ya da büyüme faktörleri ya da inhibitörlerin batırılmış boncuklar aşılama için bir yöntem tarif eder. Bu in situ hibridizasyon ile, kas spesifik gen ekspresyonunu analiz ederek Miyogenesis bu sinyallerin etkisini belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Bu tür retinoik asit veya belirli bir sinyal yollarının küçük molekül inhibitörleri olarak küçük hidrofobik moleküller için büyüme faktörleri ya da AG 1-X2 boncuklar için kullanılan heparin batırılmış boncuklar, kullanılarak greft tarif eder. Bununla birlikte, diğer boncuklar da FGF'ler 22 ve 23, her iki Shh teslim etmek için kullanılmıştır temin edilebilmektedir.

Protocol

Etik Beyanı: Bütün bu deneyler hayvan bakımı ve Nottingham Üniversitesi etik kurallara uyun. Tırnak için Heparin Boncuk 1. Hazırlık Kullanmadan önce PBS içinde iyice heparin boncuk yıkayın. Not: boncuk PBS içinde bir çamur olarak 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. PBS, 1 ml damla bir 20 ul pipet ile stoktan bunları kaldırarak aşılama için boncuk seçin. Daha sonra 3 santimetrelik bir petri tabağına PBS 20 ul damla içine boncuk akt…

Representative Results

HH aşamada 21 MyoD boyama gelişmekte Somitlerin (Şekil 1A) miyotom gözüyle görülebilir, ancak bacak miyoblastlar geliştirilmesinde ifade değildir. Şekil 1B, bir FGF18 kordon greft, aşağıdaki MyoD 6 saat boyunca in situ hibridizasyon gösterir. Karşı bacak bir ifade yoktur ise MyoD boncuk yakın miyoblastların indüklenir. U0126 batırılmış bir boncuk, MEK, MyoD (Şekil 1C) bloklar FGF18 indüksiyon spesifik bir inhibitörü olan Co-aşılama….

Discussion

Ovo dokuların geliştirilmesi için doğrudan uygulanabilir boncuk greft kullanımı, uygulandıkları hangi gelişim aşamasında ve pozlama süresi boyunca eşsiz kontrol vererek gelişim sırasında büyüme faktörü sinyalizasyon rolünü incelemek için güçlü bir araçtır.

Molekülünün her türü için boncuk seçimi önemlidir. Her ampirik bu boncuklar üzerinde inhibitör etkinliğini test etmek için gerekli olmasına rağmen, burada anlatılan önleyicileri ve retinoik asit …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.

Materials

Heparin acrylic beads Sigma H5263 The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,
AG 1-X2 beads Bio-Rad 140-1231
Affi Gel blue beads Bio-Rad 153-7301; 153-7302 These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads
FGF18 Peprotech 100-28 Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.
U0126 Cell Signalling 9903 Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
BMS-493 Tocris Biosciences 3509 Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
Black Indian ink Windsor and Newton 5012572003384 (30ml) While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos
Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95% Alfa Aesar 10404
Penicillin / streptomycin Sigma P0781 Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS

References

  1. Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).
  2. Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).
  3. Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
  4. Bell, E., Brickell, P. Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo. Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).
  5. Abu-Elmagd, M., et al. Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis. Developmental Biology. 337, 211-219 (2010).
  6. Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite. Development. 121, 651-660 (1995).
  7. McGrew, M. J., et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).
  8. Valasek, P., et al. Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle. Developmental Biology. 357, 108-116 (2011).
  9. Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).
  10. Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
  11. Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
  12. Rosello-Diez, A., Torres, M. Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells. Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).
  13. Anakwe, K., et al. Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing. Development. 130, 3503-3514 (2003).
  14. Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. The importance of timing differentiation during limb muscle development. Current Biology. 8, 642-652 (1998).
  15. Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo. Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).
  16. Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts. Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).
  17. Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5. Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).
  18. Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals. Development. 127, 4105-4113 (2000).
  19. Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
  20. Martinez-Morales, P. L., et al. FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk. Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).
  21. Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension. Development. 134, 2125-2135 (2007).
  22. Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity. Development. 125, 2825-2835 (1998).
  23. Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes. Development. 125, 777-790 (1998).
  24. Sweetman, D., et al. FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos. Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).
  25. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).
  26. Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals. BMC Developmental Biology. 8, 63 (2008).
  27. Scott, B. B., Lois, C. Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).
  28. Seidl, A. H., et al. Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).

Play Video

Cite This Article
Mohammed, R. H., Sweetman, D. Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression. J. Vis. Exp. (107), e53342, doi:10.3791/53342 (2016).

View Video