Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Genom-dækkende Kortlægning af lægemiddel-DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tværbinding af små molekyler til at isolere Chromatin)

Published: January 20, 2016 doi: 10.3791/53510
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1, 1,4
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center, University of Wisconsin–Madison

Summary

Identificere de direkte mål for genom-targeting molekyler stadig en stor udfordring. For at forstå hvordan DNA-bindende molekyler engagere genomet, vi udviklet en metode, der bygger på krydsbinding af små molekyler til at isolere kromatin (COSMIC).

Abstract

Genomet er målet for nogle af de mest effektive kemoterapeutiske midler, men de fleste af disse lægemidler mangler DNA-sekvens specificitet, hvilket fører til dosisbegrænsende toksicitet og mange uønskede bivirkninger. Målretning genomet med sekvens-specifikke små molekyler kan gøre det muligt molekyler med øget terapeutisk indeks og færre off-target effekter. N -methylpyrrole / N -methylimidazol polyamider er molekyler, der kan rationelt designet til at målrette specifikke DNA-sekvenser med udsøgt præcision. Og i modsætning til de fleste naturlige transkriptionsfaktorer, kan polyamider binde sig til methylerede og chromatinized DNA uden tab i affinitet. Sekvensen specificitet polyamider er blevet grundigt undersøgt in vitro med beslægtede sted identifikation (CSI) og med traditionelle biokemiske og biofysiske metoder, men studiet af polyamid binding til genomiske mål i celler stadig vanskeligt at definere. Her rapporterer vi en fremgangsmåde til tværbinding af små molekyler isolate kromatin (COSMIC), der identificerer polyamid bindende websteder på tværs af genomet. COSMIC ligner chromatin immunoprecipitation (chip), men adskiller sig ved to vigtige måder: (1) en fototværbindende anvendes til at aktivere selektiv, tidsmæssigt styret indfangning af polyamid bindende begivenheder og (2) biotin affinitetshåndtag anvendes til at oprense polyamid -DNA-konjugater under semi-denaturerende betingelser for at mindske DNA, som er ikke-kovalent bundet. COSMIC er en generel strategi, som kan anvendes til at afsløre de genom-dækkende bindende begivenheder af polyamider og andre genom-targeting kemoterapeutiske midler.

Introduction

De oplysninger, der gør hver celle i den menneskelige krop er indkodet i DNA. Den selektive brug af denne information styrer skæbne af en celle. Transkriptionsfaktorer (TFS) er proteiner, der binder til specifikke DNA-sekvenser til at udtrykke en bestemt delmængde af gener i genomet, og fejlfunktion af TF'er er knyttet til indtræden af ​​en bred vifte af sygdomme, herunder udviklingsmæssige defekter, cancer og diabetes . 1,2 Vi har været interesseret i at udvikle molekyler, der selektivt kan binde til genomet og modulerer gen regulatoriske netværk.

Polyamider sammensat af N -methylpyrrole og N methylimidazol er rationelt designet molekyler, der kan målrette DNA med særlige og affiniteter, som konkurrerende naturlige transskriptionsfaktorer. 3-6 Disse molekyler binder til specifikke sekvenser i minor groove i DNA. 4,5,7 -11 Polyamider er blevet anvendt til både at undertrykke og aktivere ekspression af specifikke gEnes. 4,12-19 De har også interessante antivirale 20-24 og anticancer 12,13,25-30 egenskaber. Et attraktivt element i polyamider er deres evne til at få adgang DNA-sekvenser, der er methylerede 31,32 og viklet rundt histon proteiner 9,10,33.

Til måling af omfattende bindingsspecificiteter DNA-bindende molekyler, vores laboratorium skabte beslægtede sted identifikator (CSI) metode. 34-39 Den forudsagte forekomst af bindingssteder baseret på in vitro særegenheder (genomescapes) kan vises på genomet, fordi In vitro-binding intensiteter er direkte proportional med associationskonstanter (K a). 34,35,37 Disse genomescapes give indsigt i polyamid belægning på tværs af genomet, men måling af polyamid bindende i levende celler har været en udfordring. DNA er tæt pakket i kernen, hvilket kunne påvirke tilgængeligheden af ​​bindingssteder. A'etccessibility af disse chromatinized DNA-sekvenser til polyamider forbliver et mysterium.

For nylig, at mange metoder studere samspillet mellem små molekyler og nukleinsyrer er opstået. 40-48 Den affinitet opsamling og massivt-parallel DNA-sekventering (Chem-seq) er en sådan teknik. Chem-seq bruger formaldehyd til tværbinding små molekyler til et genomisk mål af interesse og et biotinyleret derivat af et lille molekyle af interesse til at fange den ligand-target interaktion. 48,49

Formaldehyd tværbinding fører til indirekte vekselvirkninger, der kan producere falske positiver. 50 Vi har udviklet en ny metode, tværbindingen af små molekyler til at isolere kromatin (COSMIC), 51 med en fototværbindende at fjerne disse såkaldte "phantom" toppe. 50 Til at begynde, vi designet og syntetiseret trifunktionelle derivater af polyamider. Disse molekyler indeholdt en DNA-bindende polyamide, en fototværbindende (psoralen), og en affinitet håndtaget (biotin, figur 1). Med trifunktionelle polyamider, kan vi kovalent fange polyamid-DNA interaktioner med 365 nm UV-bestråling, en bølgelængde, der ikke beskadiger DNA eller inducerer ikke-psoralen-baseret tværbinding. 51 Dernæst vi fragmentere genom og oprense det indfangede DNA under stringente, semi -denaturing betingelser for at mindske DNA, som er ikke-kovalent bundet. Således har vi vist COSMIC som en metode relateret til Chem-seq, men med en mere direkte udlæsning af DNA målretning. Vigtigere er det, svag (K 10 3 -10 4 M -1) affiniteten af psoralen til DNA ikke påviseligt indvirkning polyamid specificitet. 51,52 Den berigede DNA-fragmenter kan analyseres ved enten kvantitativ polymerase kædereaktion 51 (COSMIC-qPCR) eller ved næste generation sekventering 53 (COSMIC-seq). Disse data gør det muligt en fordomsfri, genom-styrede udformning af ligander, interhandle med deres ønskede genomiske loci og minimere ikke-tilsigtede virkninger.

Figur 1
Figur 1. Bioaktive polyamider og COSMIC ordning. (A) Hairpin polyamider 1 - 2 ud target DNA-sekvensen 5'-WACGTW-3 '. Lineære polyamider 3-4 mål 5'-AAGAAGAAG-3 '. Ringe af N-methylimidazol er fed skrift for klarhed. Åbne og udfyldte cirkler repræsenterer N -methylpyrrole og N methylimidazol, henholdsvis. Square repræsenterer 3-chlorthiophen og diamanter repræsenterer β-alanin. Psoralen og biotin er betegnet med P og B, hhv. (B) COSMIC ordning. Cellerne behandles med trifunktionelle derivater af polyamider. Efter tværbinding med 365 nm UV-bestråling, celler er lysed og genomisk DNA forskydes. Streptavidin-coatede magnetiske perler tilsættes til at indfange polyamid-DNA-addukter. DNA er frigivet og kan analyseres ved kvantitativ PCR (qPCR) eller ved næste generation sekventering (NGS). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tværbinding i levende celler

  1. Begynd med ~ 2.5x10 7 H1 celler eller andre dyrkede celler.
    BEMÆRK: Denne række H1 celler svarer til fem 10-cm retter (ca. 40% konfluens).
  2. Grow celler i E8 medier på retter overtrukket på en overflade, der understøtter pluripotente stamceller (se Materialer List) og inkubere dem ved 37 ° C i fugtig atmosfære af 5% CO2. Harvest celler enzymatisk (se Materialer List). Bemærk: Lad ikke H1 celler at overstige 90% konfluens; konfluens inducerer spontan differentiering af H1-celler. At tælle celler, vokser en ekstra 10 cm skål af celler, løft cellerne enzymatisk som beskrevet i afsnit 1.8-1.10, og tælle dem med et hæmocytometer.
    1. Forbered E8 kulturmedier som beskrevet i Chen et al. 54
  3. Før tilsætning af polyamid, fjernes det brugte dyrkningsmedier med en Pasteur-pipette fastgjort til et vakuum fælde. Tilføj frisk medium med såerological pipette og pipette dispenser (8 ml pr 10 cm skål).
    BEMÆRK: Læg medierne til den side af skålen for at undgå at forstyrre cellerne. Fra dette punkt og fremefter beskytte cellerne mod lys at undgå for tidlig foto-tværbinding.
  4. Tilføj polyamid med en pipette (8 pi 400 pM polyamid i DMSO, 400 nM slutkoncentration) direkte til dyrkningsmediet af hver skål. Swirl skålen at sprede polyamidet jævnt i medierne.
    BEMÆRK: Koncentration kan varieres, men sikre, at ingen cellulær toksicitet observeres for den valgte behandling.
  5. Inkubér cellerne 24 timer 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2, og sikre, at de er beskyttet mod lys.
    BEMÆRK: Inkubationstiden kan varieres for at måle polyamid binding på tværs af tid.
  6. Vask hver 10 cm skål med 4 ml PBS (1,05 mM monobasisk kaliumphosphat, 155,17 mM natriumchlorid, 2,97 mM natriumfosfat dibasisk) under anvendelse af en serologisk pipette og pipette disPenser. Aspirer PBS, og der tilsættes 3 ml E8 dyrkningsmedier.
  7. Med lysene nedtonet, fjerne låget af 5 kulturskåle og placere cellerne på en flad overflade uden for hætten. Placer en glasfilter over de 5 kulturskåle at bortfiltrere lys med λ <300 nm. Placer UV-kilden oven på filteret. Tværbinde prøver 30 min med 365 nm UV-bestråling (2,4 mW / cm2).
    BEMÆRK: Tværbindende tid skal bestemmes empirisk.
  8. Transfer dyrkningsskålene tilbage til hætten. Aspirer medier med en Pasteur-pipette fastgjort til et vakuum fælde. Vask hver 10 cm skål med 4 ml PBS. Aspirere PBS. Tilsæt 3 ml enzym til cellen dissociation (se Materialer List) pr 10-cm skål til at dissociere cellerne. Inkuber 5 min ved 37 ° C.
    BEMÆRK: Brug ikke pre-varme enzymet.
  9. Stands enzymet med 3 ml E8 media per skål. Overførsel dissocierede celler i en 15 ml konisk rør.
    BEMÆRK: Placer celler på is fra dette punkt og fremefter.
  10. Centrifuge dissocierede celler 5 min, 500 x g ved 4 ° C. Aspirer supernatanten for at fjerne enzym og medier.
    BEMÆRK: Pause punkt. Celler kan være lynfrosset i flydende nitrogen, opbevaret ved -80 ° C til efterfølgende bearbejdning på et senere tidspunkt.

2. Isolering af Chromatin

  1. Tilsæt 1,2 ml COSMIC buffer (20 mM Tris-HCI [pH 8,1], 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton-X100, 0,1% SDS) og pipette op og ned flere gange for at resuspendere cellepelleten i hver prøve i 1,2 ml COSMIC buffer.
    1. Tilføj 133 pi af hver af 100 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 100 mM benzamidin, og 150 uM pepstatin proteaseinhibitorer friske til en slutkoncentration på 1 mM PMSF og for benzamidin og 1,5 uM for pepstatin. Split opløsning af cellelysat i to amber 1,7 ml mikrocentrifugerør.
  2. Soniker med sonikator 35 min (10 sek på, 10 sek slukket, 60% effekt) at fragmentere genomet til mellem 100ND 500 bp.
    1. Holde niveauet af kromatin løsning i mikrocentrifugerør parallelt med niveauet af vand i reservoiret. Bekræft dette niveau ved visuel inspektion.
      BEMÆRK:. Bekræft, at DNA blev klippet med en 1,5% agarosegel 55
    2. Optimer sonication tid empirisk. Brug en minimal mængde is i reservoiret til nedkøling af prøverne og sikre isen ikke blande sig mellem prøverne og koppen horn.
  3. Centrifuger prøven 12.000 xg 10 min. Gem den vandige opløsning, som indeholder opløselige kromatin ved at overføre den til en ny ravgul mikrocentrifugerør med en pipette. Kassér pellet.
  4. Overfør 110 pi (10%) af prøven til et nyt mikrocentrifugerør, og mærke det Input DNA. Opbevar ved -80 ° C. Gemme resten af ​​kromatin prøven på is til anvendelse i trin 3.3.

3. Opsamling af ligand-DNA-krydsbindinger

  1. Brug en pipette til at dispensere 60 pi streptavidin-coatede magnetiske perler i et mikrocentrifugerør. Der tilsættes 1 ml COSMIC buffer og bland på en nutator 5 minutter ved stuetemperatur. Placer magnetiske perler på magnetisk separation rack 2 min at fange perlerne. Fjern COSMIC puffer med en pipette.
    BEMÆRK: Lad ikke perlerne til at tørre ud. Fortsæt straks til næste trin.
  2. Tilføj kromatin prøve (~ 1 ml) til perler (60 pi) og resuspender perlerne. Inkuber kromatin med streptavidin-coatede magnetiske perler mindst 4 timer på en roterende, vippende blander ved 4 ° C. Inkuber prøverne O / N, hvis det ønskes.

4. Isolering af Affinitetsrenset DNA

  1. Vask perler med 7 min interval ved stuetemperatur med følgende vaskebuffere at fjerne ikke-specifikke interaktioner. Brug en magnetisk separation rack til at indfange perler efter hver vask. Resuspendere perlerne efter hver ændring i vaskebuffer.
  2. Forbered vaskebuffere i destilleret deioniseret vand og filtreres (0,2 um) inden brug. Store vaskebuffere 1 og 2 ved 4 ° C for several måneder. Forbered vaskebuffer 3 frisk hver dag. Tilføj og fjern vaske buffere fra prøven med en pipette. Til 2 og 4, tilsættes 1 og 3 (5 mM) i henholdsvis vaskene. Prøver kan yderligere vasket to gange med COSMIC buffer (en gang 12 timer, når 4 timer) forud for vask angivet nedenfor.
    1. Der vaskes én gang med vaskebuffer 1 (10 mM Tris-CI [pH 8,0], 1 mM EDTA, 3% SDS). Der vaskes én gang med vaskebuffer 2 (10 mM Tris-CI [pH 8,0], 250 mM LiCI, 1 mM EDTA, 0,5% NP40, 1% natriumdeoxycholat). Vask to gange med vaskebuffer 3 (4 M urinstof, 10 mM Tris-CI [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,1% NP-40). Vask to gange med Tris EDTA (TE) buffer (10 mM Tris-CI [pH 8,0], 1 mM EDTA).
  3. Resuspendere perlerne i 200 pi TE-buffer med en pipette. Denne prøve af indfanget DNA er benævnt affinitetsrenset (AP) DNA.
  4. Supplement Input og AP DNA med 10x Crosslink Tilbageførsel Buffer (100 mM Tris-CI [pH 8,0], 1 M KOH, 4 mMEDTA) til 1x slutkoncentration. 56,57 Inkuber 30 minutter ved 90 ° C.
    BEMÆRK: 254 nm UV-bestråling kan også anvendes til at vende psoralen krydsbinding, 58 men cyclobutyl pyrimidin dimerer kan dannes ud fra bestråling ved denne bølgelængde og forstyrre nedstrøms behandling af DNA.
  5. For AP-DNA, placere mikrocentrifugerør med prøven på magnetisk separation rack 2 minutter ved stuetemperatur og isolere væske (DNA) med en pipette. Overfør AP DNA (som er blevet frigjort fra perlerne) til en ny rav mikrocentrifugerør.
    BEMÆRK: Den ønskede AP DNA i væsken, ikke længere knyttet til perlerne.
  6. Neutralisere Input og AP DNA med koncentreret HCI til pH 7 ved tilsætning af ca. 1 pi 6 N HCI pr 100 pi prøve med en pipette. Bekræft prøverne neutraliseret ved tilsætning af ~ 0,5 pi på pH-papir med en pipette ADVARSEL:. Koncentreret HCI er en stærk ætsende syre. Håndtag i henhold til din institution217; s retningslinjer for egnede personlige værnemidler.
  7. Tilføj RNase A (100 mg / ml) til 0,2 pg / pl slutkoncentration på både input og AP DNA. Inkuber 1 time ved 37 ° C. Tilføj proteinase K (20 mg / ml) til 0,2 pg / pl slutkoncentration på både input og AP DNA tilsættes. Inkuber 1 time ved 55 ° C.
  8. Oprense DNA med et DNA-kolonne oprydning kit (se Materialer List). 55 Eluer DNA i 58 pi DNA-grade H 2 O. Opbevar Input og AP prøver ved -20 eller -80 ° C
  9. Analyser AP DNA ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) med locusspecifikke primere, og / eller ved næste generation sekventering. For qPCR Anvend 2 pi AP DNA pr locus med følgende parametre: 1 cyklus ved 95 ° C 10 minutter og 40 cyklusser af 95 ° C 20 sek, 54 ° C eller 56 ° C 20 sek, 72 ° C 40 sek.
    BEMÆRK: Anneleringstemperaturen bør ændres i overensstemmelse med smeltetemperaturen af ​​primerparrene anvendes. Vælg en udglødning tempere, der minimerer kvantificering cyklus uden uspecifik amplifikation.
    BEMÆRK: Til analyse af næste generation sekventering, sigter mod mindst 10 millioner kortlagt læser. Antallet af kortlagt læser kan øges ved at øge mængden af ​​AP-DNA og ved at kombinere færre prøver i en køre til sekventering. Mere læser forbedre følsomheden. Standard pakker til chip-seq analyse (f.eks Homer, 59 MACS, 60 og SPP 61) arbejder med COSMIC-seq data. Som med andre metoder, der er afhængige på næste generation sekventering, herunder genom sekventering og chip-seq, repetitive regioner skaber uklarheder i tilpasning og samling og dermed fortsat være en teknisk udfordring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at tage højde for uensartet genom fragmentering og andre variabler, skal det oprensede DNA altid normaliseres mod en reference Input DNA. Primere specifikke for et locus af interesse, kan anvendes. Det er nyttigt at også analysere et locus hvor molekylet ikke forventes at binde, som en negativ kontrol. Vi ser en> 100-fold stigning i polyamid belægning ved bestråling med 365-nm lys (figur 2).

Beriget DNA kan også analyseres ved næste generation sekventering. DNA fremstilles til sekventering på samme måde som chip DNA fremstilles (f.eks med en kommerciel prøve prep kit, se Materialer List). Selv med næste generation sekventering, vi stadig bruge qPCR at bekræfte berigelse af DNA ved loci, hvor vi forventer, at polyamid at være bundet. Når sekventeret, rå DNA læser er rettet til genomet og tæthed spor fremstilles med samme software designet til at analysere Chip-seq data (Figur 3). Based på vores analyse af polyamid distributioner i celler, fandt vi, at grupperet bindingssteder, der spænder over en bred vifte af tilhørsforhold, bedste forudsige belægningsprocent i celler. Vi udviklede en algoritme til at score hele genomet for binding med vores in vitro CSI data (figur 4A). Denne fremgangsmåde er helt viste, at forskellige genomiske loci med lignende forudsagte bindende scores udviser de forskellige gruppering af flere steder af varierende affiniteter (figur 4B).

Figur 2
Figur 2. Resultater af COSMIC-qPCR. Effekt af 365 nm UV-bestråling på den del af AP / input fra HEK293 celler. AP, affinitetsoprenset. Resultaterne er afbildet på logaritmisk skala og repræsenterer middelværdi ± sem

Figur 3
Figur 3. Resultater af COSMIC-seq i H1 celler. COSMIC-seq tag tæthed spor for lineære polyamid 4 designet til at målrette AAG gentagelser. Tag tæthed blev normaliseret til 10 7 tags og vises med det integrerede Genome Viewer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Model af polyamid bindende. (A) Violin plots af forudsagte score til 2 og 4 binding på tværs af hele genomet. Repræsentative genomescapes til 4 er også vist. Med bioinformatiske scoring anvendte metode kan genomiske loci opsummere samme forudsagte score på forskellige måder. (B) Loci med flere lav- og medium affinitet sekvenser show svarer polyamid belægning til loci med få høj affinitet sekvenser. Genoptrykt med tilladelse. 51 Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-ml conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
  2. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet. 10, 252-263 (2009).
  3. Meier, J. L., Yu, A. S., Korf, I., Segal, D. J., Dervan, P. B. Guiding the Design of Synthetic DNA-Binding Molecules with Massively Parallel Sequencing. J. Am. Chem. Soc. 134, 17814-17822 (2012).
  4. Dervan, P. B. Molecular recognition of DNA by small molecules. Bioorg. Med. Chem. 9, 2215-2235 (2001).
  5. Wemmer, D. E., Dervan, P. B. Targeting the minor groove of DNA. Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 355-361 (1997).
  6. Eguchi, A., Lee, G. O., Wan, F., Erwin, G. S., Ansari, A. Z. Controlling gene networks and cell fate with precision-targeted DNA-binding proteins and small-molecule-based genome readers. Biochem. J. 462, 397-413 (2014).
  7. Mrksich, M., et al. Antiparallel side-by-side dimeric motif for sequence-specific recognition in the minor groove of DNA by the designed peptide 1-methylimidazole-2-carboxamide netropsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7586-7590 (1992).
  8. Edayathumangalam, R. S., Weyermann, P., Gottesfeld, J. M., Dervan, P. B., Luger, K. Molecular recognition of the nucleosomal "supergroove". Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 6864-6869 (2004).
  9. Suto, R. K., et al. Crystal structures of nucleosome core particles in complex with minor groove DNA-binding ligands. J. Mol. Biol. 326, 371-380 (2003).
  10. Gottesfeld, J. M., et al. Sequence-specific Recognition of DNA in the Nucleosome by Pyrrole-Imidazole Polyamides. J. Mol. Biol. 309, 615-629 (2001).
  11. Chenoweth, D. M., Dervan, P. B. Structural Basis for Cyclic Py-Im Polyamide Allosteric Inhibition of Nuclear Receptor Binding. J. Am. Chem. Soc. 132, 14521-14529 (2010).
  12. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-κB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 1023-1028 (2012).
  13. Yang, F., et al. Antitumor activity of a pyrrole-imidazole polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1863-1868 (2013).
  14. Mapp, A. K., Ansari, A. Z., Ptashne, M., Dervan, P. B. Activation of gene expression by small molecule transcription factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3930-3935 (2000).
  15. Ansari, A. Z., Mapp, A. K., Nguyen, D. H., Dervan, P. B., Ptashne, M. Towards a minimal motif for artificial transcriptional activators. Chem. Biol. 8, 583-592 (2001).
  16. Arora, P. S., Ansari, A. Z., Best, T. P., Ptashne, M., Dervan, P. B. Design of artificial transcriptional activators with rigid poly-L-proline linkers. J. Am. Chem. Soc. 124, 13067-13071 (2002).
  17. Nickols, N. G., Jacobs, C. S., Farkas, M. E., Dervan, P. B. Modulating Hypoxia-Inducible Transcription by Disrupting the HIF-1–DNA Interface. ACS Chemical Biology. 2, 561-571 (2007).
  18. Pandian, G. N., et al. A synthetic small molecule for rapid induction of multiple pluripotency genes in mouse embryonic fibroblasts. Sci. Rep. 2, 544 (2012).
  19. Pandian, G. N., et al. Synthetic Small Molecules for Epigenetic Activation of Pluripotency Genes in Mouse Embryonic Fibroblasts. Chem Bio Chem. 12, 2822-2828 (2011).
  20. He, G., et al. Binding studies of a large antiviral polyamide to a natural HPV sequence. Biochimie. 102, 83-91 (2014).
  21. Edwards, T. G., Vidmar, T. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. DNA Damage Repair Genes Controlling Human Papillomavirus (HPV) Episome Levels under Conditions of Stability and Extreme Instability. PLoS ONE. 8, e75406 (2013).
  22. Edwards, T. G., Helmus, M. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. HPV Episome Stability is Reduced by Aphidicolin and Controlled by DNA Damage Response Pathways. Journal of Virology. , (2013).
  23. Edwards, T. G., et al. HPV episome levels are potently decreased by pyrrole-imidazole polyamides. Antiviral Res. 91, 177-186 (2011).
  24. Dickinson, L. A., et al. Inhibition of RNA polymerase II transcription in human cells by synthetic DNA-binding ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12890-12895 (1998).
  25. Dickinson, L. A., et al. Arresting Cancer Proliferation by Small-Molecule Gene Regulation. Chem. Biol. 11, 1583-1594 (2004).
  26. Nickols, N. G., et al. Activity of a Py–Im Polyamide Targeted to the Estrogen Response Element. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 675-684 (2013).
  27. Raskatov, J. A., Puckett, J. W., Dervan, P. B. A C-14 labeled Py–Im polyamide localizes to a subcutaneous prostate cancer tumor. Bioorg. Med. Chem. 22, 4371-4375 (2014).
  28. Jespersen, C., et al. Chromatin structure determines accessibility of a hairpin polyamide–chlorambucil conjugate at histone H4 genes in pancreatic cancer cells. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4068-4071 (2012).
  29. Chou, C. J., et al. Small molecules targeting histone H4 as potential therapeutics for chronic myelogenous leukemia. Molecular Cancer Therapeutics. 7, 769-778 (2008).
  30. Nickols, N. G., Dervan, P. B. Suppression of androgen receptor-mediated gene expression by a sequence-specific DNA-binding polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 10418-10423 (2007).
  31. Minoshima, M., Bando, T., Sasaki, S., Fujimoto, J., Sugiyama, H. Pyrrole-imidazole hairpin polyamides with high affinity at 5CGCG3 DNA sequence; influence of cytosine methylation on binding. Nucleic Acids Res. 36, 2889-2894 (2008).
  32. Warren, C. L., et al. Fabrication of duplex DNA microarrays incorporating methyl-5-cytosine. Lab on a Chip. 12, 376-380 (2012).
  33. Dudouet, B., et al. Accessibility of nuclear chromatin by DNA binding polyamides. Chem. Biol. 10, 859-867 (2003).
  34. Carlson, C. D., et al. Specificity landscapes of DNA binding molecules elucidate biological function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4544-4549 (2010).
  35. Warren, C. L., et al. Defining the sequence-recognition profile of DNA-binding molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 867-872 (2006).
  36. Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. Chapter One - Sequence-Specificity and Energy Landscapes of DNA-Binding Molecules. Methods Enzymol. Voigt, C. 497, Academic Press. 3-30 (2011).
  37. Puckett, J. W., et al. Quantitative microarray profiling of DNA-binding molecules. J. Am. Chem. Soc. 129, 12310-12319 (2007).
  38. Keles, S., Warren, C. L., Carlson, C. D., Ansari, A. Z. CSI-Tree: a regression tree approach for modeling binding properties of DNA-binding molecules based on cognate site identification (CSI) data. Nucleic Acids Res. 36, 3171-3184 (2008).
  39. Hauschild, K. E., Stover, J. S., Boger, D. L., Ansari, A. Z. CSI-FID: High throughput label-free detection of DNA binding molecules. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 3779-3782 (2009).
  40. Lee, M., Roldan, M. C., Haskell, M. K., McAdam, S. R., Hartley, J. A. In vitro Photoinduced Cytotoxicity and DNA Binding Properties of Psoralen and Coumarin Conjugates of Netropsin Analogs: DNA Sequence-Directed Alkylation and Cross-Link. 37, 1208-1213 (1994).
  41. Wurtz, N. R., Dervan, P. B. Sequence specific alkylation of DNA by hairpin pyrrole–imidazole polyamide conjugates. Chem. Biol. 7, 153-161 (2000).
  42. Tung, S. -Y., Hong, J. -Y., Walz, T., Moazed, D., Liou, G. -G. Chromatin affinity-precipitation using a small metabolic molecule: its application to analysis of O-acetyl-ADP-ribose. Cell. Mol. Life Sci. 69, 641-650 (2012).
  43. Rodriguez, R., Miller, K. M. Unravelling the genomic targets of small molecules using high-throughput sequencing. Nat Rev Genet. 15, 783-796 (2014).
  44. Guan, L., Disney, M. D. Covalent Small-Molecule–RNA Complex Formation Enables Cellular Profiling of Small-Molecule–RNA Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10010-10013 (2013).
  45. White, J. D., et al. Picazoplatin, an Azide-Containing Platinum(II) Derivative for Target Analysis by Click Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 135, 11680-11683 (2013).
  46. Rodriguez, R., et al. Small-molecule–induced DNA damage identifies alternative DNA structures in human genes. Nat Chem Biol. 8, 301-310 (2012).
  47. Bando, T., Sugiyama, H. Synthesis and Biological Properties of Sequence-Specific DNA-Alkylating Pyrrole−Imidazole Polyamides. Acc. Chem. Res. 39, 935-944 (2006).
  48. Anders, L., et al. Genome-wide localization of small molecules. Nat. Biotechnol. 32, 92-96 (2014).
  49. Jin, C., et al. Chem-seq permits identification of genomic targets of drugs against androgen receptor regulation selected by functional phenotypic screens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 9235-9240 (2014).
  50. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
  51. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Ansari, A. Z. Mapping Polyamide–DNA Interactions in Human Cells Reveals a New Design Strategy for Effective Targeting of Genomic Sites. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 10124-10128 (2014).
  52. Hyde, J. E., Hearst, J. E. Binding of psoralen derivatives to DNA and chromatin: influence of the ionic environment on dark binding and photoreactivity. Biochemistry. 17, 1251-1257 (1978).
  53. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Rodríguez-Martínez, J. A., Grieshop, M. P., Ansari, A. Z. Genome-wide localization of polyamide-based genome readers reveals sequence-based binding to repressive heterochromatin. In preparation. , (2015).
  54. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8, 424-429 (2011).
  55. Deliard, S., Zhao, J., Xia, Q., Grant, S. F. A. Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq). J Vis Exp. (74), e50286 (2013).
  56. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27, 5174-5178 (1988).
  57. Kumaresan, K. R., Hang, B., Lambert, M. W. Human Endonucleolytic Incision of DNA 3′ and 5′ to a Site-directed Psoralen Monoadduct and Interstrand. J. Biol. Chem. 270, 30709-30716 (1995).
  58. Cimino, G. D., Shi, Y. B., Hearst, J. E. Wavelength dependence for the photoreversal of a psoralen-DNA crosslink. Biochemistry. 25, 3013-3020 (1986).
  59. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol. Cell. 38, 576-589 (2010).
  60. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  61. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotech. 26, 1351-1359 (2008).
  62. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
  63. Martinson, H. G., True, R. J. On the mechanism of nucleosome unfolding. Biochemistry. 18, 1089-1094 (1979).
  64. Gloss, L. M., Placek, B. J. The Effect of Salts on the Stability of the H2A−H2B Histone Dimer. Biochemistry. 41, 14951-14959 (2002).
  65. Jackson, V. Formaldehyde Cross-Linking for Studying Nucleosomal Dynamics. Methods. 17, 125-139 (1999).
  66. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Meth. 11, 203-209 (2014).
  67. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18602-18607 (2013).
  68. Kundaje, A. Phantompeakqualtools home page. , ENCODE Consortium, Computer Science Dept. Available from: https://www.encodeproject.org/software/phantompeakqualtools/ (2010).
  69. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
  70. Hurley, L. H. DNA and its associated processes as targets for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 2, 188-200 (2002).

Tags

Molekylær Biologi COSMIC CSI molekylær genkendelse cheminformatics kemiske genomforskning polyamid målretning genom præcision medicin DNA kromatin immunoprecipitation næste generation sekventering
Genom-dækkende Kortlægning af lægemiddel-DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tværbinding af små molekyler til at isolere Chromatin)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Erwin, G. S., Grieshop, M. P.,… More

Erwin, G. S., Grieshop, M. P., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Rodríguez-Martínez, J. A., Ansari, A. Z. Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin). J. Vis. Exp. (107), e53510, doi:10.3791/53510 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter