Introduction
Identifikationen af molekyler, der er forbundet med specifikke genomiske områder af interesse er nødvendig for at forstå mekanismerne for regulering af genomiske funktioner såsom transskription og epigenetisk regulering. Selv om der er udviklet flere teknikker til biokemisk analyse af specifikke genomiske regioner 1-7, er de ikke anvendes bredt på nuværende tidspunkt på grund af deres iboende problemer såsom begrænset anvendelse (f.eks kun for høj kopiantal loci eller loci med gentagelser) og for megen tid og indsats er påkrævet.
For at udføre biokemiske analyse af specifikke genomiske regioner let, har vi udviklet to locusspecifik chromatin immunopræcipitationsforsøg (chip) teknologi, nemlig indførelsesmutationen chip (iChIP) 8-13 og manipuleret DNA-bindende molekyle-medieret chip (enChIP) 14-17 . I iChIP, er et sted af interesse ved at indsætte tagget genkendelsessekvenser af en exogen DNA-bindende protein, såsom LexA. locus isoleres derefter ved affinitetsoprensning under anvendelse af mærkede DNA-bindende protein. I enChIP, manipulerede DNA-bindende molekyler, såsom zink-finger proteiner, transkriptionsaktivator-lignende (TAL) proteiner og grupperet regelmæssigt spatierede korte palindrome repeats (CRISPR) komplekser, der anvendes til at mærke et sted af interesse (Figur 1). Efterfølgende genomiske region isoleret ved affinitetsoprensning af mærkede DNA-bindende molekyler.
En af fordelene ved enChIP forhold iChIP er, at indsættelsen af genkendelsessekvenser af en exogen DNA-bindende protein er ikke nødvendig. Målretning af loci hjælp CRISPR komplekser bestående af en katalytisk inaktiv form for Cas9 (dCas9) og en vejledning RNA (gRNA) er meget lettere end målretning af disse regioner ved iChIP eller enChIP hjælp TAL og zink-finger proteiner. Her beskriver vi en trin-for-trin-protokol til enChIP kombineret med massespektrometri og RNA-sekventering (RNA-Seq) for at identificere locus-foreningted proteiner og RNA'er, henholdsvis.
Protocol
1. Design af Engineered DNA-bindende molekyler ERKENDER mållocuset
- For enChIP hjælp CRISPR komplekser, bruge CRISPRdirect webværktøjet (http://crispr.dbcls.jp) for at identificere kandidat gRNA målsekvenser i genomiske område af interesse beskrevet som tidligere 18. Dette web-værktøj returnerer 23 bp genomiske steder i formen 5'-N 20 NGG-3 «i målområdet.
- Syntetisere et gBlock herunder U6 promotorsekvensen og sekvensen af 5'-N 20 i 5'-N 20 NGG-3 'under anvendelse af kommercielle tjenester (se figur 2) 19,20. For subkloningsformål omfatte passende restriktionsenzymsteder uden for gBlock.
- Sæt gBlock i en passende vektor som tidligere beskrevet 16. Flere retrovirusvektorer for gBlocks er tilgængelige (se Materialer).
- For enChIP hjælp TAL proteiner, designe TAL proteiner genkender Target loci. Generer plasmider kodende TAL proteiner ved hjælp af kommercielle tjenester. Generere ekspressionsvektorer indeholdende Tal proteiner fusioneret med et eller flere mærker, såsom 3 × FLAG som tidligere beskrevet 15.
2. Etablering af celler til enChIP Analyse
- Hurtig 3 × FLAG-dCas9 og gRNA (CRISPR-baseret procedure) eller 3 × FLAG-TAL (TAL proteinbaseret procedure) i cellerne, der skal analyseres som beskrevet tidligere 14-17.
- Brug transient transfektion, hvis transfektionseffektiviteten er høj. En ekspressionsvektor indeholdende 3 × FLAG-dCas9 og CMV-promotoren er til rådighed (se Materialer).
- Overveje etablering af stabile transformanter under anvendelse af konventionelle metoder, hvis den transiente transfektionseffektivitet er lav. Ud over de førnævnte retrovirale vektorer for gBlock retrovirusvektorer af 3 × FLAG-dCas9 er tilgængelige (se Materialer).
- Bekræft ekspression af gRNA ved standard RT-PCR-teknik.
- Til kvantitativ identifikation af proteiner, der interagerer med det genomiske område af interesse, overveje anvendelse af en stabil isotop mærkning af aminosyrer i cellekultur (SILAC) analyse kombineret med enChIP (enChIP-SILAC).
Bemærk: Medier til SILAC analyse kan købes fra kommercielle leverandører. SILAC er magtfulde i at opdage specifikke interaktioner.- Dyrke celler i SILAC tunge medium. Forbered celler culturød SILAC lys mellemstore som en negativ kontrol. Brug mindst 5 × 10 7 celler for hver SILAC medium (tung eller let). Til effektiv mærkning, tilføje både L-lysin-2HCl, 13C 6 og L-Arginin-HCI, 13 C 6, 15 N 4 i SILAC Heavy medier. Bemærk: Mindst fem celledelinger er nødvendige for at mærke proteiner.
- For eksempel, kultur humane fibrosarcoma HT1080 celler, der stabilt udtrykker 3xFLAG-dCas9 og en gRNA ved 37 ° C og 5% CO2 i DMEM medier til SILAC og dialyseres føtalt bovint serum med lysin-2 HCI plus L-arginin-HCI (Light medium) eller 13 C6 L-lysin-2 HCI plus 13C 6 15 N 4 L-arginin-HCI (Heavy medium) (se Materialer) 16. Der tilsættes 50 mg af let eller tung L-lysin-2 HCI og L-arginin-HCI i 500 ml medium.
- Trypsinisér og udpladning celler, før de bliver sammenflydende, så cellerne opretholder eksponentiel growth.
- Dyrke celler i SILAC tunge medium. Forbered celler culturød SILAC lys mellemstore som en negativ kontrol. Brug mindst 5 × 10 7 celler for hver SILAC medium (tung eller let). Til effektiv mærkning, tilføje både L-lysin-2HCl, 13C 6 og L-Arginin-HCI, 13 C 6, 15 N 4 i SILAC Heavy medier. Bemærk: Mindst fem celledelinger er nødvendige for at mærke proteiner.
Bemærk: Ekspression af disse mærkede proteiner kan også bekræftes ved intracellulær farvning med anti-FLAG-FITC og en efterfølgende FACS-analyse. En protokol til intracellulær farvning kan downloades fra vores hjemmeside (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
3. Tværbinding Celler med formaldehyd
- For celler i suspension kultur, overførsel 2 × 10 7 celler, der udtrykker 3xFLAG-TAL proteiner eller 3xFLAG-dCas9 plus gRNA og suspendere i 30 ml regelmæssig dyrkningsmedium i et 50 ml centrifugerør. Når der anvendes flere celler, øge volumen og mængder af reagenser forholdsmæssigt. For SILAC eksperimenter, blandes cellerne dyrket i kraftig medium eller let medium (5 x 10 7 celler hver) og dividere det samlede på 1 x 10 8 celler i 5 rør indeholdende 2 x 10 7 celler.
- Tilføj 810 pi 37% formaldehyd til 30 ml af cellesuspensionen (slutkoncentration 1%) og inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter. For adhærente celler, direkte kan fastsætte celler i dyrkningsskåle ved tilsætning 810 pi 37% formaldehyd til 30 ml dyrkningsmedium.
- Stop tværbinding ved tilsætning af 3,1 ml af 1,25 M glycin-opløsning (slutkoncentration 127 mM), oginkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
- Indsamle cellerne ved centrifugering (300 x g i 5 minutter ved 4 ° C). Kassere forsigtigt supernatanten herunder formaldehyd og gemme det i en passende affald flaske.
- For adhærente celler, løsnes cellerne med en celleskraber og høst i et 50 ml rør, og indsamle celler som beskrevet i dette trin.
- For SILAC eksperimenter, blandes de løsnede celler dyrket i kraftig medium eller let medium (5 x 10 7 celler hver), opdele alt 1 x 10 8 celler i 5 rør indeholdende 2 x 10 7 celler, og indsamle celler som beskrevet i denne trin.
- Vask cellepelleten med 30 ml PBS to gange om røret. Kassere forsigtigt supernatanten herunder formaldehyd og gemme det i en passende affald bottle.Handle formaldehyd affald ifølge kemiske sikkerhedsretningslinjer. De fikserede celler kan fryses og opbevares ved -80 ° C.
4. Fremstilling af kromatin (per 2 x 107-celler)
- Suspendere fikserede celler i 10 ml cellelysebuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630, og 1 × proteasehæmmere) og inkuberes på is i 10 min.
- Centrifuger prøven (830 x g ved 4 ° C i 8 min) og supernatanten omhyggeligt.
- Suspender pellet i 10 ml nuklear lysepuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,5% lauroylsarcosin og 1x proteaseinhibitorer). Der inkuberes på is i 10 minutter og vortex hver 2-3 min.
- Centrifugeres prøven (830 × g ved 4 ° C i 8 min) og supernatanten omhyggeligt.
- Vask pelleten i 10 ml PBS. Pelleten (chromatin fraktion) kan opbevares ved -80 ° C efter omgående frysning i flydende nitrogen.
5. Sonikering af kromatin (per 2 x 10 7 celler)
- Suspender kromatin fraktion i 800 pimodificeret lysepuffer 3 (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS og 1x proteaseinhibitorer) og overføres til et 1,5 ml rør.
- Sonikeres kromatin ved hjælp af en sonikator (se Materialer), og følgende betingelser: udgang: 3; told: 100% (løbende); og tid: gratis. Udfør 10-18 cyklusser af sonikering i 10 sek og afkøling på is i 20 sekunder. For at undgå overophedning, inkuberes prøverne på is i 2 min hver 5-6 cykler. For at undgå skumning, holde positionen af spidsen af sonikeringssonde 0,5 cm over bunden af røret.
- Centrifuger prøven ved (16.000 x g ved 4 ° C i 10 minutter) og overføre supernatanten i et 1,5 ml rør. Den sonikeret kromatin kan opbevares ved -80 ° C efter omgående frysning i flydende nitrogen.
6. Evaluering af Chromatin Fragmentering
- Bland 10 pi af fragmenterede kromatin med 85 pi destilleret vand.
- Tilsæt 4 pi5 M NaCl og inkuberes ved 65 ° CO / N.
- Tilsæt 1 pi 10 mg / ml RNase A og inkuberes ved 37 ° C i 45 minutter.
- Tilsæt 2 pi 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 pi 1 M Tris (pH 6,8) og 1 pi 20 mg / ml proteinase K, og derefter inkuberes ved 45 ° C i 1,5 timer.
- Separate 10 pi af prøven ved elektroforese i en 1% agarosegel, der ikke indeholder farvning farvestoffer, såsom SYBR Green.
- Farv gelen at vurdere fordelingen af længder af fragmenterede kromatin. Betingelser, der genererer en gennemsnitlig længde på 0,5-2 kbp (række 0,2-4 kbp) anbefales.
- Oprensning af DNA fra de resterende prøver ved phenol-chloroform-ekstraktion eller ved anvendelse af et DNA-ekstraktionskit (se Materialer). Det oprensede DNA kan anvendes som input DNA for at anslå udbytterne af enChIP analyser (se 8.11).
7. Fremstilling af Dynabeads konjugeret med antistoffer (per 2 x 10 7 celler)
- Prepare to 1,5 ml rør, en for pre-clearing anvendelse af normalt muse-IgG og den anden til inkubation med anti-FLAG Ab. Tilsæt 150 pi protein G-konjugerede magnetiske perler (se Materialer) til hvert rør.
- Anbring glassene på en magnet stå og vente i 3 minutter. Supernatanten kasseres ved pipettering.
- Suspender perlerne i 1 ml PBS indeholdende 0,01% Tween-20 (PBS-T). Anbring glassene på et magnetisk stativ og vente 2 minutter. Kassér supernatanten ved pipettering, og derefter gentage trin.
- Suspender perlerne i 1 ml PBS-T indeholdende 0,1% BSA.
- Der tilsættes 15 ug normalt muse IgG eller anti-FLAG Ab og rotere ved 4 ° CO / N.
- Spin ned kortvarigt, og derefter placere rørene på en magnet stå og vente i 3 min. Supernatanten kasseres ved pipettering.
- Suspender perlerne i 1 ml PBS-T. Vend prøven flere gange og spin ned kortvarigt. Anbring glassene på en magnet stå og vente i 3 minutter, derefter kasseres supernatanten ved pipettering. Gentag vaskto gange med PBS-T (i alt tre vasketrin).
8. chromatin Immunpræcipitation (per 2 x 10 7 celler)
- Bland den fragmenterede chromatin fremstillet i 5.3) (ca. 800 pi) med en femtedel af volumenet (ca. 200 pi) af modificeret lyseringsbuffer 3 indeholdende 5% Triton X-100 (slutkoncentration på 1% Triton X-100).
- Tilsæt kromatin løsning på rør, hvori Protein G-konjugerede magnetiske perler konjugeret med normalt muse-IgG blev fremstillet. Rotere ved 4 ° C i 1 time.
- Glasset anbringes på en magnet stå og vente i 3 min.
- Overfør supernatanten i røret, hvor Protein G-konjugerede magnetiske perler konjugeret med anti-FLAG Ab blev fremstillet. Rotere ved 4 ° CO / N.
- Glasset anbringes på en magnet stå og vente i 3 min. Supernatanten kasseres ved pipettering.
- Suspender perlerne i 1 ml lavsaltpuffer (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS og 1 x proteaseinhibitorer) og rotere ved 4 ° C i 5 minutter. Glasset anbringes på en magnet stå og vente i 3 min. Supernatanten fjernes ved pipettering og gentag vasketrinnet.
- Vask perlerne med puffer med højt saltindhold (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS og 1 x proteaseinhibitorer) to gange.
- Vask perlerne med LiCI buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCI, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% natriumdeoxycholat og 1 x proteaseinhibitorer) to gange.
- Vask perlerne med TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris-(pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630 og 1 x proteaseinhibitorer) en gang.
- Suspender perlerne i 200 pi elueringspuffer (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630, 1x proteasehæmmere og 500 ug / ml 3 x FLAG-peptid) og inkuberes ved 37 ° C i 20 min. Glasset anbringes på en magnet stå og vente i 3 min. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml rør og gentag elution trin.
- Oprensning af DNA fra lille del (f.eks, 5%) af eluatet ved phenol-chloroform-ekstraktion eller ved anvendelse af et DNA-ekstraktionskit (se Materialer). Det oprensede DNA kan anvendes til PCR med specifikke primersæt til at estimere udbyttet af enChIP analyser ved at sammenligne med input DNA fremstillet i trin 6.7 som beskrevet tidligere 14,16.
9. SDS-PAGE, farvning og massespektrometrianalyse
- Bland eluatet (400 pi) med 1 ml 2-propanol, 50 pi 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 5 pi 20 mg / ml glycogen. Udfælde kromatin ved -20 ° CO / N.
- Centrifuger prøven (16.000 x g ved 4 ° C i 30 minutter), og supernatanten. Skyl pellet med 1 ml 70% ethanol og centrifugeres igen (16.000 x g ved 4 ° C i 10 minutter). Supernatanten fuldstændigt ved pipettering.
- Suspender pellet i 40 pi 2 x prøvebuffer (125 mM Tris (pH 6,8), 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% saccharose og 0,004% bromphenolblåt). Vortex i 5 minutter for at opløse pellet fuldstændigt, og derefter inkuberes ved 100 ° C i 30 minutter for at denaturere proteinerne og vende den tværbinding.
- For SDS-PAGE, køre 40 pi af prøven på gelen, indtil farvestoffet når 1 cm under brønden. Bemærk: Vi bruger normalt 4-20% gradient geler, men andre% geler kan anvendes.
- Farv gelen med Coomassie Brilliant Blue eller sølvfarvning.
- Skær gelen i fem stykker (2 mm højde).
- Udføre i gel-fordøjelse og massespektrometrianalyse som beskrevet tidligere 13-16.
- For SILAC eksperimenter med 5 x 10 7 celler hver (i alt 1 x 10 8 celler), suspendere pellet fra de første fem rør i 40 pi 2 x prøvebuffer (det er ikke nødvendigt at opskalere).
10. Oprensning af RNA og RNA-Seq Analyse
- At oprense RNA efter enChIP, tilsættes 5 U / ml RNase Inhibitor (see Materialer) til alle bufferopløsninger, undtagen modificeret lysisbuffer 3 og elueringsbufferen, hvortil tilsættes 40 U / ml RNase Inhibitor.
- Bland eluatet (400 pi) med 16 pi af 5 M NaCl og inkuberes ved 65 ° C i 2 timer.
- Der tilsættes 1 ml syre-guanidinium-phenol-baserede reagens (se Materialer) til prøven. Vortex for 15 sekunder og derefter inkuberes ved stuetemperatur i 5-15 min. Centrifuger prøven i 15 minutter ved 12.000 x g og RT.
- Supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml rør, og der tilsættes 5 pi p-bromanisol. Vortex for 15 sekunder og derefter inkuberes ved stuetemperatur i 3-5 min. Centrifuger prøven i 10 minutter ved 12.000 x g og RT.
- Overfør supernatanten (ca. 1 ml) i et nyt 2 ml rør, og der tilsættes 1 ml 2-propanol. Vend røret og inkuber ved stuetemperatur i 10 min. Læg blandingen på en kolonne i et RNA-oprensningskit (se Materialer). Centrifugeres søjlen i 1 min ved 12.000 × g og RT.
- Vasksøjlen med 400 pi RNA Wash Buffer i et RNA-oprensningskit (se Materialer).
- Der tilsættes 80 pi DNase I cocktail (blanding af 5 pi DNase I (1 U / pl), 8 pi 10 × DNase I Reaction Buffer, 3 pi DNase / RNase-frit vand, og 64 pi RNA Wash Buffer i et RNA-oprensningskit (se Materialer)) til søjlen. Prøven inkuberes ved 37 ° C i 15 minutter og centrifugeres i 30 sekunder ved 12.000 x g og RT.
- Vask søjlen med 400 pi RNA Forvask buffer i et RNA-oprensningskit (se Materialer) to gange.
- Eluering af RNA med 50 pi DNase / RNase-frit vand. Den eluerede RNA kan anvendes til RNA-sekventering.
Representative Results
Generelt kan 1-30% af target genomiske regioner oprenses ved anvendelse enChIP. Figur 3 omfatter repræsentative data, der viser udbyttet af enChIP analyser rettet mod telomerer og promotoren af interferon (IFN) regulatorisk faktor-1 (IRF-1) genet. Som eksempler på typiske resultater, Tabel 1 viser de proteiner associeret med IRF-1 promoter i en IFNy-specifik måde identificeret ved enChIP-SILAC, Tabel 2 viser telomer-bindende proteiner identificeret ved enChIP kombineret med massespektrometri (enChIP-MS) , og tabel 3 viser de RNA forbundet med telomerer identificeret af enChIP-RNA-Seq.
Figur 1. Oversigt over enChIP. enChIP hjælp CRISPR (A, B) og TAL (C, D, E Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Sekvens af gBlock. U6 promotor (i sort), G nukleotid bør guiden sekvens (i blåt), er den vejledning sekvens (gRNA spacer) (i rødt), stilladset sekvens (i grønt), og terminatorsekvensen (i orange) vist.
Figur 3. Udbytter af en repræsentant enChIP analyser. (A) Procent indgange til mål IRF-1 locus og den ikke-mål Sox2 locus. (B) Procent indgange til målet telomerer og uden for målgruppen y-satellitter. Tallene er tilpasset og modificeret fra tidligere udgivelser 15,16.
| Kategorier | Proteiner |
| Transskription | DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homolog, PURβ, aktiveret RNA-polymerase II transskriptionsaktivator p15, BTF3, Myb-bindendeprotein 1A |
| Histondeacetylering, co-repressorkomplekset komponenter | RBBP4, PA2G4, TBL3 |
| Acetyltransferase | Protein arginin N-methyltransferase 1 |
| DNA-topoisomerase | DNA topoisomerase 2α |
| Histoner | Histone H2A.Z, histon H3.2 |
Tabel 1:. Eksempler på proteiner forbundet med den menneskelige IRF-1 promotor-regionen i et IFNy-specifik måde identificeret af enChIP-SILAC Tabellen er blevet tilpasset fra en tidligere publikation 16.
| Kategorier | Proteiner |
| Pattedyr telomer-bindende proteiner | PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 |
| Telomer-binde proteiner i gær eller andre organismer | Imp4 |
| Proteiner, der interagerer med telomer-bindende proteiner [forbundet telomer-bindende protein] | DNA-polymerase α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1], exportin-5 [TERT], GNL3L [TRF1], exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT] |
| Proteiner lokalisering til heterochromatin | BEND3 |
| Proteiner regulerer epigenetiske mærker | KDM5C |
| Proteiner, hvis mutationer påvirker telomer funktion | DNA-polymerase α (POLA1), HAT1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, glutamat-cystein-ligase, glutaredoxin, SMRC1 |
Tabel 2:. Eksempler på proteiner forbundet med musen telomerer identificeret af enChIP-MS Tabellen har været adapted fra en tidligere publikation 15.
| Kategorier | RNA |
| Telomerase komponenter | Tert, rMRP |
| Telomerisk RNA'er | Terras |
| scaRNAs | Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 |
| H / ACA snoRNAs | Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a |
| C / D snoRNAs | Snord17, Snord15a, Snord118 |
| lncRNA | Neat1 |
Tabel 3: Eksempler på RNA'er forbundet med musen telomerer identificeret af enChIP-RNA-Seq Tabellen er blevet tilpasset fra en tidligere publikation 17..
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Takeda Science Foundation (TF); Asahi Glass Foundation; den Uehara Mindefond (HF); den Kurata Memorial Hitachi Videnskab og Teknologi Foundation (TF og HF); Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) (# 25830131), Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (C) (# 15K06895) (TF); og en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning om innovative områder 'transskription Cycle "(# 25118512 & # 15H01354), Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (B) (# 15H04329), Grant-in-Støtte til sonderende forskning ( # 26650059) og "genom Support" (# 221S0002) (HF) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gBlock synthesis service | Life Technologies | Gene Synthesis by GeneArt | |
| gBlock synthesis service | IDT (Integrated DNA Technologies) | gBlocks Gene Fragments | |
| pSIR-neo | Addgene | 51128 | |
| pSIR-GFP | Addgene | 51134 | |
| pSIR-DsRed-Express2 | Addgene | 51135 | |
| pSIR-hCD2 | Addgene | 51143 | |
| TAL synthesis service | Life Technologies | GeneArt Precision TALs | |
| 3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 | Addgene | 47948 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-puro | Addgene | 51240 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-IG | Addgene | 51258 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 | Addgene | 51259 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-neo | Addgene | 51260 | |
| anti-FLAG M2 Ab | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| FITC-conjugated anti-FLAG M2 | Sigma-Aldrich | F4049 | |
| DMEM medium for SILAC | Life Technologies | 89985 | Other medium can be purchased from Life Technologies |
| Dialyzed FBS for SILAC | Life Technologies | 89986 | |
| L-Lysine-2HCl for SILAC | Life Technologies | 89987 | For Light medium |
| L-Arginine-HCl for SILAC | Life Technologies | 89989 | For Light medium |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Life Technologies | 89988 | For Heavy medium |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Life Technologies | 89990 | For Heavy medium |
| Complete, mini, EDTA-free | Roche Diagnostics | 4693159 | |
| Ultrasonic Disruptor UD-201 | Tomy Seiko | ||
| ChIP DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D5205 | |
| Dynabeads-Protein G | Life Technologies | DB10004 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Isogen II | Nippon Gene | 311-07361 | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| nanoLC | Advance, Michrom Bioresources | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| HTC-PAL autosampler | CTC Analytics | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis |
References
- Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
- Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
- Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
- Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
- Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
- Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
- Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109 (2011).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
- Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273 (2013).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26 (2014).
- Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
- Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171 (2013).
- Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084 (2014).
- Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387 (2015).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. , (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
- Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
- Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213 (2014).
- O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
- de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).
