Summary

En enkel metode for Automated fastfaseekstraksjon av vannprøver for Immunologisk Analyse av Små forurensninger

Published: January 01, 2016
doi:

Summary

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Abstract

En ny metode for fastfase-ekstraksjon (SPE) av miljøvannprøver er foreslått. Den utviklet prototype er kostnadseffektiv og brukervennlig, og gjør det mulig å utføre raske, automatisert og enkel SPE. Den pre-konsentrerte oppløsning er kompatibel med analyse ved immunoassay, med et lavt organisk løsningsmiddelinnhold. En fremgangsmåte er beskrevet for ekstraksjon og pre-konsentrasjon av naturlig hormon 17β-østradiol i 100 ml vannprøver. Revers fase SPE er utført med oktadecyl-silika sorbent og eluering utføres med 200 ul metanol 50% volum / volum. Elueringsmiddel fortynnes ved tilsetning av di-vann for å redusere mengden av metanol. Etter fremstilling manuelt SPE-kolonne, er den generelle prosedyren utføres automatisk i løpet av 1 time. Ved slutten av prosessen, blir østradiol-konsentrasjonen måles ved anvendelse av et kommersielt enzymbundet immun-sorbent assay (ELISA). 100 gangers pre-konsentrasjon oppnås, og metanolinnholdet i bare 10% volum / volum. Full inngang på molekyleter oppnådd med 1 ng / L tilsatt avionisert og syntetisk sjøvann prøver.

Introduction

Prøveopparbeidelse er et viktig skritt i enhver analytisk prosess. Spesielt fjerning av matrise effekter, reduksjon av forstyrrelser, og anriking av analytten er nødvendig for å oppnå nøyaktige resultater og oppnå lave påvisningsgrenser. Hormonforstyrrende forbindelser (EDC) er av spesiell bekymring på grunn av deres virkning på levende organismer, selv når stede på svært lave nivåer i miljøet. Det naturlige hormonet 17β-østradiol er til stede på EUs vannforurensning Watch List og utsatt for å bli lagt til listen over prioriterte stoffer som er regulert i henhold til den europeiske vannrammedirektiv. Fastfase-ekstraksjon (SPE) blir vanligvis brukt for analyse av små forurensende stoffer i vann, med både kjemisk 1-5 (kromatografi, massespektrometri) og immunologiske 6-9 deteksjonsmetoder. Sistnevnte fikk interesse innen miljøovervåking, som immunanalyser er tilgjengelige i stort utvalg av formater, er spesifikke for TArget analytt, og når lave påvisningsgrenser. 6, 7, 10, 11 En rekke enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) er kommersielt tilgjengelige, og gjør det mulig å analysere flere prøver på en gang på en multi-brønn plate. Prosedyren består i påfølgende reaksjonstrinn som kan ta noen timer. Sluttproduktet av reaksjonen kan detekteres optisk for å bestemme konsentrasjonen av målmolekylet basert på en kalibreringskurve.

Klassiske SPE prosedyrer inkluderer sorbenten pre-kondisjonering, eksempel ekstraksjon, vasking, eluering og konsentrering ved avdamping av elueringsmiddelet. Løsningsmidlet som anvendes for fortynning av dette ekstraktet er valgt avhengig av påvisningsmetoden. For immunologiske metoder, mengden av organiske løsemidler, sterkt påvirker følsomheten av fremgangsmåten. 12

I tillegg til utvinning og pre-konsentrasjons forestillinger, må fremgangsmåten også være enkel og kostnadseffektivt. Automatisering av procedure bidrar til å redusere menneskerelaterte feil. I vårt tidligere arbeid 13 introduserte vi vår prototype for automatisert SPE, og vår metode ble brukt til analyse av det naturlige hormonet 17β-estradiol i sjøvannsprøver. Med dagens video ønsker vi å fremheve de tekniske fordelene med vår metode i forhold til tradisjonelle off-line og on-line SPE, og sin spesielle kompatibilitet med påvisning av immunreaksjoner. Vi beskriver protokollen anvendt på vannprøver for deteksjon av 17β-østradiol. SPE er utført med oktadecyl-silika (C18) sorbent fase og eluering blir utført med fortynnet metanol.

Protocol

Merk: Den følgende protokollen beskriver SPE utført på 100 ml vannprøve med C18 sorbent og eluering med 50% volum / volum metanol. Det anrikede prøven blir fortynnet for å nå 10% volum / volum metanol før analyse med en enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) kit. 1. Forberedelse av reagenser Forbered vannprøvene Før eventuell andre trinn, å filtrere hver 100 ml vannprøve med 0,2 um porestørrelse filter. Spike prøven med ønsket konsentrasjon ved…

Representative Results

Reproduserbarhet av sorbent pakking ble evaluert ved tørking og å vekte pipettert sorbent i glassflasker, og resultatet er vist i figur 1. Reproduserbarhet av injeksjonstidspunktet ble testet i 100 ml prøver, som vist i figur 2. Konsentrasjon i innledende og pre- konsentrert tilsatt prøvene ble bestemt ved anvendelse av et kommersielt ELISA-sett for 17β-østradiol, og er vist i figur 3.</str…

Discussion

En ny fremgangsmåte for fremstilling av vannprøver fulgt av analyse ved hjelp av immunologisk analyse ble foreslått. Instrumentet gjør det mulig å utføre fastfaseekstraksjon i en automatisert og brukervennlig måte.

Filtrering av vannprøven før dens injeksjon inn i systemet er kritisk. Eventuelle partikler som fremdeles er tilstede i løsningen ville forårsake tilstopping av fluidic nettverket og hindre SPE-kolonne. Et annet viktig trinn er fremstilling av SPE-kolonne. Mengden av pa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by the European Union Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement no. 265721. The authors thank the RIKILT Institute for Food Safety (NL) for their support in this project.

Materials

Filter membrane 0.2 μm pore size Merck Millipore GNWP04700 For sample filtration
Nylon membrane 11 μm pore size Merck Millipore NY1104700 For SPE column
Disposable biopsy punch 5 mm Medical Budget 39302439
Nucleodur C18 ec  Macherey Nagel 713550.01 50 μm particle diameter
Synthetic sea water Sigma Aldrich SSWS500-500ML
Methanol VWR
17beta-estradiol standard Enzo Life Science 300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kit  Enzo Life Science ADI-900-008 96 wells, range 30 – 3000 ng/L

References

  1. Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water. J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).
  2. Azzouz, A., Souhail, B., Ballesteros, E. Continuous solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples. J. Chromatogr. A. 1217, 2956-2963 (2010).
  3. Tomsikova, H., Aufartova, J., Solich, P., Novakova, L. High sensitivity analysis of female-steroid hormones in environ-mental samples. Trends Anal. Chem. 34, 35-58 (2012).
  4. Ciofi, L., Fibbi, D., Chiuminatto, U., Coppini, E., Checchini, L., Del Bubba, M. Fully automated on-line solid phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis at sub-ng/L levels of selected estrogens in surface water and wastewater. J. Chromatogr. A. 1283, 53-61 (2013).
  5. Robles-Molina, J., Lara-Ortega, F. J., Gilbert-Lopez, B., Garcia-Reyes, J. F., Molina-Diaz, A. Multi-residue method for the determination of over 400 priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1350, 30-43 (2014).
  6. Huang, C. H., Sedlak, D. L. Analysis of estrogenic hormones in municipal waste water effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry. Environ. Toxicol. Chem. 20, 133-139 (2001).
  7. Hintemann, T., Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment. Water Res. 40, 2287-2294 (2006).
  8. Farré, M., Kuster, M., Brix, R., Rubio, F., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples. J. Chromatogr. A. 1160, 166-175 (2007).
  9. Pu, C., Wu, Y. F., Yang, H., Deng, A. P. Trace analysis of contraceptive drug levonorgestrel in waste water samples by a newly developed indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with solid phase extraction. Anal. Chim. Acta. 628, 73-79 (2008).
  10. Van Emon, J. M., Gerlach, C. L. A status report on field-portable immunoassay. Environ. Sci. Technol. 29 (7), 312A-317A (1995).
  11. Farré, M., Brix, R., Barcelò, D. Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years. Trends Anal. Chem. 24 (6), 532-545 (2005).
  12. Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethinylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative. Steroids. 69, 245-253 (2004).
  13. Heub, S., et al. Automated and portable solid phase extraction platform for immuno-detection of 17β-estradiol in water. J. Chrom. A. 1381, 22-28 (2015).
  14. Petrovic, M., Eljarrat, E., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Endocrine disrupting compounds and other merging contaminants in the environment: a new survey on new monitoring strategies and occurrence data. Anal. Bioanal. Chem. 378, 549-562 (2004).
  15. Richardson, S. D., Ternes, T. A. Water analysis: Emerging contaminants and current issues. Anal. Chem. 86, 2813-2848 (2014).

Play Video

Cite This Article
Heub, S., Tscharner, N., Kehl, F., Dittrich, P. S., Follonier, S., Barbe, L. A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants. J. Vis. Exp. (107), e53438, doi:10.3791/53438 (2016).

View Video