Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

लौकिक के साथ कोशिकाओं में ड्रग-डीएनए सहभागिता के जीनोम चौड़ा मानचित्रण (छोटे अणुओं की crosslinking Chromatin को अलग करने के लिए)

Published: January 20, 2016 doi: 10.3791/53510
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1, 1,4
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center, University of Wisconsin–Madison

Summary

जीनोम को निशाना बनाने के अणुओं का सीधा लक्ष्य की पहचान करने के लिए एक बड़ी चुनौती बनी हुई है। डीएनए बाध्यकारी अणुओं जीनोम संलग्न कैसे समझते हैं, हम क्रोमेटिन को अलग-थलग करने के लिए छोटे अणुओं की crosslinking पर निर्भर करता है कि एक विधि (लौकिक) विकसित की है।

Abstract

जीनोम सबसे प्रभावी केमोथेरापी में से कुछ का लक्ष्य है, लेकिन इन दवाओं के सबसे खुराक सीमित करने के लिए विषाक्तता और कई प्रतिकूल दुष्प्रभाव होता है, जो डीएनए अनुक्रम विशिष्टता, कमी है। अनुक्रम विशिष्ट छोटे अणुओं के साथ जीनोम को टारगेट कर वृद्धि हुई चिकित्सीय सूचकांक और कम बंद लक्ष्य प्रभाव के साथ अणुओं सक्षम हो सकता है। एन -methylpyrrole / एन -methylimidazole polyamides तर्क से उत्तम परिशुद्धता के साथ विशिष्ट डीएनए दृश्यों को लक्ष्य बनाया जा सकता है कि अणु होते हैं। और सबसे अधिक प्राकृतिक प्रतिलेखन कारक के विपरीत, polyamides आत्मीयता में बिना किसी नुकसान के methylated और chromatinized डीएनए के लिए बाध्य कर सकते हैं। polyamides के अनुक्रम विशिष्टता बड़े पैमाने पर आत्मीय साइट पहचान (सीएसआई) के साथ इन विट्रो में और परंपरागत जैव रासायनिक और biophysical दृष्टिकोण के साथ अध्ययन किया गया है, लेकिन कोशिकाओं में जीनोमिक लक्ष्यों के लिए बाध्य पॉलियामाइड के अध्ययन के मायावी बनी हुई है। हम एक विधि रिपोर्ट यहाँ, छोटे अणुओं की crosslinking इसोला के लिएते क्रोमेटिन (लौकिक), कि जीनोम भर पॉलियामाइड बाध्यकारी साइटों को पहचानती है। लौकिक chromatin immunoprecipitation (चिप) के समान है, लेकिन दो महत्वपूर्ण मायनों में अलग है: एक photocrosslinker चयनात्मक, अस्थायी नियंत्रित पॉलियामाइड बाध्यकारी घटनाओं का कब्जा है, और (2) बायोटिन आत्मीयता संभाल पॉलियामाइड शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है सक्षम करने के लिए कार्यरत है (1) अर्द्ध denaturing शर्तों के तहत -DNA conjugates गैर covalently बाध्य है कि डीएनए में कमी करने के लिए। लौकिक polyamides और अन्य जीनोम को निशाना एजेंटों के जीनोम चौड़ा बाध्यकारी घटनाओं प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक सामान्य रणनीति है।

Introduction

जानकारी मानव शरीर में प्रत्येक कोशिका के डीएनए में इनकोडिंग है बनाने के लिए। जानकारी है कि के चुनिंदा उपयोग एक सेल के भाग्य को नियंत्रित करता है। प्रतिलेखन कारक (TFS) जीनोम में जीन की एक विशेष सबसेट व्यक्त करने के लिए विशिष्ट डीएनए दृश्यों के लिए बाध्य है कि प्रोटीन होते हैं, और TFS की खराबी विकास दोष, कैंसर और मधुमेह सहित रोगों की एक विस्तृत सरणी की शुरुआत से जुड़ा हुआ है । 1,2 हम चुनिंदा जीनोम के लिए बाध्य और जीन विनियामक नेटवर्क मिलाना कर सकते हैं कि अणुओं को विकसित करने में रुचि रही है।

Polyamides एन -methylpyrrole से बना है और एन प्रतिद्वंद्वी प्राकृतिक प्रतिलेखन कारक है। 3-6 इन अणुओं डीएनए की मामूली नाली में विशिष्ट दृश्यों के लिए बाध्य है कि विशिष्टताओं और समानताएं के साथ डीएनए लक्षित कर सकते हैं कि अणुओं -methylimidazole तर्क से डिजाइन किए हैं। 4,5,7 -11 Polyamides दोनों को दबाने के लिए कार्यरत हैं और विशिष्ट जी की अभिव्यक्ति को सक्रिय कर दिया गया हैEnes। 4,12-19 उन्होंने यह भी दिलचस्प 20-24 एंटीवायरल और कैंसर विरोधी 12,13,25-30 गुण होते हैं। Polyamides में से एक आकर्षक फीचर 31,32 methylated और हिस्टोन प्रोटीन 9,10,33 चारों ओर लपेटा जाता है कि डीएनए दृश्यों का उपयोग करने की क्षमता है।

डीएनए बाध्यकारी अणुओं की व्यापक बाध्यकारी विशिष्टताओं को मापने के लिए, हमारी प्रयोगशाला, 34-39 में इन विट्रो विशिष्टताओं (genomescapes) के आधार पर बाध्यकारी साइटों की भविष्यवाणी की घटना जीनोम पर प्रदर्शित किया जा सकता है। आत्मीय साइट पहचानकर्ता (सीएसआई) विधि बनाया क्योंकि इन विट्रो में बाध्यकारी तीव्रता संघ स्थिरांक के समानुपाती होती है (कश्मीर क)। 34,35,37 ये genomescapes जीनोम भर पॉलियामाइड अधिभोग में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं लेकिन जीवित कोशिकाओं में बाध्यकारी मापने पॉलियामाइड एक चुनौती रहा है। डीएनए कसकर बाध्यकारी साइटों की पहुंच को प्रभावित कर सकता है, जो नाभिक में पैक किया जाता है। द एpolyamides करने के लिए इन chromatinized डीएनए दृश्यों की ccessibility एक रहस्य बनी हुई है।

हाल ही में, कई तरीकों में उभरा है छोटे अणुओं और न्यूक्लिक एसिड के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए। 40-48 रासायनिक संबंध कब्जा है और बड़े पैमाने पर समानांतर डीएनए अनुक्रमण (रसायन-सेक) एक ऐसी तकनीक है। केम-सेक ligand के लक्ष्य बातचीत पर कब्जा करने के लिए ब्याज की एक जीनोमिक लक्ष्य और ब्याज का एक छोटा सा अणु के एक biotinylated व्युत्पन्न करने के लिए छोटे अणुओं crosslink लिए formaldehyde उपयोग करता है। 48,49

: संक्रामक तिर्यक झूठी सकारात्मक उत्पादन कर सकते हैं कि अप्रत्यक्ष बातचीत करने के लिए ले जाता है। 50 हम एक नई विधि, छोटे अणुओं की crosslinking इन तथाकथित "प्रेत" चोटियों को समाप्त करने के लिए एक photocrosslinker साथ क्रोमेटिन (लौकिक), 51 को अलग-थलग करने के लिए। 50 शुरू करने के लिए विकसित की है, हम डिजाइन और polyamides के trifunctional डेरिवेटिव संश्लेषित। इन अणुओं एक डीएनए बाध्यकारी पोल निहितyamide, एक photocrosslinker (psoralen), और एक समानता हैंडल (बायोटिन, चित्रा 1)। Trifunctional polyamides के साथ, हम covalently। 365 एनएम पराबैंगनी विकिरण, डीएनए की क्षति या गैर psoralen आधारित तिर्यक प्रेरित नहीं करता है कि एक तरंग दैर्ध्य के साथ पॉलियामाइड डीएनए बातचीत कब्जा कर सकते हैं 51 अगला, हम कड़े, अर्ध के तहत कब्जा कर लिया डीएनए जीनोम टुकड़ा और शुद्ध -denaturing शर्तों गैर covalently बाध्य है कि डीएनए में कमी करने के लिए। इस प्रकार, हम केम-सेक से संबंधित एक विधि के रूप में ब्रह्मांड की देखने, लेकिन डीएनए के एक और अधिक प्रत्यक्ष readout के साथ निशाना बना। महत्वपूर्ण बात है, कमजोर (कश्मीर एक 10 3 -10 4 एम -1) डीएनए के लिए psoralen की आत्मीयता नहीं करता detectably प्रभाव पॉलियामाइड विशिष्टता। 51,52 समृद्ध डीएनए टुकड़े मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन 51 या तो द्वारा विश्लेषण किया जा सकता (लौकिक-qPCR) या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण 53 (लौकिक-सेक) से। इन आंकड़ों ligands के एक निष्पक्ष, जीनोम निर्देशित डिजाइन सक्षम है कि अंतरअपने वांछित जीनोमिक loci के साथ कार्य और बंद लक्ष्य प्रभाव को कम।

आकृति 1
चित्रा 1. बायोएक्टिव polyamides और ब्रह्मांडीय योजना। (ए) के लिये कांटा polyamides 1-2 लक्ष्य डीएनए अनुक्रम 5'-WACGTW -3 '। रैखिक polyamides 3-4 लक्ष्य 5'-AAGAAGAAG -3 '। एन methylimidazole के छल्ले स्पष्टता के लिए बोल्ड कर रहे हैं। ओपन और भरा हलकों में क्रमश: एन -methylpyrrole और एन -methylimidazole प्रतिनिधित्व करते हैं। वर्ग 3-chlorothiophene का प्रतिनिधित्व करता है, और हीरे β-एलनाइन प्रतिनिधित्व करते हैं। Psoralen और बायोटिन क्रमश: पी और बी से चिह्नित हैं। (बी) ब्रह्मांडीय योजना। प्रकोष्ठों polyamides के trifunctional डेरिवेटिव के साथ व्यवहार कर रहे हैं। 365 एनएम पराबैंगनी विकिरण के साथ crosslinking के बाद, कोशिकाओं कर रहे हैं lysed और जीनोमिक डीएनए sheared है। Streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों पॉलियामाइड डीएनए adducts कब्जा करने के लिए जोड़ रहे हैं। डीएनए जारी की है और मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) द्वारा या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) से विश्लेषण किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

जीवित कोशिकाओं में 1. Crosslinking

  1. ~ 2.5x10 7 एच 1 कोशिकाओं, या अन्य संवर्धित कोशिकाओं के साथ शुरू करते हैं।
    नोट: एच 1 कोशिकाओं की यह संख्या पांच से 10 सेमी व्यंजन (लगभग 40% confluency) से मेल खाती है।
  2. स्टेम कोशिकाओं का समर्थन करता है कि एक सतह पर लेपित बर्तन पर E8 मीडिया में कोशिकाओं को विकसित (सामग्री सूची देखें), और 5% सीओ 2 के humidified माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं। हार्वेस्ट कोशिकाओं enzymatically (सामग्री सूची देखें)। नोट: एच 1 कोशिकाओं 90% confluency को पार करने की अनुमति न दें; confluency एच 1 कोशिकाओं की सहज भेदभाव लाती है। कोशिकाओं की गिनती करने के लिए, कोशिकाओं के एक अतिरिक्त 10 सेमी पकवान बढ़ने enzymatically रूप वर्गों 1.8-1.10 में वर्णित कोशिकाओं उठा, और एक hemocytometer के साथ उन्हें गिनती।
    1. चेन एट अल में वर्णित के रूप E8 संस्कृति मीडिया को तैयार है। 54
  3. पॉलियामाइड जोड़ने से पहले, एक वैक्यूम जाल से जुड़ी एक पाश्चर विंदुक के साथ बिताए संस्कृति मीडिया को हटा दें। के रूप में साथ नए सिरे से मीडिया जोड़ेंerological पिपेट और विंदुक निकालने की मशीन (10 सेमी पकवान प्रति 8 एमएल)।
    नोट: कोशिकाओं में खलल न डालें से बचने के लिए पकवान की ओर करने के लिए मीडिया जोड़ें। इस बिंदु से आगे समय से पहले फोटो तिर्यक से बचने के लिए प्रकाश से कोशिकाओं की रक्षा।
  4. सीधे प्रत्येक पकवान की संस्कृति मीडिया के लिए एक पिपेट (DMSO में 400 माइक्रोन पॉलियामाइड के 8 μl, 400 एनएम अंतिम एकाग्रता) के साथ पॉलियामाइड जोड़ें। मीडिया में समान रूप से पॉलियामाइड को तितर-बितर करने के लिए पकवान भंवर।
    नोट: एकाग्रता विविध हो सकता है, लेकिन कोई सेलुलर विषाक्तता चयनित उपचार के लिए मनाया जाता है यह सुनिश्चित कर सकते हैं।
  5. 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में कोशिकाओं को 24 घंटा 37 डिग्री सेल्सियस सेते हैं, और वे प्रकाश से संरक्षित कर रहे हैं।
    नोट: ऊष्मायन समय समय के पार बाध्यकारी पॉलियामाइड को मापने के लिए अलग किया जा सकता है।
  6. 4 मिलीलीटर पीबीएस (1.05 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार, 155.17 मिमी सोडियम क्लोराइड, 2.97 मिमी सोडियम फास्फेट द्विक्षारकीय) एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट और पिपेट जिले उपयोग करने के साथ प्रत्येक 10 सेमी पकवान धोनेpenser। महाप्राण पीबीएस और 3 मिलीग्राम E8 संस्कृति मीडिया जोड़ें।
  7. रोशनी मंद साथ, 5 संस्कृति बर्तन का ढक्कन हटाने और हुड के बाहर एक सपाट सतह पर कोशिकाओं की जगह। Λ <300 एनएम के साथ प्रकाश को फिल्टर करने के लिए 5 संस्कृति व्यंजन पर एक गिलास फिल्टर रखें। फिल्टर के शीर्ष पर यूवी स्रोत रखें। Crosslink नमूने 365 एनएम पराबैंगनी विकिरण (2.4 मेगावाट / 2 सेमी) के साथ 30 मिनट।
    नोट: समय Crosslinking अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए।
  8. वापस हुड के लिए संस्कृति व्यंजन स्थानांतरण। एक निर्वात जाल से जुड़ी एक पाश्चर विंदुक के साथ मीडिया Aspirate। 4 मिलीलीटर पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 सेमी पकवान धो लें। पीबीएस Aspirate। कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए 10 सेमी पकवान प्रति सेल हदबंदी के लिए 3 मिलीग्राम एंजाइम (सामग्री सूची देखें) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट सेते हैं।
    नोट: मत एंजाइम पूर्व गर्म।
  9. पकवान प्रति 3 मिलीग्राम E8 मीडिया के साथ एंजाइम बुझाने। स्थानांतरण एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को अलग।
    नोट: इस बिंदु से आगे बर्फ पर जगह कोशिकाओं।
  10. CentriFuge कोशिकाओं 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 XG अलग हो गई। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला एंजाइम और मीडिया को दूर करने के लिए।
    नोट: बिंदु रोकें। कोशिकाओं को एक बाद में समय पर बाद के प्रसंस्करण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, फ्लैश जमी तरल नाइट्रोजन में हो सकता है।

Chromatin की 2. अलगाव

  1. 1.2 मिलीलीटर लौकिक बफर जोड़ें (20 मिमी Tris एचसीएल [पीएच 8.1], 2 मिमी EDTA, 150 मिमी NaCl, 1% ट्राइटन X100, 0.1% एसडीएस) और ऊपर और नीचे पिपेट कई बार प्रत्येक नमूने में लिए सेल गोली resuspend 1.2 मिलीलीटर लौकिक बफर।
    1. PMSF और benzamidine और pepstatin के लिए 1.5 माइक्रोन के लिए 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए नए सिरे से 133 μl 100 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) में से प्रत्येक, 100 मिमी benzamidine, और प्रोटीज अवरोधकों pepstatin 150 माइक्रोन जोड़ें। दो एम्बर 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में सेल lysate के विभाजन समाधान।
  2. Sonicator 35 मिनट (10 सेकंड, 10 सेकंड बंद, 60% बिजली) के साथ Sonicate 100 के बीच करने के लिए जीनोम टुकड़ा करने के लिएएन डी 500 बीपी।
    1. जलाशय में पानी के स्तर तक microcentrifuge ट्यूब समानांतर में क्रोमेटिन समाधान के स्तर पर रखें। दृश्य निरीक्षण करके इस स्तर की पुष्टि करें।
      नोट:। डीएनए एक 1.5% agarose जेल के साथ sheared था कि यह पुष्टि 55
    2. अनुभव से sonication समय का अनुकूलन। नमूने ठंडा करने के लिए जलाशय में बर्फ की एक न्यूनतम राशि का उपयोग करें, और बर्फ के नमूने और कप सींग के बीच हस्तक्षेप नहीं है सुनिश्चित करते हैं।
  3. नमूना अपकेंद्रित्र 12,000 XG 10 मिनट। एक विंदुक के साथ एक नए एम्बर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए इसे स्थानांतरित करके घुलनशील क्रोमेटिन होता है जो जलीय घोल को बचाओ। गोली त्यागें।
  4. एक नया microcentrifuge ट्यूब के लिए नमूने के 110 μl (10%) स्थानांतरण और यह इनपुट डीएनए लेबल। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। 3.3 कदम में उपयोग के लिए बर्फ पर क्रोमेटिन नमूना के बाकी बचा।

Ligand-डीएनए crosslinks 3. कैद

  1. 60 μl streptavi बांटना एक विंदुक का प्रयोग करेंएक microcentrifuge ट्यूब में चुंबकीय मोती दीन-लेपित। 1 मिलीलीटर लौकिक बफर जोड़ें और आरटी पर एक nutator 5 मिनट पर मिला लें। चुंबकीय जुदाई पर चुंबकीय मोती मोती कब्जा करने के लिए 2 मिनट रैक रखें। एक विंदुक के साथ लौकिक बफर निकालें।
    नोट: मोती बाहर सुखाने के लिए अनुमति न दें। अगले कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
  2. क्रोमेटिन नमूना जोड़ें (~ 1 एमएल) मोती (60 μl) के लिए और मोती resuspend। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन, कमाल मिक्सर पर streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों कम से कम 4 घंटा के साथ क्रोमेटिन सेते हैं। अगर वांछित नमूने हे / एन सेते हैं।

आत्मीयता शुद्ध डीएनए के 4. अलगाव

  1. गैर विशिष्ट बातचीत निकालने के लिए निम्न धोने buffers के साथ आरटी पर 7 मिनट के अंतराल के साथ मोती धो लें। प्रत्येक धोने के बाद मोती कब्जा करने के लिए एक चुंबकीय जुदाई रैक का उपयोग करें। कपड़े धोने बफर में प्रत्येक परिवर्तन के बाद मोती Resuspend।
  2. उपयोग करने से पहले आसुत विआयनीकृत पानी और फिल्टर (0.2 माइक्रोन) में धो बफ़र्स तैयार करें। एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर धोने बफ़र 1 और 2everal महीने। प्रत्येक दिन धो बफर 3 नए सिरे से तैयार। जोड़ें और एक विंदुक के साथ नमूना से धो बफ़र्स को हटा दें। 2 और 4 के लिए, washes में क्रमश: 1 और 3 (5 मिमी) जोड़ें। नमूने अतिरिक्त (एक बार 12 घंटे, 4 घंटे में एक बार) से पहले नीचे सूचीबद्ध washes के लिए लौकिक बफर के साथ दो बार धोया जा सकता है।
    1. धो बफर 1 (10 मिमी Tris सीएल [पीएच 8.0], 1 मिमी EDTA, 3% एसडीएस) के साथ एक बार धो लें। धो बफर 2 (10 मिमी Tris सीएल [पीएच 8.0], 250 मिमी LiCl, 1 मिमी EDTA, 0.5% NP40, 1% सोडियम deoxycholate) के साथ एक बार धो लें। धो बफर 3 के साथ दो बार धोने (4 एम यूरिया, 10 मिमी Tris सीएल [पीएच 7.5], 1 मिमी EDTA, 0.1% एनपी 40)। Tris EDTA (ते) बफर (10 मिमी Tris सीएल [पीएच 8.0], 1 मिमी EDTA) के साथ दो बार धोएं।
  3. एक विंदुक के साथ 200 μl ते बफर में मोती Resuspend। पर कब्जा कर लिया डीएनए का यह नमूना आत्मीयता शुद्ध (एपी) डीएनए के रूप में जाना जाता है।
  4. 10x Crosslink उलटा बफर (100 मिमी Tris सीएल [पीएच 8.0], 1 एम KOH, 4 मिमी के साथ इनपुट और एपी डीएनए अनुपूरकEDTA) अंतिम एकाग्रता 1x करने के लिए। 56,57 सेते 30 मिनट 90 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: 254 एनएम पराबैंगनी विकिरण भी psoralen Crosslink, 58 लेकिन cyclobutyl pyrimidine dimers इस तरंग दैर्ध्य में विकिरण से गठित किया जा सकता रिवर्स और डीएनए के बहाव के प्रसंस्करण के मामले में हस्तक्षेप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. एपी डीएनए के लिए, चुंबकीय जुदाई पर नमूना युक्त microcentrifuge ट्यूब एक विंदुक के साथ 2 आरटी पर मिनट और अलग-थलग तरल (डीएनए) रैक रखें। एक नए एम्बर microcentrifuge ट्यूब एपी डीएनए (मोतियों से जारी की गई है, जिसमें) स्थानांतरण।
    नोट: वांछित एपी डीएनए तरल में, अब कोई मोतियों से जुड़ी है।
  6. एक विंदुक के साथ 100 μl नमूना प्रति लगभग 1 μl 6 एन एचसीएल जोड़कर पीएच 7 के लिए केंद्रित एचसीएल के साथ इनपुट और एपी डीएनए बेअसर। । नमूने एक पिपेट चेतावनी के साथ पीएच पेपर पर ~ 0.5 μl जोड़कर निष्प्रभावी कर रहे हैं की पुष्टि करें: केंद्रित एचसीएल एक मजबूत संक्षारक एसिड है। अपनी संस्था के अनुसार हैंडल217; उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के लिए दिशा निर्देशों।
  7. 0.2 माइक्रोग्राम तक RNase एक (100 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें / इनपुट और एपी डीएनए दोनों को अंतिम एकाग्रता μl। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे सेते हैं। 0.2 माइक्रोग्राम तक Proteinase कश्मीर (20 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें / इनपुट और एपी डीएनए दोनों को अंतिम एकाग्रता μl जोड़ें। 55 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे सेते हैं।
  8. एक डीएनए स्तंभ सफाई किट के साथ डीएनए (माल की सूची देखें) शुद्ध। 55 Elute डीएनए 58 μl डीएनए ग्रेड एच 2 ओ में -20 या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर इनपुट और एपी नमूने
  9. ठिकाना विशिष्ट प्राइमरों, और / या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा साथ मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) द्वारा एपी डीएनए का विश्लेषण करें। 95 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट का एक चक्र और 95 डिग्री सेल्सियस 20 सेकंड के 40 चक्र, 54 डिग्री सेल्सियस या 56 डिग्री सेल्सियस 20 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस 40 सेकंड: qPCR के लिए, निम्नलिखित मानकों के साथ ठिकाना प्रति 2 μl एपी डीएनए का उपयोग करें।
    नोट: annealing तापमान इस्तेमाल किया प्राइमर जोड़े के पिघलने के तापमान के अनुसार संशोधित किया जाना चाहिए। एक annealing temperatu का चयन करेंकि फिर से कोई अविशिष्ट प्रवर्धन के साथ quantitation के चक्र को कम करता है।
    नोट: अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण के लिए लिखा है, मैप किया कम से कम 10 लाख के लिए लक्ष्य। मैप किए की संख्या एपी डीएनए की मात्रा में वृद्धि से और अनुक्रमण के लिए एक रन में कम नमूने के संयोजन से बढ़ाया जा सकता है पढ़ता है। अधिक संवेदनशीलता को बेहतर बनाने में पढ़ता है। चिप seq के विश्लेषण के लिए मानक संकुल (जैसे, होमर, 59 एमएसीएस, 60 और एसपीपी 61) लौकिक-सेक डेटा के साथ काम करते हैं। जीनोम अनुक्रमण और चिप seq सहित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पर भरोसा करते हैं कि अन्य विधियों, साथ के रूप में, दोहराए क्षेत्रों संरेखण और विधानसभा में अस्पष्टता बना सकते हैं और इस प्रकार एक तकनीकी चुनौती बने हुए हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

गैर वर्दी जीनोम विखंडन और अन्य चर के लिए खाते में करने के लिए, शुद्ध डीएनए हमेशा इनपुट डीएनए के एक संदर्भ के खिलाफ सामान्यीकृत किया जाना चाहिए। ब्याज की एक ठिकाना करने के लिए विशिष्ट प्राइमरों इस्तेमाल किया जा सकता है। यह भी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, अणु बाध्य करने की उम्मीद नहीं है, जहां एक ठिकाना विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है। हम 365 एनएम प्रकाश (चित्रा 2) के साथ विकिरण पर पॉलियामाइड अधिभोग में एक> 100 गुना वृद्धि को देखते हैं।

समृद्ध डीएनए भी अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। चिप डीएनए तैयार किया जाता है के रूप में डीएनए (जैसे, एक वाणिज्यिक नमूना प्रस्तुत करने का किट के साथ, माल की सूची देखें) एक ही तरीके से अनुक्रमण के लिए तैयार किया जाता है। यहां तक ​​कि अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ, हम अभी भी हम पॉलियामाइड बाध्य होने के लिए उम्मीद है, जहां loci में डीएनए के संवर्धन की पुष्टि करने के qPCR का उपयोग करें। एक बार अनुक्रम, कच्चे डीएनए जीनोम और घनत्व निशान चिप seq डेटा (चित्रा 3) का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक ही सॉफ्टवेयर के साथ तैयार हैं करने के लिए गठबंधन कर रहे हैं पढ़ता है। बाकोशिकाओं में पॉलियामाइड वितरण के हमारे विश्लेषण पर sed, हम सबसे अच्छा कोशिकाओं में अधिभोग की भविष्यवाणी, समानताएं की एक विस्तृत रेंज में फैले, बाध्यकारी साइटों क्लस्टर कि पाया। हम अपने इन विट्रो सीएसआई डेटा (चित्रा -4 ए) के साथ बाइंडिंग के लिए पूरे जीनोम स्कोर करने के लिए एक एल्गोरिथ्म विकसित की है। यह स्कोरिंग विधि समान भविष्यवाणी बाध्यकारी स्कोर के साथ अलग अलग जीनोमिक loci बदलती समानताएं (चित्रा 4 बी) के कई साइटों के विविध क्लस्टरिंग है कि प्रदर्शन का पता चला।

चित्र 2
चित्रा HEK293 कोशिकाओं से एपी / इनपुट के अंश पर 365 एनएम पराबैंगनी विकिरण के लौकिक-qPCR। प्रभाव 2. परिणाम। एपी, आत्मीयता शुद्ध। परिणाम लॉग पैमाने पर साजिश रची और ± SEM मतलब का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं

चित्र तीन
फाईGure एच 1 कोशिकाओं में ब्रह्मांडीय-सेक 3. परिणाम। एएजी दोहराता को लक्ष्य बनाया गया रेखीय पॉलियामाइड 4 के लिए लौकिक-सेक टैग घनत्व ट्रैक। टैग घनत्व 10 7 टैग के लिए सामान्यीकृत और एकीकृत जीनोम दर्शक के साथ प्रदर्शित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
2 और 4 पूरे जीनोम भर बाइंडिंग के लिए भविष्यवाणी स्कोर की। (ए) वायलिन भूखंडों बाध्यकारी पॉलियामाइड चित्रा 4 मॉडल। 4 के लिए प्रतिनिधि genomescapes भी दिखाए जाते हैं। Bioinformatic स्कोरिंग विधि कार्यरत साथ, जीनोमिक loci अलग अलग तरीकों से ही भविष्यवाणी स्कोर करने के लिए योग कर सकते हैं। कई निम्न और मध्यम आत्मीयता दृश्यों थानेदार के साथ (बी) Lociडब्ल्यू समान पॉलियामाइड अधिभोग कुछ उच्च आत्मीयता दृश्यों के साथ लोकी के लिए। अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। 51 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-ml conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
  2. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet. 10, 252-263 (2009).
  3. Meier, J. L., Yu, A. S., Korf, I., Segal, D. J., Dervan, P. B. Guiding the Design of Synthetic DNA-Binding Molecules with Massively Parallel Sequencing. J. Am. Chem. Soc. 134, 17814-17822 (2012).
  4. Dervan, P. B. Molecular recognition of DNA by small molecules. Bioorg. Med. Chem. 9, 2215-2235 (2001).
  5. Wemmer, D. E., Dervan, P. B. Targeting the minor groove of DNA. Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 355-361 (1997).
  6. Eguchi, A., Lee, G. O., Wan, F., Erwin, G. S., Ansari, A. Z. Controlling gene networks and cell fate with precision-targeted DNA-binding proteins and small-molecule-based genome readers. Biochem. J. 462, 397-413 (2014).
  7. Mrksich, M., et al. Antiparallel side-by-side dimeric motif for sequence-specific recognition in the minor groove of DNA by the designed peptide 1-methylimidazole-2-carboxamide netropsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7586-7590 (1992).
  8. Edayathumangalam, R. S., Weyermann, P., Gottesfeld, J. M., Dervan, P. B., Luger, K. Molecular recognition of the nucleosomal "supergroove". Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 6864-6869 (2004).
  9. Suto, R. K., et al. Crystal structures of nucleosome core particles in complex with minor groove DNA-binding ligands. J. Mol. Biol. 326, 371-380 (2003).
  10. Gottesfeld, J. M., et al. Sequence-specific Recognition of DNA in the Nucleosome by Pyrrole-Imidazole Polyamides. J. Mol. Biol. 309, 615-629 (2001).
  11. Chenoweth, D. M., Dervan, P. B. Structural Basis for Cyclic Py-Im Polyamide Allosteric Inhibition of Nuclear Receptor Binding. J. Am. Chem. Soc. 132, 14521-14529 (2010).
  12. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-κB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 1023-1028 (2012).
  13. Yang, F., et al. Antitumor activity of a pyrrole-imidazole polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1863-1868 (2013).
  14. Mapp, A. K., Ansari, A. Z., Ptashne, M., Dervan, P. B. Activation of gene expression by small molecule transcription factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3930-3935 (2000).
  15. Ansari, A. Z., Mapp, A. K., Nguyen, D. H., Dervan, P. B., Ptashne, M. Towards a minimal motif for artificial transcriptional activators. Chem. Biol. 8, 583-592 (2001).
  16. Arora, P. S., Ansari, A. Z., Best, T. P., Ptashne, M., Dervan, P. B. Design of artificial transcriptional activators with rigid poly-L-proline linkers. J. Am. Chem. Soc. 124, 13067-13071 (2002).
  17. Nickols, N. G., Jacobs, C. S., Farkas, M. E., Dervan, P. B. Modulating Hypoxia-Inducible Transcription by Disrupting the HIF-1–DNA Interface. ACS Chemical Biology. 2, 561-571 (2007).
  18. Pandian, G. N., et al. A synthetic small molecule for rapid induction of multiple pluripotency genes in mouse embryonic fibroblasts. Sci. Rep. 2, 544 (2012).
  19. Pandian, G. N., et al. Synthetic Small Molecules for Epigenetic Activation of Pluripotency Genes in Mouse Embryonic Fibroblasts. Chem Bio Chem. 12, 2822-2828 (2011).
  20. He, G., et al. Binding studies of a large antiviral polyamide to a natural HPV sequence. Biochimie. 102, 83-91 (2014).
  21. Edwards, T. G., Vidmar, T. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. DNA Damage Repair Genes Controlling Human Papillomavirus (HPV) Episome Levels under Conditions of Stability and Extreme Instability. PLoS ONE. 8, e75406 (2013).
  22. Edwards, T. G., Helmus, M. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. HPV Episome Stability is Reduced by Aphidicolin and Controlled by DNA Damage Response Pathways. Journal of Virology. , (2013).
  23. Edwards, T. G., et al. HPV episome levels are potently decreased by pyrrole-imidazole polyamides. Antiviral Res. 91, 177-186 (2011).
  24. Dickinson, L. A., et al. Inhibition of RNA polymerase II transcription in human cells by synthetic DNA-binding ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12890-12895 (1998).
  25. Dickinson, L. A., et al. Arresting Cancer Proliferation by Small-Molecule Gene Regulation. Chem. Biol. 11, 1583-1594 (2004).
  26. Nickols, N. G., et al. Activity of a Py–Im Polyamide Targeted to the Estrogen Response Element. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 675-684 (2013).
  27. Raskatov, J. A., Puckett, J. W., Dervan, P. B. A C-14 labeled Py–Im polyamide localizes to a subcutaneous prostate cancer tumor. Bioorg. Med. Chem. 22, 4371-4375 (2014).
  28. Jespersen, C., et al. Chromatin structure determines accessibility of a hairpin polyamide–chlorambucil conjugate at histone H4 genes in pancreatic cancer cells. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4068-4071 (2012).
  29. Chou, C. J., et al. Small molecules targeting histone H4 as potential therapeutics for chronic myelogenous leukemia. Molecular Cancer Therapeutics. 7, 769-778 (2008).
  30. Nickols, N. G., Dervan, P. B. Suppression of androgen receptor-mediated gene expression by a sequence-specific DNA-binding polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 10418-10423 (2007).
  31. Minoshima, M., Bando, T., Sasaki, S., Fujimoto, J., Sugiyama, H. Pyrrole-imidazole hairpin polyamides with high affinity at 5CGCG3 DNA sequence; influence of cytosine methylation on binding. Nucleic Acids Res. 36, 2889-2894 (2008).
  32. Warren, C. L., et al. Fabrication of duplex DNA microarrays incorporating methyl-5-cytosine. Lab on a Chip. 12, 376-380 (2012).
  33. Dudouet, B., et al. Accessibility of nuclear chromatin by DNA binding polyamides. Chem. Biol. 10, 859-867 (2003).
  34. Carlson, C. D., et al. Specificity landscapes of DNA binding molecules elucidate biological function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4544-4549 (2010).
  35. Warren, C. L., et al. Defining the sequence-recognition profile of DNA-binding molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 867-872 (2006).
  36. Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. Chapter One - Sequence-Specificity and Energy Landscapes of DNA-Binding Molecules. Methods Enzymol. Voigt, C. 497, Academic Press. 3-30 (2011).
  37. Puckett, J. W., et al. Quantitative microarray profiling of DNA-binding molecules. J. Am. Chem. Soc. 129, 12310-12319 (2007).
  38. Keles, S., Warren, C. L., Carlson, C. D., Ansari, A. Z. CSI-Tree: a regression tree approach for modeling binding properties of DNA-binding molecules based on cognate site identification (CSI) data. Nucleic Acids Res. 36, 3171-3184 (2008).
  39. Hauschild, K. E., Stover, J. S., Boger, D. L., Ansari, A. Z. CSI-FID: High throughput label-free detection of DNA binding molecules. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 3779-3782 (2009).
  40. Lee, M., Roldan, M. C., Haskell, M. K., McAdam, S. R., Hartley, J. A. In vitro Photoinduced Cytotoxicity and DNA Binding Properties of Psoralen and Coumarin Conjugates of Netropsin Analogs: DNA Sequence-Directed Alkylation and Cross-Link. 37, 1208-1213 (1994).
  41. Wurtz, N. R., Dervan, P. B. Sequence specific alkylation of DNA by hairpin pyrrole–imidazole polyamide conjugates. Chem. Biol. 7, 153-161 (2000).
  42. Tung, S. -Y., Hong, J. -Y., Walz, T., Moazed, D., Liou, G. -G. Chromatin affinity-precipitation using a small metabolic molecule: its application to analysis of O-acetyl-ADP-ribose. Cell. Mol. Life Sci. 69, 641-650 (2012).
  43. Rodriguez, R., Miller, K. M. Unravelling the genomic targets of small molecules using high-throughput sequencing. Nat Rev Genet. 15, 783-796 (2014).
  44. Guan, L., Disney, M. D. Covalent Small-Molecule–RNA Complex Formation Enables Cellular Profiling of Small-Molecule–RNA Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10010-10013 (2013).
  45. White, J. D., et al. Picazoplatin, an Azide-Containing Platinum(II) Derivative for Target Analysis by Click Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 135, 11680-11683 (2013).
  46. Rodriguez, R., et al. Small-molecule–induced DNA damage identifies alternative DNA structures in human genes. Nat Chem Biol. 8, 301-310 (2012).
  47. Bando, T., Sugiyama, H. Synthesis and Biological Properties of Sequence-Specific DNA-Alkylating Pyrrole−Imidazole Polyamides. Acc. Chem. Res. 39, 935-944 (2006).
  48. Anders, L., et al. Genome-wide localization of small molecules. Nat. Biotechnol. 32, 92-96 (2014).
  49. Jin, C., et al. Chem-seq permits identification of genomic targets of drugs against androgen receptor regulation selected by functional phenotypic screens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 9235-9240 (2014).
  50. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
  51. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Ansari, A. Z. Mapping Polyamide–DNA Interactions in Human Cells Reveals a New Design Strategy for Effective Targeting of Genomic Sites. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 10124-10128 (2014).
  52. Hyde, J. E., Hearst, J. E. Binding of psoralen derivatives to DNA and chromatin: influence of the ionic environment on dark binding and photoreactivity. Biochemistry. 17, 1251-1257 (1978).
  53. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Rodríguez-Martínez, J. A., Grieshop, M. P., Ansari, A. Z. Genome-wide localization of polyamide-based genome readers reveals sequence-based binding to repressive heterochromatin. In preparation. , (2015).
  54. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8, 424-429 (2011).
  55. Deliard, S., Zhao, J., Xia, Q., Grant, S. F. A. Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq). J Vis Exp. (74), e50286 (2013).
  56. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27, 5174-5178 (1988).
  57. Kumaresan, K. R., Hang, B., Lambert, M. W. Human Endonucleolytic Incision of DNA 3′ and 5′ to a Site-directed Psoralen Monoadduct and Interstrand. J. Biol. Chem. 270, 30709-30716 (1995).
  58. Cimino, G. D., Shi, Y. B., Hearst, J. E. Wavelength dependence for the photoreversal of a psoralen-DNA crosslink. Biochemistry. 25, 3013-3020 (1986).
  59. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol. Cell. 38, 576-589 (2010).
  60. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  61. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotech. 26, 1351-1359 (2008).
  62. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
  63. Martinson, H. G., True, R. J. On the mechanism of nucleosome unfolding. Biochemistry. 18, 1089-1094 (1979).
  64. Gloss, L. M., Placek, B. J. The Effect of Salts on the Stability of the H2A−H2B Histone Dimer. Biochemistry. 41, 14951-14959 (2002).
  65. Jackson, V. Formaldehyde Cross-Linking for Studying Nucleosomal Dynamics. Methods. 17, 125-139 (1999).
  66. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Meth. 11, 203-209 (2014).
  67. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18602-18607 (2013).
  68. Kundaje, A. Phantompeakqualtools home page. , ENCODE Consortium, Computer Science Dept. Available from: https://www.encodeproject.org/software/phantompeakqualtools/ (2010).
  69. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
  70. Hurley, L. H. DNA and its associated processes as targets for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 2, 188-200 (2002).

Tags

आण्विक जीवविज्ञान अंक 107 लौकिक सीएसआई आणविक मान्यता cheminformatics रासायनिक जीनोमिक्स पॉलियामाइड जीनोम लक्ष्य-निर्धारण सटीक दवा डीएनए क्रोमेटिन immunoprecipitation अगली पीढ़ी के अनुक्रमण
लौकिक के साथ कोशिकाओं में ड्रग-डीएनए सहभागिता के जीनोम चौड़ा मानचित्रण (छोटे अणुओं की crosslinking Chromatin को अलग करने के लिए)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Erwin, G. S., Grieshop, M. P.,… More

Erwin, G. S., Grieshop, M. P., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Rodríguez-Martínez, J. A., Ansari, A. Z. Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin). J. Vis. Exp. (107), e53510, doi:10.3791/53510 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter