En enkel metode for Automated fastfaseekstraksjon av vannprøver for Immunologisk Analyse av Små forurensninger

Summary

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Abstract

En ny metode for fastfase-ekstraksjon (SPE) av miljøvannprøver er foreslått. Den utviklet prototype er kostnadseffektiv og brukervennlig, og gjør det mulig å utføre raske, automatisert og enkel SPE. Den pre-konsentrerte oppløsning er kompatibel med analyse ved immunoassay, med et lavt organisk løsningsmiddelinnhold. En fremgangsmåte er beskrevet for ekstraksjon og pre-konsentrasjon av naturlig hormon 17β-østradiol i 100 ml vannprøver. Revers fase SPE er utført med oktadecyl-silika sorbent og eluering utføres med 200 ul metanol 50% volum / volum. Elueringsmiddel fortynnes ved tilsetning av di-vann for å redusere mengden av metanol. Etter fremstilling manuelt SPE-kolonne, er den generelle prosedyren utføres automatisk i løpet av 1 time. Ved slutten av prosessen, blir østradiol-konsentrasjonen måles ved anvendelse av et kommersielt enzymbundet immun-sorbent assay (ELISA). 100 gangers pre-konsentrasjon oppnås, og metanolinnholdet i bare 10% volum / volum. Full inngang på molekyleter oppnådd med 1 ng / L tilsatt avionisert og syntetisk sjøvann prøver.

Introduction

Prøveopparbeidelse er et viktig skritt i enhver analytisk prosess. Spesielt fjerning av matrise effekter, reduksjon av forstyrrelser, og anriking av analytten er nødvendig for å oppnå nøyaktige resultater og oppnå lave påvisningsgrenser. Hormonforstyrrende forbindelser (EDC) er av spesiell bekymring på grunn av deres virkning på levende organismer, selv når stede på svært lave nivåer i miljøet. Det naturlige hormonet 17β-østradiol er til stede på EUs vannforurensning Watch List og utsatt for å bli lagt til listen over prioriterte stoffer som er regulert i henhold til den europeiske vannrammedirektiv. Fastfase-ekstraksjon (SPE) blir vanligvis brukt for analyse av små forurensende stoffer i vann, med både kjemisk ^1-5 (kromatografi, massespektrometri) og immunologiske ^6-9 deteksjonsmetoder. Sistnevnte fikk interesse innen miljøovervåking, som immunanalyser er tilgjengelige i stort utvalg av formater, er spesifikke for TArget analytt, og når lave påvisningsgrenser. ^{6, 7, 10, 11} En rekke enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) er kommersielt tilgjengelige, og gjør det mulig å analysere flere prøver på en gang på en multi-brønn plate. Prosedyren består i påfølgende reaksjonstrinn som kan ta noen timer. Sluttproduktet av reaksjonen kan detekteres optisk for å bestemme konsentrasjonen av målmolekylet basert på en kalibreringskurve.

Klassiske SPE prosedyrer inkluderer sorbenten pre-kondisjonering, eksempel ekstraksjon, vasking, eluering og konsentrering ved avdamping av elueringsmiddelet. Løsningsmidlet som anvendes for fortynning av dette ekstraktet er valgt avhengig av påvisningsmetoden. For immunologiske metoder, mengden av organiske løsemidler, sterkt påvirker følsomheten av fremgangsmåten. ¹²

I tillegg til utvinning og pre-konsentrasjons forestillinger, må fremgangsmåten også være enkel og kostnadseffektivt. Automatisering av procedure bidrar til å redusere menneskerelaterte feil. I vårt tidligere arbeid ¹³ introduserte vi vår prototype for automatisert SPE, og vår metode ble brukt til analyse av det naturlige hormonet 17β-estradiol i sjøvannsprøver. Med dagens video ønsker vi å fremheve de tekniske fordelene med vår metode i forhold til tradisjonelle off-line og on-line SPE, og sin spesielle kompatibilitet med påvisning av immunreaksjoner. Vi beskriver protokollen anvendt på vannprøver for deteksjon av 17β-østradiol. SPE er utført med oktadecyl-silika (C18) sorbent fase og eluering blir utført med fortynnet metanol.

Protocol

Merk: Den følgende protokollen beskriver SPE utført på 100 ml vannprøve med C18 sorbent og eluering med 50% volum / volum metanol. Det anrikede prøven blir fortynnet for å nå 10% volum / volum metanol før analyse med en enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) kit. 1. Forberedelse av reagenser Forbered vannprøvene Før eventuell andre trinn, å filtrere hver 100 ml vannprøve med 0,2 um porestørrelse filter. Spike prøven med ønsket konsentrasjon ved…

Representative Results

Reproduserbarhet av sorbent pakking ble evaluert ved tørking og å vekte pipettert sorbent i glassflasker, og resultatet er vist i figur 1. Reproduserbarhet av injeksjonstidspunktet ble testet i 100 ml prøver, som vist i figur 2. Konsentrasjon i innledende og pre- konsentrert tilsatt prøvene ble bestemt ved anvendelse av et kommersielt ELISA-sett for 17β-østradiol, og er vist i figur 3.</str…

Discussion

En ny fremgangsmåte for fremstilling av vannprøver fulgt av analyse ved hjelp av immunologisk analyse ble foreslått. Instrumentet gjør det mulig å utføre fastfaseekstraksjon i en automatisert og brukervennlig måte.

Filtrering av vannprøven før dens injeksjon inn i systemet er kritisk. Eventuelle partikler som fremdeles er tilstede i løsningen ville forårsake tilstopping av fluidic nettverket og hindre SPE-kolonne. Et annet viktig trinn er fremstilling av SPE-kolonne. Mengden av pa…

Materials

Filter membrane 0.2 μm pore size	Merck Millipore	GNWP04700	For sample filtration
Nylon membrane 11 μm pore size	Merck Millipore	NY1104700	For SPE column
Disposable biopsy punch 5 mm	Medical Budget	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μm particle diameter
Synthetic sea water	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
Methanol	VWR
17beta-estradiol standard	Enzo Life Science		300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kit	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 wells, range 30 – 3000 ng/L