Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.
Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.
Ensaios baseados em células sensíveis de Mecano-permitir que células aderentes para investigar, com uma ampla gama de aplicações, que reflectem o papel central que a mecânica pode desempenhar na biologia celular. Estas aplicações costumam se concentrar sobre os mecanismos subjacentes que impulsionam processos subcelulares ou comportamento de células inteiras. Por um lado, os factores ambientais externos tais como a composição da matriz extracelular ou a rigidez da matriz pode afectar dramaticamente a resposta mecânica e biológica de uma célula. 1 O mesmo pode ser observada após a utilização de diversas classes de compostos farmaceuticamente activos, os efeitos dos quais são muitas vezes caracterizados utilizando modelos de cultura de células. 2 sobre as outras propriedades genotípicas de mão, tais como aquelas causadas por mutações genéticas espontâneas ou induzidas experimentalmente, pode induzir alterações acentuadas no fenótipo da célula que estão associadas a alterações na estrutura e na função do citoesqueleto. 3 Estes exemplos têm apenas algumas das muitas possíveistópicos para os quais fenotipagem mecânica de células é relevante, e todos eles foram útil investigado com matrizes micropost.
No momento da redação deste artigo, aproximadamente 200 artigos foram publicados descrevendo a interação célula-micropost. Estas obras discutir aspectos teóricos da micropost princípios de deflexão bem como instruções práticas sobre o seu fabrico. O primeiro artigo descrevendo a interação das células e matrizes micropost flexíveis foi publicada por Tan e seus colegas em 2003. 4 Em contraste com a microscopia de força de tração clássica (TFM), onde os substratos macios contínuas são usadas para estimar a contratilidade de células nanonewton escala, Tan et al. descrito um método utilizando múltiplos feixes verticais espaçados feitas de elastómero de silicone. As principais vantagens desta técnica emergem duas características principais. Em primeiro lugar, a fim de alterar a rigidez célula-substrato resulta uma só precisa de mudar as dimensões, mantendo micropostcaso contrário, a composição do substrato constante e evitando-se assim diferenças de topologia de superfície e química. Segundo microposts atuar como molas individuais que podem ser analisados de forma discreta com força e resolução espacial da ordem de adesões focais individuais e pode reduzir os desafios analíticos que são inerentes à análise análoga por padrão TFM.
Hoje, a gama de aplicações para matrizes micropost excede em muito apenas o mapeamento de forças por algumas células individuais. Por exemplo, Akiyama relata o uso de um tecido isolado a partir de um vaso dorsal lagarta da traça como um actuador para uma matriz micropost, a fim de desenvolver uma potência muscular autónoma micro-robô inseto. 5
No entanto, a maioria das aplicações publicadas de microposts concentraram-se em estudos de condições médicas, como infecção ou câncer. Por exemplo, matrizes micropost têm sido utilizados para estudar a geração de forças de empacotado pili de tipo IV de Neisseria gonorrhcolónias OEA que está associado com cascatas de sinalização reforço infecção. 6 Outros usaram microposts para estudar as células de câncer de mama tratados com compostos farmacêuticos visando o citoesqueleto. 7
Deflexão de um micropost é muitas vezes descrita usando a teoria clássica do feixe para um cantilever com uma carga final assumindo que a célula atribui apenas à ponta da micropost. Aqui, a força F aplicada que provoca uma deflexão δ depende do micropost "rigidez de flexão" e K é calculado por:
(1)
com E, I, e L sendo o módulo de Young, a área de momento de inércia e do feixe de comprimento, respectivamente. No entanto, os resultados de esta equação só dar uma aproximação geral das forças no trabalho desde feixe de corte e dobra, bem como a deformação de substrato não são levados em accontagem. Considerando que microposts são normalmente feitos de material macio, como polidimetilsiloxano (PDMS) à base de borracha de silicone esses fatores precisam ser incluídos. . Schoen et ai demonstraram a existência de um tal factor de correcção com base na relação do micropost (L / D) e do polímero correspondente coeficiente de Poisson v aspecto 8 É dada a.:
(2)
Com o t inclinação (v) ser um coeficiente de inclinação que inclui um parâmetro de ajuste = 1,3 como pode ser encontrado no mesmo artigo:
(3)
Isso significa que a rigidez corrigido de um micropost corr k é o produto da rigidez à flexão pura = k k curvatura e o factor de correcção corrdado por:
(4)
Portanto, os cálculos de força da célula deve ser realizada utilizando a variação mais refinada da equação (1) lendo agora:
(5)
O impacto da correcção torna-se mais evidente, logo que os valores típicos para dimensões micropost são utilizados. Por exemplo, a 15 mícron de comprimento micropost com uma secção transversal circular e um diâmetro de 5 mm feito de borracha de silicone à base de PDMS leva a um factor de correcção de 0,77 e, por conseguinte, um cálculo não corrigido superestimariam as forças exercidas pelas células 23%. Isso se torna ainda mais grave para microposts com proporções menores.
Tradicionalmente, micropost análise de imagem também tem sido baseada na teoria de flexão feixe idealizada. Em 2005, o grupo que foi pioneira no uso de micrmatrizes OPOST publicou um software de análise de imagem adequada para a análise micropost 9 O software exige uma licença de software eo usuário deve tomar três imagens para cada posição.; cada um dos planos superiores e inferiores do micropost em modo de transmissão e outro em modo de fluorescência com a célula corada. Depois de comparar as posições superior e inferior para cada micropost o software determina um campo de força do vetor e calcula os parâmetros relacionados como força por post. Existem outros pacotes de software e os seus princípios de análise são brevemente mencionadas nos artigos correspondentes que os descrevem, mas estes pacotes de software de análise geralmente não estão disponíveis publicamente. 10,11
As matrizes micropost concebidos para forças de células de mapeamento pode ser classificada como sendo uma disposição em micropost ortogonal ou um sextavado, o último dos quais têm a vantagem de todas as aberturas equidistantes entre microposts vizinho. Microposts típicos have uma secção transversal circular e as suas dimensões variam de 1,0 um a 10 um de diâmetro e 2 a 50 um de comprimento. 4 Contudo, microposts com secção transversal elíptica ou quadrado também têm sido relatados. 12,13
O uso de misturas à base de silicone PDMS como material de micropost permite a adição de nanopartículas na mistura. Por exemplo a adição de cobalto nano-hastes permite uma ativação magnética do micropost e, assim, dá um outro grau de liberdade para potenciais projetos experimentais. 14 A maioria dos grupos produzir suas matrizes micropost em substratos rígidos planas como tampa de vidro ou dentro de uma placa de Petri. No entanto, Mann e colaboradores relataram recentemente uma matriz micropost formada sobre uma membrana elástica. 15 Esta permite a aplicação de células alongamento forças para células aderentes ao estudar ao vivo de células subcelular respostas dinâmicas em termos de contratilidade celular.
O estab e mais amplamente empregadocido processo para fazer matrizes micropost é baseado em litografia macia, tal como descrito nos protocolos de perspicaz Sniadecki e colegas. 16-18 em processos de salas brancas curtas normalizados são utilizados para gerar as microstruturas no topo de uma pastilha de silício utilizando fotorresistente SU8. Isto é seguido por um processo de cópia, em que a borracha de silicone é lançada sobre as estruturas transferindo-se em moldes. Num segundo passo, estes moldes são utilizados para replicar a microestrutura inicial utilizando borracha de silicone sobre um substrato escolhido. No entanto, apesar da grande e crescente número de publicações relacionadas com a sua aplicação, estabelecendo um processo de fabricação para microposts leva tempo considerável, mesmo para especialistas micro-engenharia; há muitas etapas do processo que exigem otimização e adaptação ao ambiente de laboratório específico e layout micropost para se obter um nível de qualidade aceitável.
Micropost matrizes comerciais estão agora disponíveis em um pronto-to-uso ("off-the-shelf") formato com uma qualidade consistentemente alta. Como tal, são uma alternativa ao processo de fabrico complexo e moroso necessário para a produção no local. Neste trabalho uma matriz micropost comercialmente disponível foi utilizado para o mapeamento forças celulares usando uma imagem de microscopia de campo brilhante único. Mais importante este artigo descreve e documenta um software open-source totalmente funcional chamado MechProfiler, que está disponível para download como material suplementar a este manuscrito. Uma versão mantida activamente do software podem também ser encontradas em http://www.orthobiomech.ethz.ch.
A combinação de um ensaio de "off-the-shelf" e um software de análise de código aberto compatível reduz significativamente a barreira de entrada para alcançar experimentos precisos TFM. Os pesquisadores não têm acesso a qualquer instalações de sala limpa ou experiência em desenvolvimento de software pode analisar forças celulares com sucesso. Ele permite que um usuário para se concentrar nas mechanosensitivity saída ensaio ao invés de a tecnologia em si, e faz medições de força de tração disponíveis a uma comunidade mais ampla. Além disso, este é um passo importante para preparar o caminho para triagem automática de matrizes micropost.
O software de análise de MechProfiler processa imagens no formato de arquivo TIFF, PNG, BMP e JPG. As imagens podem ser tomadas através de fluorescência, contraste de fase, luz ou microscopia de campo brilhante. O programa autônomo é executado em conjunto com o livre Matlab Compiler Runtime (disponível em: Figura 12) e algoritmos subjacentes permitir o processamento de imagem simplificada, que permite ao usuário processar imagens com células únicas ou múltiplas em cerca de 1 min. Além disso, estas células podem ou ser vivo ou "Fixo".
O software MechProfiler é capaz de aumentar significativamente a análise dos dados de transferência por depender de reprodutibilidade das matrizes qualidade micropost comercial, mais especificamente, o padrão & #8220; não desvia "posição de cada post na matriz pode ser presumido contra uma grade ideal (desvios de fabrico para a grade nas matrizes utilizadas para este estudo foram inferiores a 100 nm).
Num curto abre uma selecção de ficheiros de imagem para análise, as culturas-los para a região de interesse, define as mensagens abrangidos pelas células ou que necessita de ser descartado, determina as posições de pós, calcula as deflexões / forças contra a grade ideal, e finalmente salva todos os dados específicos de celulares com a possibilidade de exportação, incluindo a uma planilha de escritório padrão.
Este trabalho visa avançar no campo da microscopia de força de tração, diminuindo substancialmente os obstáculos técnicos e práticos à entrada. Estas barreiras vêm de dois lados. Primeiro e mais importante são os inúmeros desafios técnicos não triviais que devem ser superados para a fabricação reprodutível e comissionar uma matriz micropost experimentalmente. Em segundo lugar, é a necessidade de forma semelhante não trivial para uma análise semi-automatizado de confiança de forças de células única…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.
T25 cell culture flasks | Nunc | 156367 | |
1x PBS-buffer | Sigma | D8537 | |
0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
Medium DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
FBS South America | Life Technologies | 10270106 | |
Penicillin-Streptomycin 100x | Sigma | P4333 | |
15 ml centrifuge vials | Sarstedt | 62.554.502 | |
Micropost array | MicroDuits | MPA-col1/FN | Micropost dimensions: |
pre-coated with Collagen I/Fibronectin | Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm | ||
Ethanol abs p.A. | Merck | 100.983 | |
12-well plate | Nunc | 150628 | |
Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma | HT5011 | |
Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie blue |
Methanol ACS p.A. | Merck | 1.06009 | |
Acetic acid | Sigma | 695092 | |
Glass bottom dish | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | 35 mm diameter, aperture 22 mm |
T-100 Eclipse | Nikon | n/a | Inverted microscope |
D3-L3 | Nikon | n/a | Camera controler |
DS Fi2 | Nikon | Camera |