Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.
In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.
أهداب الابتدائية طويلة الزوائد القائم على أنيبيب التي تمتد من سطح معظم خلايا الثدييات. وغالبا ما يتم الخلط بين أهداب الابتدائي مع أهداب متحركة، التي يوجد منها دائما متعددة في كل خلية، والذي يهدف إلى نقل السوائل عبر أسطح الأغشية. أهداب الابتدائي، في المقابل، تعتمد الأدوار الحسية، وبالتالي المشار إليها أهداب كما الحسي أيضا. مرة واحدة فترة طويلة طي النسيان، وهذا عضية في الآونة الأخيرة 'اكتشاف' نتيجة لارتباطه مع العديد من الأمراض الوراثية البشرية 1. موقع مثالي كما عضية الإشارات، وقد تبين من هدب الأساسي لتنظيم العديد من مسارات إشارات، وكثير منها هي مهمة ليس فقط في توازن الأنسجة والمرض، ولكن أيضا خلال تطوير 2.
كان واحدا من مسارات الإشارات الأولى تبين أن تترافق مع ضعف أهداب وغير متعارف عليه مسار إشارات Wnt، المعروف أيضا باسم قطبية خلية مستو (PCP) مسار <sup > 3. هذه سلسلة الإشارات التي تم تحديدها في البداية في ذبابة الفاكهة، هو أمر حاسم لمرحلة التطور الجنيني. ولا سيما بالنسبة للعمليات التقارب والإرشاد والتوجيه الصحيح من الخلايا في الطائرة من ظهائر 4. إشارات متتابعة من مجموعة أساسية من البروتينات التنظيمية تترجم الإشارات الاتجاه الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى إعادة ترتيب هيكل الخلية ويؤدي إلى الاستقطاب منسق الخلايا الظهارية في طائرة 5. مطلوب عملية التقارب والإرشاد للغاية لقناة القوقعة إلى استطال والصحيحة الزخرفة الخلوية 6. وبما أن هذا التنظيم عبر تفعيل المسار حزب المؤتمر الشعبي، واحدة من الظواهر الأكثر لفتا للطفرات PCP القوقعة هي القناة قوقعة تقصير مع غير منظمة ظهائر الحسية 7. وبالمثل، المسوخ الماوس، والتي تفتقر أهداب، كما يحمل هذا التقارب والإرشاد النمط الظاهري 8،9، على الرغم من بالضبط كيف ينظم يبقى أن توضيح.
ve_content "> لأن عمليات التقارب والإرشاد حاسمة للنمو من القناة القوقعة، والزخرفة الخلوية من ظهائر الحسية داخل القناة القوقعة، القوقعة النامية جهازا مثاليا لدراسة PCP الإشارات خلال تطوير الفقاريات.، وجهاز ويطلق على كورتي، مصطلح يطلق على ظهارة حسية متخصصة خطوط القناة قوقعة الأذن، ويتكون من خلايا دعم غير الحسية وخلايا الشعر ميكانيكية حسية التي يجب موحد الموجهة للالقوقعة للعمل 10. وخلايا الشعر ميكانيكية حسية ذلك بسبب حزم stereociliary التي تمتد من لوحة جليدية (السطح القمي) من كل خلية الشعر الحسية (11). وهذه بمثابة محولات الطاقة الأولية من mechanosensation وعلى الرغم من التسميات على النحو أهداب ساكنة، وتتألف في الواقع من الزغيبات الصغيرة المعتمدة على خيوط الأكتين المعدلة. وفي كل الشعر على شكل شيفرون حزمة، ويتم تنظيم ثلاثة صفوف من أهداب ساكنة في السلطة الفلسطينية أمر غاية والعاديةttern في درج بطريقة حالة شبيهة. ريال مدريد أهداب القائم على أنيبيب، الأهداب المحركة تسميته، مطلوبة من أجل تطوير وتوجيه حزم stereociliary 12. على كل خلية الشعر، ويرد الهدب المحرك واحد فعليا إلى حزمة أهداب ساكنة، ويقع بالقرب مركزيا لأطول صف من أهداب ساكنة. وظيفة دقيقة من الهدب المحرك غير واضحة، وفرضية واحدة هي أن الهدب المحرك "تسحب" على أهداب ساكنة في الشكل لأنها ناضجة من الزغيبات الصغيرة 12. في الفقاريات، الأهداب المحركة في القوقعة هي فقط موجودة عابر وتتراجع عن خلايا الشعر في الفئران قبل بداية سماع 11،13،14.فقدان كامل للأهداب في تطوير النتائج القوقعة في القنوات قوقعة تقصير شديد، والخطأ في تشكيل وحزم stereociliary، وكذلك الهيئات القاعدية وضعه سوء 8،9 سوء المنحى. لا يشتمل هدب وظيفية فقط من الخيط المحوري الهدبية. العديد من البروتينات المرتبطة أهدابتحدث وظيفة في المجمعات المحلية لالنطاقات الفرعية ذات الصلة أهداب مثل الجسم القاعدية، منطقة انتقالية، أو الهدبية الخيط المحوري 15. الجسم القاعدية، والمستمدة من المركزيه أم جسيم مركزي، هو أيضا مركزا لتنظيم أنيبيب لميكروتثبول مد بعيدا عن هدب في خلايا الجسم، ويمكن تنظيم الاتجار داخل الخلايا وكذلك الاتجار الهدبية. المنطقة الهدبية الانتقالية منطقة أخرى حيث يتم تنظيم وظيفة الهدبية من حيث تنظيم استيراد وتصدير مركبات الهدبية 16.
وقد حددت الدراسات متعددة اتصال بين أهداب وWNT غير متعارف عليه (PCP الإشارات)، على الرغم من أن الآلية الدقيقة غير واضحة (17). التكرار من الجينات الهدبية وحزب المؤتمر الشعبي وحساسية قطبية الخلية إلى التغيرات الخلوية المعمم، تجعل من الصعب ربط مباشرة طفرة إلى العجز في حزب المؤتمر الشعبي محددة. واحدة من الرافضة قراءة في إشارة PCP هو تحديد المواقع من الجسم القاعدية وPRIMARذ هدب، وبالتالي فصل المرحلة الابتدائية من العيوب الثانوية يمثل تحديا. وقد اقترحت بعض الدراسات في الزرد والفأر المسوخ لا علاقة بين أهداب وإشارات Wnt 18-20. قد تعكس تناقضات في البيانات الأنواع، الأنسجة، أو الاختلافات الزمنية التي تعتمد في المساهمات الهدبية نحو إشارات WNT. وعلاوة على ذلك، قد يتم الاحتفاظ الاستجابة WNT العادية إذا بقيت الهيئات القاعدية وظيفية. وفهم أعمق لدور البروتينات الهدبية في مسارات الإشارات الخلوية والظواهر البيولوجية الأخرى أمر حاسم لفهمنا لعلم الأحياء الخلوي والتنموي، فضلا عن تطوير استراتيجيات العلاج المستهدفة.
عند إعداد الأنسجة قوقعة للتحليل، هناك عدد قليل من النقاط الرئيسية أن نأخذ في الاعتبار. أولا، يمكن أن الاختلافات في الخلفية الوراثية تعديل النمط الظاهري قوقعة الأذن، مما يجعل من الضروري تحليل ومقارنة الضوابط littermate فقط. ثانيا، يتعين إزالة كاملة من الغشاء السقفي للحصو…
The authors have nothing to disclose.
يود الكاتب أن أشكر ماثيو كيلي، تيزيانا Cogliati، جيسيكا Gumerson، أوفي ولفروم، ريفكا Levron، فيولا كريتشمير وزوي مان ولتقييم ينتقدون فيها المخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جائزة Sofja كوفاليفسكايا (مؤسسة Humbodlt) وجامعة يوهانس غوتنبرغ،، ماينز، ألمانيا.
Tools/Equipment | |||
Silicone elastomere – Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | See Note 2 |
Micro dissecting scissors-straight blade | Various | ||
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps | Various | ||
Dissecting microscope. | Various | ||
Uncoated glass microscope slides | Various | ||
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | Various | ||
Transfer pipettes | Various | ||
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
SEM sample holder | tousimis | 8762 | |
Scanning electron microscopy studs | TED PELLA | 16111 | |
PELCO Tabs: Carbon adhesive | TED PELLA | 16084-3 | |
Fluorescent Microscope | Various | ||
Critical Point Dryer | Various | ||
Scanning Electron Microscope | Various | ||
Glass microscope slides | Various | ||
Glass coverslips | Various | ||
Kimwipe Tissue | Various | ||
Fine Paint Brush | |||
Reagents | |||
1× Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
Paraformaldehyde (PFA) (EM Grade Required for EM) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM. | |
2.5% Glutaraldehyde Grade1 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Tris-HCl (pH 7.5) | Various | ||
NaCl | Various | ||
CaCl 2 | Various | ||
Triton X-100 | Various | ||
Normal Goat Serum | Various | ||
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Ethanol 200 proof | Various | ||
Antibodies | |||
anti Arl13b | Protein Tech | 17711-1-AP | Suggested concentration 1:1000 |
anti acetylated tubulin (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | Suggested concentration 1:800 |
anti gamma tubulin (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | Suggested concentration 1:200 |
anti Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | Suggested concentration 1:500 |
Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | Suggested concentration 1:1000 |
Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | Suggested concentration 1:1000 |
anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | Suggested concentration 1:250 |
anti Gαi3 | Sigma-Aldrich | G4040 | Suggested concentration 1:250 |
Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:300-1000 |
Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:300-1000 |