Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.
In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.
Primära cilier är långa mikrotubuli baserade bihang som sträcker sig från ytan av de flesta däggdjursceller. Primära cilier är ofta förväxlas med motila cilier, av vilka det finns alltid multipel per cell, och vars syfte är att flytta vätska över membranytorna. Primära cilier, däremot anta sensoriska roller och följaktligen också kallas sensorisk cilier. När sedan länge glömda, denna organell har nyligen "återupptäckte" som ett resultat av dess association med en mångfald av genetiska sjukdomar 1. Idealiskt läge som en signaleringsorganell, har den primära cilium visats reglera många signalvägar, av vilka många är viktiga inte bara i vävnad homeostas och sjukdom, men också under utveckling 2.
En av de första signalvägar visat sig vara associerade med flimmerhår dysfunktion var icke-kanoniska Wnt-signalväg, även känd som den plana cell polaritet (PCP) vägen <sup > 3. Detta signalkaskad som ursprungligen identifierats i Drosophila, är avgörande för embryogenes; särskilt för konvergens- och förlängningsprocesser och för korrekt orientering av celler i planet för epitel 4. Den sekventiella signaleringen av en kärna av regulatoriska proteiner översätter riktnings ledtrådar som slutligen leder till cytoskelettala omflyttningar och resulterar i en samordnad polarisering av epitelceller i ett plan 5. Processen för konvergens och förlängningen är absolut nödvändig för cochlea kanalen för att förlänga och korrekt cellulär mönstring 6. Eftersom detta regleras via aktivering av PCP vägen, en av de mest slående fenotyper av cochlea PCP mutanter är en förkortad cochlea kanal med oorganiserad sensoriska epitel 7. På samma sätt, mus mutanter, som saknar cilier, också uppvisar en sådan samstämmighet och förlängning fenotyp 8,9, men exakt hur detta regleras återstår att klargöras.
ve_content "> Eftersom konvergens och förlängnings processer är avgörande för utväxt av cochlea kanalen, och cellulär mönstring av den sensoriska epitel i cochlea kanalen, är utvecklings snäckan en idealisk organ där för att undersöka PCP signalering under ryggradsdjur utveckling. organ Corti, beteckningen för den specialiserade sensoriska epitel som linjer cochlea kanalen, består av icke-sensoriska stödjande celler och mechanosensory hårcellerna som skall vara jämnt orienterade för snäckan att fungera 10. de mechanosensory hårcellerna är så kallad på grund av den stereociliary buntar som sträcker sig från den cuticular plattan (apikala yta) för varje sensorisk hårcell 11. Dessa fungerar som primära omvandlarna i mechanosensation och trots deras nomenklatur som sinneshår faktiskt består av modifierat aktin filamentbaserade mikrovilli. Inom varje chevron-formad hår bunt, tre rader av sinneshår organiseras på ett mycket beställt och regelbundna pattern i en trappa liknande sätt. Real mikrotubuli-baserad cilier, benämnda kinocilia, krävs för att utveckla och orientering stereociliary buntarna 12. Vid varje hårceller, är en enda kinocilium fysiskt ansluten till sinneshår bunt, som ligger centralt i anslutning till den högsta raden av sinneshår. Den exakta funktion kinocilium är oklar, och en hypotes är att kinocilium "drar" den sinneshår i form som de mognar från mikrovilli 12. Hos ryggradsdjur, kinocilia i snäckan är endast närvarande transient och dra tillbaka från hårcellerna i möss före uppkomsten av hörsel 11,13,14.Total förlust av cilier i utvecklings cochlea resulterar i kraftigt förkortade cochlea kanaler, mis-bildade och mis-orienterad stereociliary buntar, liksom mis-placerade basala kroppar 8,9. En funktionell cilium är inte bara består av strålkroppen axoneme. Många proteiner associerade med cilierfunktion förekommer i komplex lokaliserade till cilier relaterade domäner såsom basala kropps, övergångszon eller ciliär axoneme 15. Den basala kropps, som härrör från moder centriol av centrosom, är också en mikrotubuli organiserande centrum för mikrotubuli som sträcker sig bort från cilium i cellkroppen och kan reglera intracellulära handel samt ciliär trafficking. Strålkroppen övergångszonen är en annan region där ciliära funktionen regleras i fråga om att organisera import och export av ciliära föreningar 16.
Flera studier har identifierat ett samband mellan cilier och icke-kanoniska Wnt (PCP signalering), även om den exakta mekanismen är oklar 17. Redundans ciliära och PCP gener och känsligheten hos cell polaritet av allmänna cellulära abnormiteter, gör det svårt att direkt koppla en mutation till PCP specifika underskott. En av de avläsningar av PCP-signalering är placeringen av den basala kroppen och Primary cilium därför avskilja den primära från sekundära defekter är utmanande. Vissa studier i zebrafisk och mus mutanter har föreslagit något samband mellan cilier och Wnt signalering 18-20. Skillnader i data kan spegla art, vävnad, eller tidsberoende skillnader i ciliära bidrag till Wnt signalering. Dessutom kan normala Wnt lyhördhet behållas om basala kroppar vara funktionella. En djupare inblick i rollen av ciliära proteiner i cellulära signaleringsvägar och annat biologiskt fenomen är avgörande för vår förståelse av cellulär och utvecklingsbiologi, samt för att utveckla målinriktade behandlingsstrategier.
Vid framställning av cochlea vävnad för analys, finns det några viktiga punkter att tänka på. För det första kan skillnader i genetisk bakgrund ändra cochlea fenotypen, vilket gör det nödvändigt att analysera och jämföra endast kull kontroller. För det andra är fullständigt avlägsnande av takhinnan krävs för att uppnå de bästa bilderna med immunohistokemi och är avgörande för SEM. Takhinnan är en ogenomskinlig struktur och kan skymma cellerna i det sensoriska epitelet direkt under den, vilket g…
The authors have nothing to disclose.
Författaren vill tacka Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer och Zoe Mann och för kritisk bedömning av manuskriptet. Detta arbete har finansierats av Sofja Kovalevskaya Award (Humbodlt Foundation) och Johannes-Gutenberg University Mainz, Tyskland.
Tools/Equipment | |||
Silicone elastomere – Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | See Note 2 |
Micro dissecting scissors-straight blade | Various | ||
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps | Various | ||
Dissecting microscope. | Various | ||
Uncoated glass microscope slides | Various | ||
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | Various | ||
Transfer pipettes | Various | ||
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
SEM sample holder | tousimis | 8762 | |
Scanning electron microscopy studs | TED PELLA | 16111 | |
PELCO Tabs: Carbon adhesive | TED PELLA | 16084-3 | |
Fluorescent Microscope | Various | ||
Critical Point Dryer | Various | ||
Scanning Electron Microscope | Various | ||
Glass microscope slides | Various | ||
Glass coverslips | Various | ||
Kimwipe Tissue | Various | ||
Fine Paint Brush | |||
Reagents | |||
1× Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
Paraformaldehyde (PFA) (EM Grade Required for EM) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM. | |
2.5% Glutaraldehyde Grade1 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Tris-HCl (pH 7.5) | Various | ||
NaCl | Various | ||
CaCl 2 | Various | ||
Triton X-100 | Various | ||
Normal Goat Serum | Various | ||
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Ethanol 200 proof | Various | ||
Antibodies | |||
anti Arl13b | Protein Tech | 17711-1-AP | Suggested concentration 1:1000 |
anti acetylated tubulin (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | Suggested concentration 1:800 |
anti gamma tubulin (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | Suggested concentration 1:200 |
anti Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | Suggested concentration 1:500 |
Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | Suggested concentration 1:1000 |
Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | Suggested concentration 1:1000 |
anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | Suggested concentration 1:250 |
anti Gαi3 | Sigma-Aldrich | G4040 | Suggested concentration 1:250 |
Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:300-1000 |
Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:300-1000 |