Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.
In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.
cilia primarie sono lunghe appendici microtubuli-based che si estendono dalla superficie della maggior parte delle cellule di mammifero. cilia primaria sono spesso confusi con cilia motilità, di cui ci sono sempre di più per cella, e il cui scopo è quello di spostare il fluido attraverso le superfici della membrana. cilia primaria, in contrasto, adottare ruoli sensoriali e sono quindi anche denominato cilia come sensoriale. Una volta lungo dimenticato, questo organello stato recentemente 'riscoperto' a causa della sua associazione con una moltitudine di malattie genetiche umane 1. Idealmente posizionato come un organello segnalazione, il ciglio primario è stato dimostrato che regolano numerose vie di segnalazione, molti dei quali sono importanti non solo nella omeostasi tissutale e la malattia, ma anche durante lo sviluppo 2.
Una delle prime vie di segnalazione dimostrato di essere associato con una disfunzione delle ciglia è stata la via di segnalazione Wnt non canonico, conosciuta anche come la polarità planare delle cellule (PCP) percorso <sup > 3. Questa cascata di segnali inizialmente identificata in Drosophila, è fondamentale per l'embriogenesi; in particolare per processi di convergenza ed estensione e per il corretto orientamento delle cellule nel piano di epiteli 4. La segnalazione sequenziale di un nucleo insieme di proteine regolatrici traduce indicazioni direzionali che in definitiva portano a riarrangiamenti del citoscheletro e determinano la polarizzazione coordinata di cellule epiteliali in un piano 5. Il processo di convergenza ed estensione è assolutamente necessaria per il condotto cocleare per allungare e per una corretta patterning cellulare 6. Dato che questo è regolato attraverso l'attivazione del pathway PCP, uno dei fenotipi più suggestivi della coclea mutanti PCP è un condotto cocleare accorciato con disorganizzato epiteli sensoriali 7. Allo stesso modo, i mutanti di topo, che mancano di cilia, mostrano anche una tale convergenza ed estensione fenotipo 8,9, anche se con precisione come questo è regolata ancora da chiarire.
ve_content "> Poiché i processi di convergenza ed estensione sono fondamentali per la conseguenza del condotto cocleare, e patterning cellulare del epiteli sensoriali all'interno del condotto cocleare, la coclea in via di sviluppo è un organo ideale in cui esaminare la segnalazione PCP durante lo sviluppo dei vertebrati. L'organo di Corti, il termine dato al dell'epitelio sensoriale specializzato che le linee del condotto cocleare, è composto di cellule di supporto non-sensoriali e cellule ciliate meccanosensoriali che devono essere orientati in modo uniforme per la coclea di funzionare 10. le cellule ciliate meccanosensoriali sono così chiamati a causa della fasci stereociliary che si estendono dalla piastra cuticolare (superficie apicale) di ciascuna cella capelli sensoriale 11. Questi agiscono come trasduttori primari di mechanosensation e nonostante loro nomenclatura come stereocilia, sono in realtà costituiti da actina modificato microvilli filamento-based. da ogni capelli a forma di chevron fascio, tre file di stereocilia sono organizzati in un pa altamente ordinata e regolaresag o ma in un modo simile-scalinata. Reale cilia microtubuli base, kinocilia chiamati, sono necessari per lo sviluppo e l'orientamento dei fasci stereociliary 12. Su ogni cella di capelli, una singola kinocilium è fisicamente collegato al fascio stereocilia, in posizione centrale adiacente alla più alta fila di stereocilia. La funzione precisa della kinocilium non è chiara, e uno ipotesi è che la kinocilium 'tira' stereocilia in forma man mano che maturano da microvilli 12. Nei vertebrati, kinocilia nella coclea sono presenti solo transitoriamente e si ritraggono dalle cellule ciliate nei topi prima della comparsa di sentire 11,13,14.Completa perdita delle ciglia nello sviluppo risultati coclea in condotti cocleari severamente accorciati, mis-formato e mis-orientato bundle stereociliary, così come corpi basali mis-posizionati 8,9. Un cilium funzionale non è solo composto dal axoneme ciliare. Molte proteine associate con ciliafunzione di verifica in complessi localizzate a sottodomini cilia-correlate, quali il corpo basale, zona di transizione, o ciliare axoneme 15. Il corpo basale, derivato dalla centriolo madre del centrosoma, è anche un centro microtubuli organizzando per microtubuli che si estendono lontano dal ciglio nel corpo cellulare e può regolare il traffico intracellulare e il traffico ciliare. La zona ciliare transizione è un'altra regione in cui la funzione ciliare è regolata in termini di organizzazione importazione ed esportazione di composti ciliari 16.
Diversi studi hanno identificato un legame tra ciglia e Wnt non canonica (segnalazione PCP), anche se il meccanismo preciso non è chiaro 17. Ridondanza di ciliari e PCP geni e la sensibilità della polarità delle cellule di anomalie cellulari generalizzate, rendono difficile per collegare direttamente una mutazione a deficit specifici PCP. Uno dei outs di lettura di segnalazione PCP è il posizionamento del corpo basale e primary cilium, quindi segregare il primario dai difetti secondari è impegnativo. Alcuni studi in zebrafish e topo mutanti hanno suggerito alcuna connessione tra le ciglia e Wnt segnalazione 18-20. Le discrepanze nei dati possono riflettere specie, tessuto, o le differenze temporali-dipendente dei contributi ciliari verso segnalazione Wnt. Inoltre, normale risposta Wnt potrebbe essere mantenuta se i corpi basali rimangono funzionale. Uno sguardo più in profondità il ruolo delle proteine ciliari nei percorsi di segnalazione cellulare e altri fenomeni biologici è fondamentale per la nostra comprensione della biologia cellulare e dello sviluppo, nonché per lo sviluppo di strategie terapeutiche mirate.
Quando si prepara il tessuto cocleare per l'analisi, ci sono alcuni punti chiave da tenere a mente. In primo luogo, le differenze di background genetico possono modificare il fenotipo cocleare, rendendo necessario analizzare e confrontare solo i controlli littermate. In secondo luogo, la rimozione completa della membrana tectorial è necessaria per ottenere le migliori immagini con immunoistochimica ed è essenziale per SEM. La membrana tectorial è una struttura opaca e può oscurare le cellule dell'epitelio se…
The authors have nothing to disclose.
L'autore ringrazia Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer e Zoe Mann e per la loro valutazione critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dalla Sofja Kovalevskaya Award (Humbodlt Foundation) e l'Università Johannes Gutenberg-, Mainz, Germania.
Tools/Equipment | |||
Silicone elastomere – Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | See Note 2 |
Micro dissecting scissors-straight blade | Various | ||
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps | Various | ||
Dissecting microscope. | Various | ||
Uncoated glass microscope slides | Various | ||
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | Various | ||
Transfer pipettes | Various | ||
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
SEM sample holder | tousimis | 8762 | |
Scanning electron microscopy studs | TED PELLA | 16111 | |
PELCO Tabs: Carbon adhesive | TED PELLA | 16084-3 | |
Fluorescent Microscope | Various | ||
Critical Point Dryer | Various | ||
Scanning Electron Microscope | Various | ||
Glass microscope slides | Various | ||
Glass coverslips | Various | ||
Kimwipe Tissue | Various | ||
Fine Paint Brush | |||
Reagents | |||
1× Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
Paraformaldehyde (PFA) (EM Grade Required for EM) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM. | |
2.5% Glutaraldehyde Grade1 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Tris-HCl (pH 7.5) | Various | ||
NaCl | Various | ||
CaCl 2 | Various | ||
Triton X-100 | Various | ||
Normal Goat Serum | Various | ||
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Ethanol 200 proof | Various | ||
Antibodies | |||
anti Arl13b | Protein Tech | 17711-1-AP | Suggested concentration 1:1000 |
anti acetylated tubulin (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | Suggested concentration 1:800 |
anti gamma tubulin (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | Suggested concentration 1:200 |
anti Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | Suggested concentration 1:500 |
Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | Suggested concentration 1:1000 |
Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | Suggested concentration 1:1000 |
anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | Suggested concentration 1:250 |
anti Gαi3 | Sigma-Aldrich | G4040 | Suggested concentration 1:250 |
Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:300-1000 |
Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:300-1000 |