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Biology

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung Mitochondriale Lokalisation und Funktion eines Kernzellzyklus-Kinase, Cdk1

doi: 10.3791/53417 Published: February 25, 2016

Introduction

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Bei Säugetieren ist die Zellzyklusprogression in Abhängigkeit von hoch geordneten Ereignisse gesteuert von Cyclinen und Cyclin-abhängigen Kinasen (Cdks) 1. Durch seine zytoplasmatische, nukleare und zentrosomalen Lokalisierung, ist CyclinB1 / Cdk1 2 verschiedene Ereignisse in der Mitose wie Kernhülle Zusammenbruch und Zentrosom Trennung zu synchronisieren können. CyclinB1 / Cdk1 schützt mitotischen Zellen vor Apoptose 3 und fördert mitochondrialen Spaltung, ein entscheidender Schritt für eine gleichmäßige Verteilung der Mitochondrien an die neu 4 gebildeten Tochterzellen.

In proliferierenden Säugetierzellen wird die mitochondriale ATP durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Maschinen (Elektronentransportkette) erzeugt, die von 5 Multi-Untereinheiten-Komplexen zusammengesetzt ist; Komplex I - Komplex V (CI-CV). Nicotinamidadenindinucleotid (NADH): Ubichinon Oxidoreduktase oder Komplex I (CI) ist die größte und am wenigsten verstandenen der fünf Komplexe 5. Der Komplex consists von 45 Untereinheiten, von denen 14 bilden den katalytischen Kern. Einmal montiert, nimmt der Komplex eine L-förmige Struktur mit einem Arm in die Matrix hervorstehenden und der andere Arm in der inneren Membran 6,7 eingebettet. Mutationen in CI - Untereinheiten sind die Ursache für eine Vielzahl von mitochondrialen Erkrankungen 8. Eine funktionell effiziente CI in OXPHOS nicht nur 9 zur Gesamt mitochondriale Atmung erforderlich ist , sondern auch für die erfolgreiche Zellzyklusprogression 10. das Funktionieren dieser membrangebundenen Enzymkomplex in Gesundheit und Krankheit, die Mechanismen Unravelling zugrunde liegen könnte die Entwicklung neuer Diagnoseverfahren und erweiterte therapeutische Strategien ermöglichen. In einer aktuellen Studie haben wir herausgefunden, dass die CyclinB1 / Cdk1 Komplex in die Mitochondrien transloziert in den (Gap 2) G2 / (Mitose) M-Phase und phosphoryliert CI Untereinheiten mitochondriale Energieproduktion zu erhöhen, möglicherweise erhöhten Energiebedarf der Zellen während des Zell ausgeglichen Zyklus 11. Hier stellen wir showcase experimentellen Verfahren und Strategien, die mitochondriale Translokation von sonst Kern / Zytoplasma-Kinasen, deren mitochondriale Substrate sowie funktionelle Konsequenzen ihrer mitochondrialen Lokalisation mit CyclinB1 / Cdk1 als Beispiel zu studieren verwendet werden kann.

Die Erkenntnis, dass die CyclinB1 / Cdk1 Komplex in die Mitochondrien transloziert, wenn Sie dazu aufgefordert notwendig, um die Studien der Mitochondrien-spezifische Überexpression und Zuschlags dieses Komplexes. In den Mitochondrien-spezifischen Expression von Proteinen zu erreichen, kann man eine Mitochondrien-Targeting-Sequenz (MTS) in den N-Terminus des Proteins von Interesse hinzuzufügen. Mitochondrien - Targeting - Sequenzen ermöglichen die Sortierung der mitochondrialen Proteine ​​in die Mitochondrien , wo sie normalerweise 12 befinden. Wir haben eine 87 Basen Mitochondrien-Targeting-Sequenz, abgeleitet aus dem Vorläufer von humanem Cytochrom c Oxidase Untereinheit 8A (COX8) und kloniert es in Green Fluorescent Protein (GFP) -markierte CyclinB1 oder Red Fluorescent verwendetProtein (RFP) -markierte Cdk1 Plasmide in Rahmen enthält. Diese Methode erlaubt uns CyclinB1 und Cdk1 in die Mitochondrien zu zielen, insbesondere die mitochondriale Expression dieser Proteine ​​zu ändern, ohne ihre Kern Pool zu beeinflussen. Durch fluoreszenz diese Proteine ​​Tagging, waren wir in der Lage, ihre Lokalisierung in Echtzeit zu überwachen. In ähnlicher Weise haben wir MTS in ein Plasmid, das RFP-markierte dominant negative Cdk1, eingeführt, die uns speziell auf die mitochondriale Expression und Funktion von Cdk1 abreißen dürfen. Es ist wichtig, zwischen mitochondrialen und Kernfunktionen der Kinasen, die haben zwei Lokalisierungen wie Cdk1 zu unterscheiden. Ingenieur MTS in die N-terminale dieser Dual funktionelle Kinasen bietet eine große Strategie, die einfach eingesetzt und wirksam werden.

Da Cdk1 ein Zellzyklus-Kinase ist, ist es von grundlegender Bedeutung die Zellzyklus-Progression, um zu bestimmen, wenn Cdk1 in Mitochondrien lokalisiert ist. Um dies zu erreichen, haben wir ein neues metho genutztd DNA-Gehalt in Zellen zu überwachen. Traditionelle Methoden umfassen BrdU Verwendung (Bromdesoxyuridin) ein synthetisches Thymidin-Analogon, die während der S-Phase des Zellzyklus in die neu synthetisierte DNA umfasst Thymidin zu substituieren. Dann werden die Zellen, die ihre DNA aktiv replizieren können anti-BrdU Antikörper verwendet werden, detektiert. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist , dass es die Denaturierung von DNA erfordert durch harte Methoden wie Säure oder Wärmebehandlung Zugang für den BrdU - Antikörper zu schaffen, die unter Ergebnisse 13,14 in Inkohärenz führen kann. Alternativ dazu verwendeten wir einen ähnlichen Ansatz, um die teilungsaktiven Zellen, die mit einem anderen Thymidin-Analogon, EdU zu überwachen. EdU Erkennung erfordert keine harte DNA-Denaturierung als einem milden Reinigungsmittel Behandlung Reagenz den Nachweis ermöglicht in neu synthetisierte DNA, die die EdU zuzugreifen. Die EDU - Methode hat sich als zuverlässiger zu sein, konsequent und mit Potenzial für die Hochdurchsatzanalyse 15.

Schließlich to die mitochondriale Substrate von Cdk1 bestimmen, verwendeten wir eine Proteomik-Tool namens 2D-DIGE, die eine erweiterte Version des klassischen zweidimensionalen Gelelektrophorese ist. Zweidimensionale Elektrophorese trennt Proteine ​​nach ihrem isoelektrischen Punkt in der ersten Dimension und einem Molekulargewicht in der zweiten. Da posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung den isoelektrischen Punkt und das Molekulargewicht der Proteine ​​beeinflussen, 2D Gele können die Unterschiede zwischen Phosphorylierung Stati von Proteinen in unterschiedlichen Proben nachzuweisen. Die Größe (Fläche und Intensität) von Proteinspots ändert sich mit der Expression von Proteinen, quantitativen Vergleich zwischen mehreren Proben ermöglicht. Mit dieser Methode konnten wir die phosphorylierten Proteine ​​in Wildtyp im Vergleich zu mutierten Mitochondrien-bezogene Cdk1 exprimierenden Zellen zu unterscheiden. Die spezifischen Proteinspots, die im Wildtyp zeigten, wurden aber in den Mitochondrien-Targeting-Mutante Cdk1 Vorbereitung fehlt, wurden isoliert undüber Massenspektrometrie identifiziert.

In herkömmlichen 2D-Gelen sind Triphenylmethanfarbstoffe verwendet, um die Proteine ​​auf dem Gel sichtbar zu machen. 2D-DIGE verwendet fluoreszierendes Protein Etiketten mit minimaler Auswirkung auf die Protein elektrophoretische Mobilität. Verschiedene Proteinproben mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen, miteinander vermischt und durch die identischen Gelen getrennt markiert werden, so dass die Co-Elektrophorese mehrerer Proben auf einem einzigen Gel 16. Dies minimiert die Gel-zu-Gel-Varianten, die ein kritisches Problem in Gelbasis Proteomstudien ist.

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Protocol

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1. Isolierung von Mitochondrien aus kultivierten Zellen

  1. Herstellung von Isolationspuffer für Zellen (IBK) Puffer
    1. Bereiten 0,1 M Tris / MOPS (Tris (hydroxymethyl) aminomethan / 3- (N - Morpholino) propansulfonsäure): Man löst 12,1 g Tris in 800 ml destilliertem Wasser, pH - Wert auf 7,4 MOPS Pulver verwenden, fügen Sie destilliertes Wasser auf ein Gesamt Volumen von 1 l und lagern bei 4 ° C.
    2. Bereiten 0,1 M EGTA (Ethylenglykol-bis (2-aminoethylether) tetraessigsäure) / Tris: Man löst 38,1 g EGTA in 800 ml destilliertem Wasser, pH-Einstellung auf 7,4 unter Verwendung von Tris-Pulver, mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l und lagern bei 4 ° C.
    3. Bereiten Sie 1 M Sucrose: Man löst 34,23 g Saccharose in 100 ml destilliertem Wasser, machen 20 ml Aliquots, und bei -20 o C
    4. Bereiten IB c Puffer: Herstellung von 100 ml IB C - Puffer durch Zugabe von 10 ml 0,1 M Tris / MOPS und 1 ml von 0,1 M EGTA / Tris auf 20 ml; 1 M Saccharose. Mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. PH-Einstellung auf 7,4.
  2. Herstellung von Zell Lysis Buffer
    1. Bereiten Sie die Lysepuffer, enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA (Ethylen-diamino-tetraessigsäure), 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM β- Glycerophosphat, 1 mM Natriumorthovanadat. Hinzufügen Proteinaseinhibitoren 1 ug / ml Leupeptin und 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) unmittelbar vor Gebrauch.
  3. Isolation of Mitochondria
    1. Ernte 3 x 10 7 Zellen mit eiskaltem 1x PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7,4 und Zentrifugen Zellen bei 600 xg für 10 min bei 4 o C. Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren , das Pellet in 5 ml eiskaltem IB c - Puffer.
    2. Homogenisieren der Zellen für etwa 10 Minuten ein Glas / Glasgewebemühle verwendet wird. Übertragen das Homogenisat in ein 15 ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 600 xg für 10 min bei 4 o C Für funktionelle Mitochondrien, verwenden Sie Glas / Teflon-Kupplung, da sie weniger schädlich für die Mitochondrien als die Glas / Glas-Gewebemühle ist.
    3. Sammeln Sie den Überstand in 1,5 - ml - Röhrchen und zentrifugiert bei 7.000 xg für 10 min bei 4 o C. Den Überstand in ein 1,5-ml-Röhrchen und speichern als Cytosolprotein.
    4. Waschen Sie das Pellet (Mitochondrien) zweimal mit 200 ul eiskaltem IB c Puffer und Zentrifuge bei 7000 × g für 10 min bei 4 o C
    5. Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren , das Pellet in der Puffer Zelllyse und verwenden Sie es sofort oder lagern bei -80 o C für die zukünftige Verwendung. Wenn funktionelle Mitochondrien benötigt werden, erneut zu suspendieren, das Pellet in dem verbleibenden Puffer nach der Überstand verworfen. die mitochondriale Fraktion weitere Verdünnung in der Verlust der Funktion der Mitochondrien führen kann. Speichern auf Eis und verwenden Sie die Vorbereitung in 1-3 Stunden für beste Ergebnisse.
    6. Beschallen das resuspendierte Pellet für dreißig 3-sec platzt in eineEisbad Zentrifuge bei 10.000 × g für 5 Minuten, und speichern Sie den Überstand als mitochondriale Fraktion.

2. Co-Immunfärbung von Cdk1, CyclinB1 und COXIV, eine mitochondriale Protein Einwohner

  1. Wachsen 5 x 10 4 Zellen auf Deckgläschen in 24-Well - Platten O / N oder bis zu 70% Konfluenz. Saugen Sie das Medium und die Zellen werden zweimal mit 500 ul eiskaltem 1 x PBS, pH-Wert 7,4.
  2. Fix-Zellen mit 500 ul eiskaltem 4% Paraformaldehyd bei RT für 10 min. Saugen Sie das Fixier-Lösung und waschen Sie die Zellen mit 500 ul 1 x PBS 3 mal, jeweils 5 min mit sanftem Schütteln bei RT.
  3. Permeabilisierung der Zellen mit 0,2% Triton X-100 in 500 ul PBS für 5 min bei RT. Absaugen die Lösung und waschen Sie die Zellen 3-mal, jeweils 5 min mit 500 ul PBS. Fügen Sie die Blockierungslösung (500 & mgr; l, 1% BSA (Rinderserumalbumin) in PBS, das 1% Tween 20 enthält) für 30 min bei RT.
  4. Verdünnen Sie die primären Antikörper 1: 250 (v: v) in 5001; l Lösung blockiert und Inkubation der Zellen mit gewünschten Primär in verschiedenen Spezies gebildeten Antikörpern Kreuz Signalisierung (CyclinB1 (Maus) und COXIV (Kaninchen) oder Cdk1 (Maus) und COXIV (Kaninchen) bei RT zu vermeiden, für 30 - 60 min oder O / N bei 4 o C
  5. Waschen Sie die Deckgläser mit 500 ul 1 x PBS 3 mal, jeweils 5 min und dann Inkubieren mit sekundärem Antikörper, verdünnt 1: 1000 in 500 & mgr; l Blockierungslösung bei RT für 1 h, gefolgt von 500 & mgr; l Wasch PBS 3 mal, jeweils 5 min.
  6. Montieren Sie die Deckgläser mit 20 ul anti-fade Befestigungslösung und versiegeln Sie die Dias mit Nagellack. Bild die Dias ein Fluoreszenzmikroskop sofort oder bei 4 ° C im Dunkeln halten für 1 - 2 Wochen.

3. Natriumkarbonat Extraktion von Intact Mitochondria

  1. Wachsen ca. 20 x 10 7 Zellen, Ernte, waschen Sie einmal mit PBS und zu isolieren , die Mitochondrien , wie in Abschnitt 1. Teilen mitochondrialen beschrieben isoliert in zwei parts vor dem letzten Zentrifugation die Mitochondrien zu pelletieren (vor dem Schritt 1.3.4); sparen die Hälfte als die Gesamt Mitochondrien (Schritt 3.2) verwendet werden, verwenden Sie die andere Hälfte für Natriumcarbonat-Extraktion (folgende Schritte 3,3-3,6) löslichen und membrangebundenen Proteinen zu trennen.
  2. Lyse die gesamten Mitochondrien Pellet mit 30 ul Puffer Zell - Lyse und speichern Sie das Lysat bei -80 o C bis in Immunoblotting verwendet.
  3. Nach Eintragen von 250 ul 0,1 M Na 2 CO 3 (Natriumcarbonat), pH 11,0, auf die andere Hälfte des mitochondrialen Pellet und Inkubieren auf Eis für 30 min.
  4. Zentrifuge bei 100.000 xg für 20 min. Sammeln Sie den Überstand und gehen 3,5 Schritt. Lysieren das Pellet unter Verwendung von 30 ul Zelllyse-Puffer und beschallen, wie in Schritt 1.3.6. Bei -80 o C bis in Immunoblotting verwendet.
  5. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 20% frisch hergestellten Trichloressigsäure (TCA) zu dem Überstand die Proteine ​​auszufällen und halten auf Eis für 30 min.
  6. Zentri- fugalkrUGE bei 15.000 xg für 10 min. Überstand verwerfen, lösen sich die Pellets in 80 ul Zell - Lyse - Puffer und bei -80 o C bis in Immunoblotting verwendet.

4. Trennung von inneren und äußeren Membranen von Mitochondrien (Isolierung von Mitoplasts)

  1. Wachsen ca. 20 x 10 7 Zellen, Ernte, waschen Sie einmal mit PBS und zu isolieren , die Mitochondrien , wie in Abschnitt 1. Trennen Sie die mitochondriale Fraktionen in 10 gleiche Teile vor der letzten Zentrifugation beschrieben die Mitochondrien zu pelletieren (vor dem Schritt 1.3.4).
  2. Auflösen jedes Pellet in 30 & mgr; l der angezeigten Konzentration von hypotonischen Saccharose-Puffer (1 mM EDTA, 10 mM MOPS / KOH (Kaliumhydroxid), pH 7,2; Saccharosekonzentration im Bereich von 25 bis 200 mM) mit oder ohne 50 & mgr; g / ml Trypsin ( siehe Tabelle 1) und Inkubation 30 min auf Eis.
  3. Werden 3 ul 10 mM PMSF zu dem Trypsin (eine Endkonzentration von 1 mM PMSF zu erreichen) Fläschchen mit t zu stoppener Verdauung Trypsin und für 10 Minuten auf Eis inkubiert.
  4. Zentrifuge bei 14.000 xg bei 4ºC für 10 min. Den Überstand in ein neues Röhrchen, lysieren das Pellet in 30 ul Zell - Lyse - Puffer, beschallen , wie in Schritt 1.3.6, und bei -80 o C

5. Konstruktion von Mitochondrien-bezogene GFP / RFP-markierten CyclinB1 / Cdk1 Vektoren und Bestätigung ihrer mitochondriale Lokalisation

  1. Klon, der die Mitochondrien-Targeting-Sequenz (MTS; abgeleitet aus dem Vorläufer von humanem Cytochrom c Oxidase Untereinheit 8A (COX8) zwischen den Nukleotiden 76 bis 161) in Rahmen in den N-Terminus von GFP oder RFP an NheI und BamHI-Stellen von pEGFP-N1 oder pERFP -N1 Vektoren Standard molekulare Klonierungstechniken verwendet wird.
  2. BamHI-Restriktionsenzym-Erkennungsstellen (fett) an das 5'der PCR-Primer Wenn PCR-Primer für CyclinB1 und Cdk1 Gene entwerfen, hinzuzufügen.
    Vorwärts Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    Reverse - Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
    Vorwärts CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
    Reverse-CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
  3. Amplify die Cdk1 und CyclinB1 Gene dieser Primer folgende Standardtechniken verwendet werden. Digest der PCR-Produkte mit 1 ul Restriktionsenzym BamHI bei 37 ° C für 2 Stunden. Führen Sie die Verdauungsprodukte auf einem 1% Agarosegel. Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie die richtige -Aussparung DNA-Fragmente aus und reinigen die DNA aus dem Gel ein Gel-Extraktions-Kits verwenden.
  4. Digest 1 ug MTS-pEGFP-N1 und MTS-pERFP-N1 Plasmide mit 1 ul BamHI Enzym bei 37 ° C für 2 Stunden. 1 ul Calf-IntesDarm-alkalischer Phosphatase (CIP) für 30 min bei 37 ° C. Führen Sie die Verdauungsprodukte auf einem 1% Agarosegel und reinige linearen Plasmiden aus Gel, wie in Schritt 5.3.
  5. Einrichten einer Ligationsreaktion durch Zugabe von 1 ul Plasmid , das aus Schritt 5.4 und 5 ul Cdk1 oder CyclinB1 aus Schritt 5,3-3 ul Ligasepuffer, 0,5 ul T4 - Ligase und 20,5 ul dH 2 O. Inkubieren O / N bei 4 ° C.
  6. Transformieren von Escherichia coli DH5 & agr; kompetente Zellen mit 10 & mgr; l Ligationsgemisch nach Standardtechniken und wachsen die Bakterien auf 10 mg / ml Kanamycin enthaltenden LB - Agarplatten , O / N bei 37 ° C Kolonien zu erhalten.
  7. Suchen Sie sich eine Kolonie von O / N gewachsenen Platten eine sterile Pipettenspitze, legen Sie die Spitze in einen 5 ml Kanamycin-LB-enthaltenden Röhrchen und inkubieren O / N. Isolieren Sie das Plasmid unter Verwendung von Miniprep-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers, und die Sequenz, die das Plasmid mit Standardtechniken.
  8. Transfizieren exponentiell wachsenden MCF10A - Zellen (1,5 x 10 4 Zellen auf 96-Well - Platten) mit einer MTS-Cdk1-RFP oder MTS-CyclinB1-GFP Plasmiden aus Schritt 5.7 durch Herstellen eines Plasmid / Transfektionsreagenz Verhältnis von 1: 2 (w: v, 100 ng : 0,2 & mgr; l) in 100 & mgr; l serum- und antibiotikafreiem Medium.
  9. In einem CO 2 -Inkubator mit Feuchtigkeitskontrolle (5% CO 2, 95% relative Luftfeuchtigkeit) bei 37 ° C für 48 Stunden inkubieren , die Zellen in Plasmid / Reagenzienmischung.
  10. Vorbereitung 1 mM Stammlösung von mitochondrialen roten und grünen Fluoreszenzfarbstoffe durch 50 & mgr; g Pulver Lösen in 100 ul DMSO. Von der Stammlösungen 1: 400 in 1x PBS 2,5 uM Arbeitslösungen zu erhalten. Die Stammlösungen können für ein Jahr bei -20 ° C gelagert werden.
  11. Mix 2 & mgr; l von 2,5 & mgr; M des roten Farbstoffes mit 98 ul Kulturmedium, das eine 50 nM Endkonzentration herzustellen.
  12. Ersetzen Sie die Zellkulturmedium von CyclinB1-GFP MCF10A Zellen Lager (erzeugt in Schritt 5.8) mit dem roten Farbstoff Medium für 2 min enthält. Wiederholen Sie diegleiche Verfahren mit grünem Farbstoff für Cdk1-RFP Lager MCF10A Zellen.
  13. Zweimal waschen mit 100 ul 1 x PBS loswerden der überschüssige Färbelösung zu erhalten, fügen Sie 100 ul 1x PBS auf die 96-Well-Platte.
  14. Visualisieren der Mitochondrien und CyclinB1-GFP (Anregung von 488 nm und einer Emission bei 494 bis 536 nm) und Cdk1-RFP (Anregung von 560 nm und einer Emission bei 565 bis 620 nm) auf 96-Well-Platten unter Fluoreszenzmikroskop bei 40facher Vergrößerung.

6. Identifizierung von differentiell phosphorylierten Proteine ​​über 2D-DIGE

  1. Probenvorbereitung
    1. Isolieren Mitochondrien und lysieren mitochondrialen Fraktionen, wie in Schritt 1.3. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 20% TCA (Trichloressigsäure in Wasser) zu jeder Probe und Vortex für 15 Sekunden. Inkubieren Proben auf Eis für 30 min, wie die Proteine ​​aus der Lösung ausfallen.
    2. Zentrifuge Proben bei 9.300 × g bei 4 ° C für 5 min, Überstand zu entfernen, und werden 60 & mgr; l kaltem Aceton (100%), gefolgt vonZentrifugation bei 9.300 × g bei 4 ° C für 5 min.
    3. Wiederholen Sie das Aceton Waschschritt (Schritt 6.1.2) ein weiteres Mal, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Proben in 50 ul DIGE Markierungspuffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH-Wert 8,5).
  2. Bereiten Sie die Fluoreszenzfarbstoffe
    1. Bereiten Stammlösung: Lösen Farbstoffe (5 nmol) in 5 ml frisches Dimethylformamid (DMF) zu einer Endkonzentration von 1 nmol / & mgr; l. Bewahren Sie die Lager Farbstofflösung bei -20 ° C bis zur Verwendung für ein paar Monate.
    2. Bereiten Sie Arbeitslösung: Lassen Sie Farbstoffe für 5 min bei RT einzustellen. Verdünne 1 ul Farbstoff mit 4 ul DMF zu einer Endkonzentration von 200 pmol / & mgr; l. Halten Sie sich auf Eis während des Gebrauchs. Anmerkung: Die Arbeitslösung kann für 3 Wochen bei -20 o C aufbewahrt.
  3. Label - Proteine
    1. Mischen Sie 1 ul Arbeitsfarbstofflösung pro 12,5 ug Protein. Scale up nach Bedarf. Für gepoolt Standards, fügen Sie 61; l von Cy2 Arbeitslösung zu 300 & mgr; g Protein gepoolt.
    2. Vortex für 30 sec und Zentrifuge bei 4 ° C für 30 sec bei 12.000 x g. Inkubieren auf Eis im Dunkeln für 30 min. Stoppen Sie die Markierung durch Zugabe von 1 & mgr; l von 10 mM Lysin pro 1 ul Arbeitslösung verwendet. Gut mischen und Inkubation auf Eis im Dunkeln für 10 min.
    3. Pool individuell markierten Proben und mischen sich mit Rehydrationspuffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, Bromphenolblau). Das Gesamtvolumen wird 125 ul sein.
    4. Vortex Proben für 30 Sekunden und lassen Sie Proben für 30 min bei RT einzustellen. Last 125 & mgr; l Proben auf 7 cm pH 4-9, isoelektrische Fokussierung (IEF) Streifen.
  4. Erste Dimension Elektrophorese
    1. Legen Sie die Streifenhalter (Särge) auf der Elektrodenplatte, sicherstellen, dass die Streifenhalter sind absolut sauber und trocken. Pipette 125 ul-Proben in einen Sarg, gleichmäßig über die gesamte Sarg zu verbreiten.
    2. Mit tweezers, nehmen Sie den IEF Streifen auf, sorgfältig die Kunststoff-Schutzabdeckung zu entfernen, und es (Gel-Seite nach unten) in Sarg / Rehydrationspuffer platzieren. Vermeiden Sie Luftblasen einzufangen. Füllen Sie langsam Sarg (1 - 1,5 ml) mit Mineralöl und setzen den Sarg auf die Särge bedeckt.
    3. Beginnen isoelektrischen nach dem Protokoll in der Tabelle mit Schwerpunkt 2:
      Hinweis: Wenn der Lauf beendet ist, können die Streifen in Plastikröhrchen bei -80 o C aufbewahrt werden oder verschoben direkt auf Equilibrierung und der zweiten Dimension.
  5. Zweite Dimension - Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid - Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
    1. Equilibrierung
      1. Auftauen SDS Äquilibrierungspuffer (8 ml pro Streifen, 6 M Harnstoff, 30% Glycerin, 2% SDS). Abwiegen Dithiothreitol (DTT; 10 mg DTT pro 1 ml SDS Äquilibrierungspuffer). Man löst DTT in 4 ml SDS Äquilibrierungspuffer.
      2. Abwiegen IAA (Iodacetamid, 25 mg IAA pro 1 ml SDS Äquilibrierungspuffer).Löse IAA in 4 ml SDS Äquilibrierungspuffer.
      3. Schmelze 1 ml Dichtungs Agarose-Lösung in einem Wasserbad für eine spätere Verwendung.
      4. Wenn die Streifen eingefroren wurden, damit sie vollständig auftauen. Legen Sie die Streifen Gel Seite nach oben in die reswelling Fach. 4 ml SDS Äquilibrierungspuffer mit DVB-T zu jedem Streifen und Inkubation für 15 min unter leichtem Schütteln.
      5. Gießen Sie alle SDS Äquilibrierungspuffer mit DTT ab. 4 ml SDS Äquilibrierungspuffer mit IAA zu jedem Streifen und Inkubation für weitere 15 Minuten unter leichtem Schütteln. Nach Äquilibrierung mit dem IAA-Puffer, gießen des Äquilibrierungspuffer SDS.
    2. SDS-PAGE
      1. Packen Sie Minigel, nehmen Sie den Kamm und spülen Sie das Gel und die Vertiefungen mit ddH 2 O. Entfernen Sie das weiße Band am unteren Rand des Gels vor der Ausführung. Richten Sie den Streifen auf dem Gel richtig, Gel Orientierung ist für Punktschneiden kritisch.
      2. Legen Sie das Gel flach auf Zähler mit der kleinen Platte und Gel Oberseite nach experimenter. Legen Sie den Streifen auf die hohen Platte mit anodische Ende (++ enden mit dem Barcode) auf der linken Seite des Gels gegenüber. Mit einem Lineal, langsam schieben Sie den Streifen nach unten auf Geloberfläche. Vermeiden Sie Luftblasen zwischen dem Streifen Einfangen und das Gel. Stellen Sie das Gel nach oben in einer Glasplatte stehen.
      3. 1 ml der Heißsiegel Agarose-Lösung auf die Öffnung der Kassette. Stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen einen flachen Lineal herausgedrückt werden. Montieren Sie das Gerät und führen Sie das Gel mit einer konstanten 125 V für 90 min.
      4. Wenn das Gel Ausführung beendet ist , legen Sie das Gel auf einer biomolekularen Imager mit 2 ml ddH 2 O und scannen Sie das Gel in der Fluoreszenzerfassungsmodus mit 635 nm Anregungslaser und 665 nm Emissionsfilter.
    3. Phosphoprotein Anfärben
      1. Befestigen Sie das Gel mit 50% Methanol und 10% Essigsäure-Mischung (10 ml) für 30 Minuten zweimal. Waschen mit 10 ml Wasser für 10 min und dreimal mit 10 ml stain stain Phosphoprotein für 60-90 min, gefolgt vonEntfärben mit 10 ml destain Lösung für 30 min dreimal.
      2. Waschen mit 10 ml Wasser 5 min zweimal und Bild das Gel mit einem Laser-Gelscanner bei 532 nm / 560 nm Anregung / Emission.
    4. Proteinverdauung und Identifizierung
      1. Excise alle der differentiell exprimierten Proteinspots aus dem Gel in Mikrotitervertiefungen mit Hilfe eines Roboter-Spot-Picker nach Herstellerangaben, und mit 100 mM Ammoniumbicarbonat (2 ml) für 1 Stunde bei RT die Gelstücke entfärben. Entwässern mit 2 ml 100% Acetonitril zweimal waschen und trocken in einem Vakuum-Konzentrator für 30 min.
      2. Rehydratisieren die Gelstücke mit 100 ul von 13 ng / & mgr; l modifiziertes porcine Trypsin in 50 mM Ammoniumbicarbonat für 16 Stunden bei 37 ° C. Sammeln der Überstände und Extrahieren weiterhin die Proteine ​​mit 100 & mgr; l von 5% Trifluoressigsäure in 50% Acetonitril für 30 min.
      3. Konzentrieren Sie die Peptide auf 5 & mgr; l von Vakuumzentrifuge concentrator und analysieren mit MALDI - Ionisation - Time of Flight - Tandem - Massenspektrometrie - Analyse (MALDI - TOF-MS / MS) 17.

7. In - vitro - Kinase - Assay

  1. Herstellung von Substraten
    1. Sub-Klon Complex I (CI) Untereinheiten (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6 und NDUFA12), die als unterschiedlich phosphorylierten Cdk1 Ziele identifiziert werden, in pGEX-5X-1-Vektor zu erzeugen, Glutathione-S-Transferase (GST) -markierte bakteriellen Expressionsplasmide 11. Reinige CI-Untereinheiten, die eine hohe Affinität Glutathion Spalten nach unten Protokoll.
      1. Kultur GST-tagged CI - Untereinheit enthaltende Escherichia coli - Stamm BL-21 in Luria-Bertani (LB) Medium mit 50 ug / ml Ampicillin in einem Schüttler bei 37 ° C bis eine optische Dichte (OD) von 0,6 erreicht wurde. Fügen Sie Isopropyl-bD-Thio-galactopyranosid (IPTG) zum Kulture in einer Endkonzentration von 0,1 mM, und für weitere 3 h inkubiert.
      2. Zentrifuge bei 600 × g für 10 min, um die Bakterien zu sammeln und zu resuspendieren in 5 ml 1 x PBS Puffer, der 5 mM DTT, 1 x Proteinase-Inhibitor-Cocktail, und 0,1% Lysozym. Lyse der Zellen durch Beschallung für zwanzig 5 s-Bursts und bei 600 xg für 10 min, um die Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt werden.
      3. Sammeln Sie den Überstand und Inkubation mit Glutathion-Agarose-4B-Kügelchen in einem Volumenverhältnis von 4: 1 (Überstand: bead) für 1 h bei RT.
      4. Eluieren die GST-Fusionsproteine ​​aus den Perlen mit 3 ml Glutathion-Elutionspuffer (10 mM reduziertem Glutathion in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) und unter 12 die eluierten Proteine ​​Dialyse in molekularen poröse Membran Schlauch (Molekulargewicht cut-off -14 Kilo-Dalton), mit 1 x PBS / 1 mM EDTA. Lagern Sie die gereinigte Proteine ​​bei - 80 o C.
  2. Cdk1 Kinase - Assay
    1. Vor der Kinase ass zu startenay, stellen Heizblöcke bis 30 ° C und 100 ° C. Thaw kommerziellen CyclinB1 / Cdk1 Enzymkomplex und Substrate auf dem Eis.
    2. Bereiten Sie die Reaktionsmischung auf Eis. Seit 32 P ATP - Isotop beteiligt ist, bereiten alle Reaktionsmischungen in 1,5 ml Probenröhrchen mit Schraubverschluss einen O - Ring enthält Ausbreitung von Radioaktivität zu verhindern.
      Achtung: Folgen Sie den radioaktiven Stoffen Schutzvorschriften. Verwenden Sie eine 8 mm dicke Plexiglas Abschirmung und Arbeit zumindest auf eine Armlänge. Wischen Sie alle kontaminierten Bereich mit Wasser.
    3. Vorbereiten eines 30 & mgr; l Reaktionspuffer , enthaltend 1 x Cdk1 - Puffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,01% Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM kaltes ATP, 0,1 & mgr; Ci 32 P ATP, 2 Einheiten CyclinB1 / Cdk1 und 6 ug Substrat-Protein. Stellen Sie die Lautstärke auf 30 & mgr; l mit ddH 2 O. Für positive Kontrollreaktion, ersetzen Sie das Substrat mit 0,01 mM Histon H1, einem bekannten CyclinB1 / Cdk1 Substrat.
      1. Für negative control Reaktionen (1) ersetzen, das Substrat mit GST-Protein nur und (2) ersetzen, das Substrat mit 0,01 mM Histon H1 + 0,5 uM RO-3306, einem selektiven Cdk1-Inhibitor.
    4. Gut mischen mit Pipette und Zentrifuge bringen die gesamte Flüssigkeit auf dem Boden des Röhrchens, minimiert Risiko der Kontamination. für 60 min bei 30 ° C inkubieren.
    5. Liste 6 ul 5x SDS - Probenpuffer , die Reaktion zu stoppen und zu denaturieren , bei 100 o C für 10 min. Führen Sie Proben auf 10% SDS-PAGE-Gel bei 160 V für 2 Stunden oder bis Farbstofffront das Ende des Gels erreicht. Übertragen Sie Gel auf eine Chromatographie-Papier und wickeln mit Plastikfolie.
      Achtung: Alle Flüssigkeit in Kontakt mit Radioisotopen sollte als radioaktiver Abfall und entsorgt gemäß Richtlinien des Instituts durch die Umwelt, Gesundheit und Sicherheit Dienstleistungen in einem Poly carboy 5-Gallonen behandelt werden.
    6. Setzen Sie das Gel auf einem Röntgenfilm für 1 Tag oder bis zu 1 Woche bei -20 ° C auf die spezifische Aktivität des Radioisotops je nach verwendetemund das Enzym.

8. gerichtete Mutagenese zu generieren Dominant Negative Cdk1 (D146N)

  1. Design-Mutagenese-Primer; zwei Primern, komplementär zueinander sind, das mutierte Stelle enthält (G wird durch eine Nukleotidsequenz ersetzt werden für N anstelle von D Aminosäure zu codieren) von 20 Basen auf jeder Seite 11 flankiert.
  2. Vorbereiten eines 50 & mgr; l Polymerase - Kettenreaktion (PCR) Gemisches 1x Reaktionspuffer, 2,5 mM dNTPs, 10 & mgr; M Primer (vorwärts und rückwärts), 40 ng des Templats enthält, und ddH 2 O. Hinzufügen, 2,5 U der DNA-Polymerase in die Reaktions.
  3. Den folgenden PCR-Programm: 95 ° C 3 min, 95 ° C 30 sec, 55 ° C 30 min, 68 ° C 6 min; 16 Zyklen (Anmerkung: 68 ° C Inkubationszeit wird durch die Größe der DNA bestimmt 1 min / kb für DNA ≤ 10 kb erforderlich Für größere DNA, 2 min / kb plus 10 Sekunden pro Zyklus..). Folgen Sie von 68 ° C 7 min und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung.
  4. Hinzufügen2 ul Dpn I - Restriktionsenzym (10 U / ul) und 5,7 ul Dpn I - Puffer, gut mischen mit leichtes Antippen mit dem Finger und die Reaktion bei 37 ° C für 1 Stunde inkubiert.
  5. Transfer 10 ul Dpn I-behandelten PCR-Produkte in 50 ul kompetente DH5a-Zellen für die Transformation. Inkubieren auf Eis für 30 min, gefolgt von 45 Sekunden Hitzeschock bei 42 ° C und 5 min auf Eis. In 500 ul LB und schütteln bei 37 ° C für 1 Stunde vor dem Ausstreichen auf LB-Agar - Platten. Inkubieren O / N bei 37 o C.
  6. Wählen Sie eine Kolonie von der O / N Agarplatten eine sterile gelben Pipettenspitze, fallen die Spitze in ein Röhrchen , enthaltend 5 ml LB gezüchtet und wachsen O / N bei 37 o C shaker. Isolieren Plasmid, das ein Miniprep Kit und die Plasmid-Sequenz die Mutation zu bestätigen gemäß dem Protokoll des Herstellers.

9. Bestimmung der Zellzyklusphasenlängen mit EdU Inkorporationstest

  1. Zellsortierung
    1. Transfect 2 x 10 5 Zellen mit den angegebenen Vektoren (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-wt-RFP oder MTS-Cdk1-dn-RFP) in einer 6-Well - Platte mit 1: 2 (w: v , 2,5 ug: 5 ul) Verhältnis von DNA: Transfektionsreagenz Mischung in 2,5 ml serum- und antibiotikafreien Kulturmedien für 48 Stunden hergestellt. Live-Art-Zellen, die stabil die GFP-markierten Cdk1 und RFP-markierte CyclinB1 Proteine ​​über Durchflusszytometer.
      1. Wash - Zellen mit 1 x PBS, 100 & mgr; l Trypsin in die Schale und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. 2 ml Kulturmedium, die Zellen zu sammeln und leiten sie durch einen 70 um-Filter eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Waschen Sie die Einzelzellsuspension mit 500 ul 1% fötales Kälberserum in PBS (FCS / PBS), bevor sie auf cytometer Strömung zu laden.
      2. Richten Sie die Sortierparameter etabliert folgende Protokolle 18 - Gating für doppelt positiven Zellen gefärbt mit beiden GFP und RFP. Sammeln Sie die sortierten Zellen kommen aus dem Zytometer in ein Rohr containing Zellkulturmedium und verwenden diese Zellen für die Analyse der Zellzyklusprogression mit EdU Pulse-Chase-Kennzeichnung wie in Protokoll 9.2.
  2. Die Messung der Zellzykluslänge anhand der EdU Labeling Durchflusszytometrie - Assay
    1. Seed sortierten Zellen in 6-Well - Platten bei einer Dichte von 2,5 x 10 5 Zellen pro Vertiefung und der Kultur O / N bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator. Hinzufügen EdU zu dem Kulturmedium in einer Endkonzentration von 25 uM. Für 1 Stunde in einem CO 2 -Inkubator bei 37 ° C inkubieren.
    2. Wasche die Zellen mit 1% BSA in 500 ul PBS und sammeln sie in einem 1,5 ml Röhrchen bei 2 Stunden Intervallen für insgesamt 10 bis 12 Stunden.
    3. Centrifuge Zellen bei 350 xg für 5 min den Überstand verwerfen. Vertreiben Sie das Pellet durch Zugabe von 100 & mgr; l der Fixierlösung (vom Hersteller im EdU Labeling Kit) für 15 min bei RT und gut mischen.
    4. Wasche die Zellen mit 1 ml von 1% BSA in PBS dreimal. Fix dieZellen erneut mit 0,5 ml 70% Ethanol O / N bei 4 o C
      Hinweis: Ethanol Fixierung kritisch ist die interne GFP / RFP Fluoreszenz aufgrund des rekombinanten-markierten Protein-Expression zu stillen.
    5. Zentrifugiere die Zellen erneut bei 350 xg für 5 min und wasche das Pellet mit 1 ml 1% BSA in PBS einmal. Resuspendieren der Zellen in 1 ml Permeabilisierung Puffer (0,1% Triton-X-100, 1% BSA, 0,2 mg / ml RNase A in PBS) für 20 min bei RT.
    6. Wasche die Zellen mit 1 ml von 1% BSA in PBS einmal. In 0,5 ml Reaktions Cocktail in jedes Röhrchen und gut mischen. Inkubieren Reaktionsgemisch bei RT für 30 min im Dunkeln.
    7. Waschen mit 1 ml 1% BSA in PBS einmal und Flecken DNA mit 50 & mgr; g / ml Propidiumiodid (PI) in 1 ml 1% BSA in PBS.
    8. Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie die EDU-positiven Bevölkerung zu folgen. Anwesend Streupunktdiagramm von EDU-markierten Zellen gefärbt für den DNA-Gehalt (PI-Färbung, X-Achse) und EDU (Alexa 647 Färbung, Y-Achse).
      1. Verwenden Sie APC-Kanal für AlexA647-edu ein 670/30 Bandpassfilter mit allem Licht vorhanden Verwendung von weniger als 685 nm, dass die Filter schlagen; und Phycoerythrin (PE) Kanal für PI mit einem 581/15 Bandpassfilter vor ihm mit allem Licht vorhanden weniger als 600 nm, dass die Filter zu schlagen.
      2. Legen Sie die ersten Schlauchzellen in die Durchflusszytometrie und die Verwendung einer Standard-Gating-Strategie für den Erwerb enthält: Plot FSC-Area X SSC-Bereich für Morphologie, gefolgt von PI (PE-Kanal) X Alexa647-edu (APC-Kanal) für Zellfärbung. Nehmen Sie Daten für alle Rohre einzeln zu erwerben 10.000 Ereignissen pro Probe.
      3. Bestimmen Sie den Zellzyklus - Phasenverteilung der Zellen und Phasenlängen eine Durchflusszytometrie Datenanalyse - Software mit folgenden etablierten Protokollen 11,30.

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Representative Results

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Sub-mitochondriale Lokalisation von CyclinB1 und Cdk1

Natriumcarbonat Extraktion wird verwendet, um zu bestimmen, ob ein Protein in der Mitochondrien oder an der Außenfläche angeordnet ist, nämlich der äußeren Membran. Sobald ein Protein im Inneren der Mitochondrien, weitere Bestimmung der Unter mitochondriale Lokalisation gezeigt wird zu lokalisieren kann über mitoplasting kombiniert mit Proteaseverdau gemacht werden. Um die Unter mitochondriale Lokalisierung von CyclinB1 oder Cdk1 angeben, mitoplasts wurden isoliert durch Mitochondrien in hypotonischen Puffer mit abnehmenden Konzentrationen der osmotischen Saccharose von 200 mM auf 25 mM verdünnt. Die äußere Membran beginnt bei 150 mM Saccharose zu bersten, während die innere Membran , bis die Endkonzentration 25 mM Saccharose (1A) intakt bleibt. In Kombination mit mitoplasting, Assay-Schutz-Protease kann mit tryps durchgeführt werdenin exponierten Proteinen nach der äußeren Membran Bruch zu verdauen. Dies wird bei der Verdauung von Intermembranraum Proteinen führen. Wenn das Protein von Interesse aus Trypsin-Verdau geschützt ist, zeigt dies an mitochondrialen Matrix Lokalisation des Proteins. In dieser repräsentativen Figur wurden mitochondriale Matrix-Protein Hsp60 und Intermembranraum Protein Timm13 als Sub-Mitochondrienlokalisierungsmarker verwendet. Ähnliche mit Hsp60 aber im Gegensatz zu Timm13, CyclinB1 und Cdk1 wurden aus Trypsinverdaus geschützt, unter Angabe ihrer mitochondrialen Matrix Lokalisierung (1B).

Mitochondriale Expression von MTS- und GFP-markierten CyclinB1 und Cdk1 Proteine

MTS ist an dem N-Terminus von CyclinB1 oder Cdk1 Gene in Rahmen kloniert, der GFP oder RFP-Tags an ihrem C-Terminus aufweist. Das resultierende rekombinante Protein Mitochondrien-bezogene GFP- oder RFP-markierte CyclinB1 oder Cdk1. Die Liste der Konstrukte erzeugt und in dieser Studie verwendet wird, in der Figur nicht gezeigt. Mit Hilfe dieser Konstrukte, die Überexpression von CyclinB1 und / oder Cdk1 in den Mitochondrien wurde erreicht, hier gezeigt durch Western - Blotting der isolierten mitochondrialen Fraktionen (Abbildung 2).

Potenzielle Mitochondrial Ziele von CyclinB1 / Cdk1 Bestimmt durch 2D-DIGE

CDK1 gehört der Serin / Threonin (S / T) Kinase-Familie die Übertragung eines Phosphat aus ATP katalysiert, zu Prolin (P) -orientierten S oder T-Resten. Eine Punktmutation , die mit Asparagin (N) an Position 146 von Cdk1 (D146N) erzeugt eine dominant negative (dn) Cdk1 Mutante 19 eine Aspartat (D) Rest ersetzt. Um zu untersuchen, wurde die Funktion der Mitochondrien-Cdk1, ein Mitochondrien-bezogene Cdk1-dn Protein erzeugt, indem ein Plasmid konstruieren (pERFP-N1-MTS-Cdk1-dn), die eine 29 Aminosäure-long mitochondriale Targeting-Sequenz (MTS) von der Untereinheit abgeleitet RFP-tagged dn-Cdk1 verbunden VIII des humanen Cytochrom-C-Oxidase. pERFP-N1-MTS Mitochondrien-bezogene ERFP Proteins wurde als leere Vektorsteuerung verwendet. Mitochondriale Phosphoproteine ​​in G2 / M mit beiden Konstrukten transfizierten Zellen wurden durch 2D-Gel-Analyse mit 4-10 Gelstreifen pH profiliert. Im Vergleich mit leerem Vektor - Transfektanten (Abbildung 3, oben), war eine Gruppe von mitochondrialen Phosphoproteine ​​scheinbar abwesend oder verringert im Cdk1-dn Transfektanten (Abbildung 3, unteres Bild). Massenspektrometrie-Analyse der erfassten Flecken ermittelt die Identität der durch Cdk1 phosphorylierte Proteine ​​in den Mitochondrien.

Zellzyklus - Progression und Bestimmung der Phasenlängen mit EdU Pulse-Chase - Assay

Um das Fortschreiten des Zellzyklus untersuchen when mitochondrialen CyclinB1 / Cdk1 Werte erhöht werden, wird ein Puls-Chase - Markierungsexperiment ein Thymidin - Analogon verwendet, Ethinyl desoxyuridin (EDU) wurde ausgeführt , um die Population von Zellen zu etikettieren läuft DNA - Synthese 20. Dieses Verfahren ermöglicht die Visualisierung von Zellzyklus über ein Fenster 22 h erfasst durch die EDU-positiven Population Tracking, wenn die Zellen Fortschritte durch S und G2 / M-Phasen und reichern sich in der G1-Phase. Die Ergebnisse zeigen, dass mit S-Phasen-Zellen fortgeschritten durch G2 / M-Phase und erschien so schnell in der G1-Phase als 4 h in Zellen Wildtyp mitochondrialen CyclinB1 / Cdk1 exprimieren, wie in Zellen bis 6 h im Vergleich transfiziert mit einem Vektor-Kontrolle oder mutierten CyclinB1 / Cdk1 (4A), dass die Erhöhung der mitochondrialen CyclinB1 angibt / Cdk1 beschleunigt die Zellzyklusprogression.

Abbildung 1
Abbildung 1. Die mitochondriale CyclinB1 / Cdk1 Lokalisiert in der Matrix. (AB) Unter mitochondriale Lokalisation von CyclinB1 und durch mitoplasting und Protease - Schutz - Test nachgewiesen Cdk1, Figur wurde von Wang verändert et al., 2014 11. Die gesamte (T), Pellet (P) und Überstand (S) Fraktionen wurden mit den angegebenen Antikörpern Western-Blotting-Analyse unterzogen. TIMM13 (ein Zwischenraum Protein) und HSP60 (a - Matrix - Protein). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Expression von mitochondrialen Cdk1 Konstrukten. Western - Blot der mitochondrialen Fraktionen isoliert aus Zellen , die mit Mitochondrien-bezogene CyclinB1 und / oder Wildtyp oder dominant negative Mutante Cdk1 (Plasmide sind angegeben auf dem Boden 11. pEGFP-N1-MTS und die pERFP-N1-MTS Vektoren waren leer Vektor Kontrollen für MTS-CyclinB1 und MTS-Cdk1 respectively). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3. Mögliche Mitochondrial Substrate von Cdk1. Mitochondrial extrahierten Proteine ​​von G2 / M-kulminierte Zellen , die mit Mitochondrien-Targeting leeren Vektor (pERFP-N1-MTS, oberes Feld) oder mutierten Cdk1 (pERFP-N1-MTS-Cdk1-dn, unteres Bild) wurden durch 2-D-Gel mit Cy5 (grün), getrennt markiert und phosphorylierte Proteine ​​wurden mit Phosphoprotein Farbstoff (rot gefärbt). Diese Zahl wurde von Wang et al modifiziert. 2014 11."> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Mitochondrial Cdk1 Verbessert G2 / M - Übergang und Gesamtzyklusprogression.
Zellzyklus-Analyse mit EdU Pulse-Chase-Kennzeichnung. Streudiagramm Histogramme von EDU-markierten Zellen wurden für DNA-Gehalt (X-Achse) und EDU (Y-Achse) gezeichnet. Die niedrigeren Zahlen in jeder Tafel zeigen die mittlere Fluoreszenzintensität der EDU Kerne bezeichnet. Die Zeitpunkte wurden in h nach dem EdU Impuls 11 angegeben. Für alle Zeitpunkte, Tore die folgenden Populationen zeigten, wurden gezogen: G0 / G1, S und G2 / M. Für 6, 8 und 10-Stunden-Zeitpunkte, gekennzeichnet Ausbil- G1 *, S / G2 * und G2 / M * Populationen gezeigt. Diese Zahl wurde von Wang et al modifiziert. 2014 11. Bitte klickenhier, um eine größere Version dieser Figur sehen.

Sucrosekonzentrationen Gebraucht
Keine Trypsin 25 mM 50 mM 100 mM 150 mM 200 mM
+ Trypsin 25 mM 50 mM 100 mM 150 mM 200 mM

Tabelle 1. Hypotone Sucrose Puffer verwendet für Schritt 4.2

Schritt 1 30 V 12 Stunden Schritt und Halten
Schritt 2 300 V 0,5 Stunden Schritt und Halten
Schritt 3 1000 V 0,5 Stunden Gradient
5.000 V 1.33 h Gradient
Schritt 5 5.000 V 20.000 V hr Schritt und Halten

Tabelle 2. Isoelektrische Protokoll für den Schritt 6.4.5

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Discussion

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Wie die Proteine ​​für andere subzelluläre Organellen bestimmt, die mitochondriale Zielproteine ​​besitzen Targeting - Signale in ihrer primären oder sekundären Struktur , die sie dem Organell mit Hilfe von aufwendigen Protein translocating und Falzmaschinen 21,22 lenken. Mitochondrien - Targeting - Sequenzen (MTS) aus ausschließlich mitochondrialen resident Proteine ​​wie COX8 erhalten kann , um N-Terminus von jedem Gen - Sequenz hinzugefügt werden , um spezifische Proteine ​​in die Mitochondrien 11,23,24 abzuzielen. Hier CyclinB1 und Cdk1 Gene wurden in COX8 MTS geklonten Vektoren enthält, und bei der Expression der rekombinanten CyclinB1 und Cdk1 wurden in den Mitochondrien lokalisiert. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es die Modifikation der Genexpression in einem bestimmten subzellulären Kompartiment, in diesem Fall die Mitochondrien ermöglicht, ohne die Gesamt Genexpression zu verändern. Mit dieser Strategie Mitochondrien-spezifischen Funktionen eines Kern kinase wurden Cdk1 detelten. In ähnlicher Weise von MTS zu einem dominanten negativen Cdk1 Zugabe, knock down der Mitochondrien-spezifischen Funktionen von Cdk1 erreicht wurde, was die Identifizierung der Mitochondrien spezifische Ziele von Cdk1 erlaubt und ermöglicht die Analyse der funktionellen Konsequenzen der mitochondrialen Abwesenheit von Cdk1 Funktion. Überexpression von Cdk1 ohne die MTS-Tag führt zu einer erhöhten Expression von Cdk1 beiden in Mitochondrien und Zellkern und damit erschwert die weiteren Untersuchungen der Folgen von Mitochondrien-spezifischen Wirkungen von Cdk1.

Allerdings kann dieser Ansatz nicht für alle Genprodukte geeignet sein, da wir ein paar Fehlversuchen bei verlagern einige Kinasen in die Mitochondrien über die Zugabe von MTS-Tag erlebt haben. Einige Zelllinien können ziemlich resistent sein, um die Transfektion und die optimale Protokoll zu finden, kann sehr zeitaufwendig sein. Selbst wenn die Zellen gesund sind und die Transfektion erfolgreich ist, mit fluoreszierenden Proteinen markiert arbeiten weist einige Probleme such als Aggregation, falsche Lokalisierung, nicht-funktionale Fusionen und schwache Signale.

Wesentliche Einschränkungen der Isolierung von Mitochondrien und mitoplasts gehören die geringe Ausbeute und eine mögliche Verunreinigung von anderen zellulären oder Unter mitochondrialen Fächern. Es wird vorgeschlagen, daß adhärente Zellen effizient durch herkömmliche chemische oder mechanische Verfahren nicht gebrochen werden, daher macht es schwierig, hohe Mengen an Mitochondrien aus kultivierten anhaftenden Zellen zu erhalten. Hier verwendeten wir adhärente Kulturen von MCF10A Zellen. Um Ausbeute etwa 30 - 50 & mgr; g mitochondriale Protein, ein Ausgangsbetrag von 3 - wurden 5 × 10 7 Zellen verwendet. Der Homogenisierungsschritt ist ein weiterer kritischer Punkt für die endgültige Ausbeute der mitochondrialen Zubereitungen. Je nach den verwendeten Zelllinien, die Anzahl der Schläge und / oder der Zeit der Homogenisierung kann variieren. Für MCF10A Zellen beobachteten wir, dass 10 Minuten der Homogenisierung von Glas / Glas-Homogenisator erforderlich ist, während embryonale Maus-fibrobla5 min Homogenisierung - M. (MEF) nur 3 erforderlich. Da übermäßige Homogenisierung Schäden an der Membran der Mitochondrien und lösen die Freisetzung von mitochondrialen Komponenten verursachen können, sollten die Standardbedingungen für jede Zelllinie durch die Erfahrung bestimmt werden. Die Verwendung eines Glas-Glas-Homogenisator erhöht die Ausbeute der mitochondrialen Präparationen im Vergleich zu Glas / Teflon-Homogenisatoren. Der Ausgangsbetrag der Zellen sowie Einfrieren / Auftauen der Zellen die Anzahl der Hübe notwendig ändern öffnen, um die Zellen zu brechen. Schließlich Proteindenaturierung und Aggregation kann durch lokalisiertes Erwärmen der Probe während der Homogenisierung auftritt. Es ist daher unerlässlich, um die Gewebemühle vorab Chillen und halten Proben auf Eis während dieses Verfahrens.

Eine andere Methode, die in diesem Artikel ist die Verwendung von EdU Kennzeichnung Zellzyklus in Echtzeit zu überwachen. EdU ist ein modifiziertes Thymidin-Analogon, das fluoreszierend mit einem hellen, licht Alexa Fluor Farbstoff markiert ist. EdU ist effizient in neu synthetisierte DNA eingebaut. Dieses Verfahren ist eine bessere Alternative zur Verwendung herkömmlicher Markierung von Zellen mit dem Nukleosidanalogon, Bromdesoxyuridin (BrdU) proliferieren. BrdU in DNA während der aktiven DNA-Synthese eingebaut. Die Quantifizierung der BrdU-markierte DNA erfordert DNA-Denaturierung durch relativ harten Methoden wie hohe Hitze oder hoher Säure die BrdU-Moleküle für BrdU Antikörper-Bindung zu belichten. Die harte Behandlung für DNA-Denaturierung kann die Probenqualität beeinflussen und ist zeitaufwendig. Mit EdU ist Waschmittel Permeabilisierung für die EdU Nachweisreagenz im allgemeinen ausreichend, um den Zugriff auf die DNA zu gewinnen. Ohne die Notwendigkeit ätzenden Chemikalien zu verwenden oder Wärme für die DNA-Zugang, ist die EDU Verfahren einfacher zu bedienen, genauer und konsistent. Neben den Vorteilen EdU bietet, hat es einige Bedenken in Bezug auf die Verwendung von EdU zur Proliferation studieren. EdU zeigte eine leichte antiproliferative Aktivität bei Behandlungen über 72 h, was zu negl reduziert werden kannigible Ebenen , wenn EdU Impuls wurde auf 1 Stunde 25 gehalten.

Eine Modifikation verwendet mit EdU Kennzeichnung ist die Fixierzeit und Verfahren. Das Kit schlug eine 15 min Fixierung mit dem mitgelieferten Befestigungslösung. Es wurde jedoch eine zusätzliche Fixierung mit 70% Ethanol in diesem Experiment verwendet. Es gibt zwei Gründe für die Verwendung von Ethanol: 1), um die Progression des Zellzyklus über der Zeit zu folgen, eine Zeitpunkt Experiment wurde durchgeführt, wobei Zellen alle 2 Stunden gesammelt wurden. Die Zellen wurden in 70% Ethanol bei 4 ° C , bis alle der experimentellen Zeitpunkten gehalten sind abgeschlossen. Tatsächlich können die Zellen in 70% Ethanol für länger (mehrere Wochen bis Monate) gehalten werden, wenn nötig. 2) Die Zellen für das Experiment verwendet wurden, stabil transfiziert mit GFP-markierten Cdk1 und / oder RFP-tagged CyclinB1. Zur Trennung EdU und PI-Signale von GFP / RFP Fluoreszenz wurde Ethanol Fixierung verwendet, um die GFP und RFP-Proteine ​​zu denaturieren und damit ihre Fluoreszenz auslöschen, bevor die EDU Durchführung einesd PI-Färbung. Vergällt GFP / RFP - Proteine ​​sind im Wesentlichen vollständig nicht-fluoreszierenden, vermutlich weil der Chromophor länger aus ist nicht geschützt 26,27 Abschrecken.

Um mitochondrialen Ziele von Cdk1, 2D-DIGE-Verfahren zu identifizieren, die zu den traditionellen 2D-Gelen in vielerlei Hinsicht überlegen ist, wurde verwendet. In 2D-DIGE, unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe, beispielsweise Cy 3, 5 und 2 werden zu Label - Proben verwendet, die in einem Gel zu 3 Proben gelaufen ermöglicht, die Verringerung der Variabilität ohne die Notwendigkeit Replikaten wie in Standard - 2D - Gel laufen. Die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe in der 2D-DIGE haben eine sehr hohe Empfindlichkeit von 0,2 ng / Punkt im Vergleich zu der Triphenylmethanfarbstoffe bei 100 ng / Stelle, also, die auf den 2D-DIGE Gele mit hoher Punktauflösung laufen kleinere Menge an Proteinen erfordert und Veröffentlichung Qualität Gel-Scans. Eine automatisierte Software wird verwendet, differentiell exprimierte Proteine ​​nachzuweisen, zu quantifizieren und zu definieren. Aufgrund der hohen Punktauflösung, Protein-Expression in Proben Differential can verglichen werden genau die softwaregestützte Punkt Quantifizierung verwendet wird; ein Unterschied von nur 10% über 2D-DIGE erfasst werden und ermöglicht die Visualisierung von post-translationalen Modifikationen leicht. Die Verwendung von softwaregestützten In-Gel-Analyse ermöglicht auch eine schnellere Erfassung von Daten. Da jedoch Geräte wie Fluoreszenzscanner, sind für die Bildaufnahme erforderlich ist, den Einsatz dieses Verfahrens beinhalten zusätzliche Kosten. Weitere Einschränkungen der 2D-DIGE umfassen die schlechte Darstellung von hydrophoben Proteine ​​sowie Proteine ​​mit extreme isoelektrische Punkte und große Molekulargewichte 28,29. Eine weitere Validierung der Ergebnisse, die mit 2D-DIGE alternative Techniken, wie Immunzytochemie oder Western-Blot ist erforderlich, neue Erkenntnisse zu bestätigen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
32P ATP  PerkinElmer BLU002001MC 
Anti-mouse secondary antibody Invitrogen  A-11003 Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11029 Alexa-488 conjugated
ATP Research Organics 1166A For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody Cell Signaling Technology 9112
Cdk1 kinase buffer New England Biolabs P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Life Technologies C10337 For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody Cell Signaling Technology 4844S For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotech sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex New England Biolabs P6020S Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit GE Healthcare Life Sciences 25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9480-26 AA
Dimethylformamide  Sigma Aldrich 319937 DMF
Dithiothreitol Bio-Rad 161-0611 DTT
dNTP EMD Millipore 71004 For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme Stratagene 200519-53 For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid GE Healthcare Life Sciences 17-1335-01 Used as mineral oil
EDTA J.T. Baker 4040-03
EGTA Acros Organics 409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator Fisher Scientific 07-748-13 Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01 Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences 649908 For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1 Calbiochem 382150 For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels GE Healthcare Life Sciences 18-1016-61 IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione Thermo Scientific 15160 Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE Healthcare Life Sciences 11-0033-64 IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside  RPI Corp 156000-5.0 IPTG
Leupeptin Sigma Aldrich L9783 For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668027 Transfection reagent
Lysine Sigma Aldrich L5501 For CyDye labeling
Lysozyme EMD Chemicals 5960
Mitoctracker Red/Green Invitrogen  M7512/M7514 Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS EMD Chemicals 6310
pEGFP-N1 Clonetech 6085-1 GFP-expressing vector
Pfu Stratagene 600-255-52
pGEX-5X-1  GE Healthcare Life Sciences 28-9545-53 GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride Shelton Scientific IB01090 PMSF
Phosphate buffered saline Life Technologies 14040 PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing Spectrum Labs 132700 as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain Life Technologies P-33300 For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail Calbiochem 539134 For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit Stratagene 200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306 Alexis Biochemicals 270-463-M001 Cdk1 inhibitor
Rotenone MP Biomedicals 150154 Complex I inhibitor
Sodium carbonate Fisher Scientific S93359
Sodium chloride EMD Chemicals SX0420-5 For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate Alfa Aesar 33385 For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar L03425 For cell lysis buffer
SpectraMax M2e  Molecular Devices M2E Microplate reader
Sucrose Fisher Scientific 57-50-1
Tissue Grinder pestle Kimble Chase 885301-0007 For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube Kimble Chase 885303-0007 For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution Sigma Aldrich T0699 TCA
Tris MP Biomedicals 103133
Triton-x-100 Teknova T1105
Trypsin Calbiochem 650211
Typhoon Imager GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone Sigma Aldrich C7956

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Experimentelle Ansätze zur Untersuchung Mitochondriale Lokalisation und Funktion eines Kernzellzyklus-Kinase, Cdk1
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Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).More

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).

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