Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Utvärdering av Planar-Cell-polaritet fenotyper i Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Published: February 21, 2016 doi: 10.3791/53559
Automatic Translation
1
1Cell and Matrix Biology, Institute of Zoology, Johannes Gutenberg-Universität Mainz

Introduction

Primära cilier är långa mikrotubuli baserade bihang som sträcker sig från ytan av de flesta däggdjursceller. Primära cilier är ofta förväxlas med motila cilier, av vilka det finns alltid multipel per cell, och vars syfte är att flytta vätska över membranytorna. Primära cilier, däremot anta sensoriska roller och följaktligen också kallas sensorisk cilier. När sedan länge glömda, denna organell har nyligen "återupptäckte" som ett resultat av dess association med en mångfald av genetiska sjukdomar 1. Idealiskt läge som en signaleringsorganell, har den primära cilium visats reglera många signalvägar, av vilka många är viktiga inte bara i vävnad homeostas och sjukdom, men också under utveckling 2.

En av de första signalvägar visat sig vara associerade med flimmerhår dysfunktion var icke-kanoniska Wnt-signalväg, även känd som den plana cell polaritet (PCP) vägen > 3. Detta signalkaskad som ursprungligen identifierats i Drosophila, är avgörande för embryogenes; särskilt för konvergens- och förlängningsprocesser och för korrekt orientering av celler i planet för epitel 4. Den sekventiella signaleringen av en kärna av regulatoriska proteiner översätter riktnings ledtrådar som slutligen leder till cytoskelettala omflyttningar och resulterar i en samordnad polarisering av epitelceller i ett plan 5. Processen för konvergens och förlängningen är absolut nödvändig för cochlea kanalen för att förlänga och korrekt cellulär mönstring 6. Eftersom detta regleras via aktivering av PCP vägen, en av de mest slående fenotyper av cochlea PCP mutanter är en förkortad cochlea kanal med oorganiserad sensoriska epitel 7. På samma sätt, mus mutanter, som saknar cilier, också uppvisar en sådan samstämmighet och förlängning fenotyp 8,9, men exakt hur detta regleras återstår att klargöras.

ve_content "> Eftersom konvergens och förlängnings processer är avgörande för utväxt av cochlea kanalen, och cellulär mönstring av den sensoriska epitel i cochlea kanalen, är utvecklings snäckan en idealisk organ där för att undersöka PCP signalering under ryggradsdjur utveckling. organ Corti, beteckningen för den specialiserade sensoriska epitel som linjer cochlea kanalen, består av icke-sensoriska stödjande celler och mechanosensory hårcellerna som skall vara jämnt orienterade för snäckan att fungera 10. de mechanosensory hårcellerna är så kallad på grund av den stereociliary buntar som sträcker sig från den cuticular plattan (apikala yta) för varje sensorisk hårcell 11. Dessa fungerar som primära omvandlarna i mechanosensation och trots deras nomenklatur som sinneshår faktiskt består av modifierat aktin filamentbaserade mikrovilli. Inom varje chevron-formad hår bunt, tre rader av sinneshår organiseras på ett mycket beställt och regelbundna pattern i en trappa liknande sätt. Real mikrotubuli-baserad cilier, benämnda kinocilia, krävs för att utveckla och orientering stereociliary buntarna 12. Vid varje hårceller, är en enda kinocilium fysiskt ansluten till sinneshår bunt, som ligger centralt i anslutning till den högsta raden av sinneshår. Den exakta funktion kinocilium är oklar, och en hypotes är att kinocilium "drar" den sinneshår i form som de mognar från mikrovilli 12. Hos ryggradsdjur, kinocilia i snäckan är endast närvarande transient och dra tillbaka från hårcellerna i möss före uppkomsten av hörsel 11,13,14.

Total förlust av cilier i utvecklings cochlea resulterar i kraftigt förkortade cochlea kanaler, mis-bildade och mis-orienterad stereociliary buntar, liksom mis-placerade basala kroppar 8,9. En funktionell cilium är inte bara består av strålkroppen axoneme. Många proteiner associerade med cilierfunktion förekommer i komplex lokaliserade till cilier relaterade domäner såsom basala kropps, övergångszon eller ciliär axoneme 15. Den basala kropps, som härrör från moder centriol av centrosom, är också en mikrotubuli organiserande centrum för mikrotubuli som sträcker sig bort från cilium i cellkroppen och kan reglera intracellulära handel samt ciliär trafficking. Strålkroppen övergångszonen är en annan region där ciliära funktionen regleras i fråga om att organisera import och export av ciliära föreningar 16.

Flera studier har identifierat ett samband mellan cilier och icke-kanoniska Wnt (PCP signalering), även om den exakta mekanismen är oklar 17. Redundans ciliära och PCP gener och känsligheten hos cell polaritet av allmänna cellulära abnormiteter, gör det svårt att direkt koppla en mutation till PCP specifika underskott. En av de avläsningar av PCP-signalering är placeringen av den basala kroppen och Primary cilium därför avskilja den primära från sekundära defekter är utmanande. Vissa studier i zebrafisk och mus mutanter har föreslagit något samband mellan cilier och Wnt signalering 18-20. Skillnader i data kan spegla art, vävnad, eller tidsberoende skillnader i ciliära bidrag till Wnt signalering. Dessutom kan normala Wnt lyhördhet behållas om basala kroppar vara funktionella. En djupare inblick i rollen av ciliära proteiner i cellulära signaleringsvägar och annat biologiskt fenomen är avgörande för vår förståelse av cellulär och utvecklingsbiologi, samt för att utveckla målinriktade behandlingsstrategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Använd och avliva alla djur i enlighet med institutionella och statliga riktlinjer och regler, oftast via CO2 inandning och halsdislokation.

1. Beredning av reagenser

OBS: Före början, förbereda alla reagenser som använder kemikalier av analyskvalitet. Gör lösningar med molekylärbiologisk kvalitet destillerat och avjoniserat vatten om inte annat anges.

  1. Fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS): Gör en liter 1x PBS genom att lösa 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 och 0,24 g KH 2 PO 4 i 1 liter H2O Justera pH till 7,4 med HCl. PBS behöver inte vara steril och kan lagras vid RT. Observera att denna buffert görs utan CaCl2 eller MgCl2.
  2. Paraformaldehyd (4% PFA): Förbered en 4% lösning av PFA i 1x PBS i ett ventilerat dragskåp. Lägg 40 g paraformaldehyd pulver till 1 liter 1x PBS. För att lösa upp, rör om och värm till ca 60 ° C,och tillsätt långsamt NaOH drop klokt att höja pH. När pulvret har lösts upp, justera pH till 7,4 med HCI. Filtrera genom ett 0,45 pm filter och frysa portioner. Avfrosta en färsk alikvot för varje experiment.
  3. Triton-buffert: Bered en 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100-lösning genom att lösa 8,77 g NaCl i 1 L av 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5). Tillsätt 1 ml Triton X-100. Rör om för att lösa upp. Store Triton-buffert vid RT.
  4. Triton block: Bered 10% getserum i Triton buffert genom att tillsätta 1 ml getserum till 9 ml Triton buffert. Lagra vid 4 ° C. Vid användning av primära antikroppar framkallade i mus, tillsätt get anti-mus IgG Fab-fragment i en spädning av 1 i 200 till Triton blocket för blockeringssteget.
    OBS: Om du tänker använda prover för svepelektronmikroskop (SEM), förbereda ytterligare reagens som anges nedan.
  5. Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med kalcium och magnesium: Gör en 1x lösning av HBSS genom utspädning från en förrådslösningi sterilt destillerat H2O Som HBSS buffert är komplicerat att göra och det finns risker, är det lämpligt att beställa en färdiga 10x stamlösning. Den slutliga koncentrationen av HBBS buffert som rutinmässigt används är följande: 1,26 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2 -6H2O, 0,41 mM MgSO 4 -7H2O, 5,33 mM KCl, 0,44 mM KH 2 PO 4, 4,17 mM NaHCOs 3, 137,93 mM NaCl , 0,34 mM Na 2 HPO 4, 5,56 mM dextros.
  6. Hepes buffert: Förbered en 0,1 M Hepes-lösning i 1x HBSS, genom att lösa 23,8 g HEPES i en L 1x HBSS buffert.
  7. Svepelektronmikroskopi fixativ (SEM Fix): Förbered fixativ för SEM genom utspädning elektronmikroskopi grade glutaraldehyd (2,5%) och paraformaldehyd (4%) i Hepes-buffert. Lägga CaCl2 till en slutlig koncentration av 10 mM.
  8. 1% Osmiumtetroxid (OSO4) i Hepes buffert; 1% Osmiumtetroxid i vatten: Späd en stamlösning av osmiumtetroxid i Hepes-buffert, och separately i sterilt destillerat H2O, till en slutlig koncentration av 1%. Osmiumtetroxid är mycket giftigt och är oftast säljs som en 4% lösning.
  9. 1% (vikt / volym) Garvsyra: Lös 0,5 g garvsyra i 50 ml sterilt destillerat H2O Filter sterilisera genom filtrering genom ett 0,45 porstorlek filter.
  10. Graderad etanollösning serien: Späd 200 proof etanol med sterilt destillerat H2O för att göra 30, 50, 70, 90 och 95% etanollösningar. Under de sista etanolsköljningar, är 100% etanol 200 bevisning som krävs. Använd en nyöppnad flaska av 200 proof etanol för de slutliga sköljningar.

2. Val av Tissue

  1. Helst undersöker embryon eller unga valpar i åldrarna embryonala dag 16,5 (E16.5) och postnatal dag 3 (P3).
    OBS: benbildning i benlabyrinten och tids ben gör dissektion progressivt mer utmanande som möss mogna. Även kinocilia, den enda sanna mikrotubuli-baserad cilium finns på cochlea hårceller,dras under utveckling och är inte längre förekommer i vuxna möss.
  2. Efter fixering, Avkalka vuxna hörselsnäckor. Placera dissekerade (se avsnitt 3) beniga labyrinter, i två ml EDTA (4,13% i PBS), pH 7,3, i ett mikrocentrifugrör för 3 - 4 dagar med rotation. Fylla EDTA dagligen. Efter vävnaderna har mjuknat, skölj i 1,5 ml eller mer PBS 3 gånger under 5 min på en nutator med ökad omrörning.

3. Cochlea Dissection

  1. Post eutanasi via halsdislokation eller CO 2 inandning (100% CO 2), ta bort huvudet. Använda ett skalpellblad eller liten sax, beroende på storleken av djuret, för att dissekera huvudet längs den sagittala mitt linje från näsan och sträckande sig kaudalt. Ta bort hjärnan från varje halva av skallen med en pincett. Identifiera de tidsmässiga ben, som innehåller utvecklings beniga labyrinter i innerörat (se pilen i figur 1A).
  2. Använd ett par förCEPS att noggrant isolera beniga labyrinter från skallen (temporala ben). Gör detta under ett dissektionsmikroskop. Bänd bort benvävnad från skallen genom att köra pincett försiktigt under de beniga labyrinter. Hos djur upp till P4 beniga labyrinter är fortfarande brosk och kan lätt tas bort utan att brista.
  3. Efter dissektion, använd spetsen på dissekera pincett för att rensa den ovala och runda fönster och göra ett litet hål i spetsen av cochlea spiralen. Fäst beniga labyrinter innan ytterligare dissektion av cochlea kanalen. För att möjliggöra enkel borttagning av takhinnan (se 3.7), fixera beniga labyrinter i 1,5 ml 4% PFA under 5 minuter på is.
    OBS: Om avlägsnande av takhinnan inte krävs, är längre fixering rekommenderas (se 4,1-4,3). Kortfattad fixering av de tidsmässiga ben före dissektion av cochlea kanalen underlättar dissektion processen och avlägsnande av takhinnan. Post dissekering och exponering av organ Corti, furthennes fixering krävs.
  4. Ytterligare dissekera beniga labyrinter för att exponera cochlea sensoriska epitel på följande sätt. Placera beniga labyrint i en svart silikon elastomer-belagda dissekera skål innehållande PBS för att underlätta dissektion. Använda minutien stift för att immobilisera vävnad om det behövs. Om du vill använda minutien stift, placera dem genom vestibulära delen av beniga labyrinter med den ventrala aspekten av cochlea spiralen uppåt.
    OBS: Svart silikon elastomer maträtt: Blanda silikon elastomer baskomponenten med kolpulver för att erhålla en ogenomskinlig svart färg. Lägga härdaren och häll i en eller flera petriskålar (glas eller plast). Torka under vakuum för att avlägsna inneslutna luftbubblor. Torra rätter helt före användning.
  5. Använd fin pincett (# 5) för att avlägsna den yttre brosk utsätta cochlea kanalen. Börja på ovala fönstret; för in den nedre spetsen av tången i det ovala fönstret och försiktigt bända upp brosk, rör sig långsamt uppåt motapex.
  6. Efter exponering av cochlea kanalen, avlägsna den ventrala ytan, Reissner membran. Använd en fin pincett för att nypa Reissner membran vid basen av cochlea kanalen och dra av det i en uppåtgående rörelse. Visualisera rygg aspekt av cochlea kanalen, inklusive sensoriska epitel.
  7. Ta takhinnan som beskrivs nedan (tillval). För SEM eller immunohistokemi av kinocilium eller stereociliary buntar bort takhinnan.
  8. Använda en mycket fin pincett (# 55 eller finare) att nypa takhinnan vid basen av snäckan och dra uppåt mot apex.
    OBS! Takhinnan är optiskt klara, vilket gör det svårt att identifiera. Oftare än inte membranet lossnar i ett stycke och även om det inte är lätt att visualiseras, kan man känna motstånd när den dras bort från den exponerade organ Corti.
  9. Efter exponering av organ Corti, ytterligare fixera vävnaden som described nedan. Behåll vestibulära regionen för att underlätta ytterligare beredning av vävnader.

4. Fixering

  1. För regelbunden immunhistokemi fastställa dissekerade beniga labyrinten i 1,5 ml 4% PFA vid 4 ° C på en nutator under 2 h.
    OBS: På grund av känsligheten hos olika antikroppar och antigener, variationer i längden och sammansättningen av fixering kan krävas och bör optimeras för varje antikropp.
  2. Efter fixering, tvätta proverna genom sköljning i 1,5 ml eller mer PBS 3 gånger under 5 min på en nutator med ökad omrörning. Prover kan förvaras i PBS vid 4 ° C under flera veckor före bearbetning.
  3. Om att förbereda prover för SEM, fixa dissekeras tids ben i SEM fix (se 1,7) under 2 h vid RT. Tvätta genom sköljning i 1,5 ml eller mer Hepes buffert 3 gånger i 5 minuter på en nutator med ökad omrörning. Butik i Hepes-buffert vid 4 ° C tills vidare bearbetning. Lagring under längre tid än ett par veckors rekommenderas inte.

5. Immunohistokemi

  1. Utför immunohistokemi på dissekerade prover i en brunn i en flatbottnad platta med 96 brunnar. Alternativt kan man använda PCR eller mikrocentrifugrör. Det är lämpligt att behålla den vestibulära delen av benlabyrinten att underlätta bearbetning.
  2. Permeabilize vävnaden genom inkubering i 1,5 ml Triton buffert under 1 h vid RT på en nutator under försiktig omrörning.
  3. Blockera vävnaden genom inkubering i 0,5 ml Triton blocket under ett minimum av en timme vid RT. Vid användning av primära antikroppar framkallade i mus, tillsätt anti-mus-IgG Fab-fragment till blocket vid en utspädning av 1 i 200 (se avsnitt 1.4). Detta minskar kraftigt icke-specifik bindning av anti-mus-IgG mot mus vävnad.
  4. Inkubera vävnaden med primära antikroppar utspädda i Triton-block O / N vid 4 ° C under försiktig omrörning. Antikroppsutspädning beror på antikroppar som används (se avsnitt 6.1). Alternativt inkubera primära antibodies under 2 h vid RT. Helst använder en minimivolym av 0,5 ml primär antikropp utspädning. Om antikroppen är begränsad, använd den minsta volymen av utspädnings antikropp som helt omsluter vävnaden.
  5. Tvätta vävnaden genom sköljning i 1,5 ml eller mer Triton buffert, minst 3 gånger under 15 minuter, på en nutator med ökad agitation.
  6. Inkubera vävnaden med fluorescerande färgämnes-konjugerad sekundära antikroppar utspädda hos tillverkarna rekommenderade koncentrationen (typiskt 1: 200 till 1: 1000) i Triton-block under 1 h vid RT på en nutator. Använd en minimivolym av 0,5 ml sekundär antikropp utspädning.
    1. Centrifugera den utspädda sekundär antikropp vid 13.000 xg under 3 min före användning för att minimera icke-specifik bindning av sekundära aggregat antikropps. Skydda vävnad från ljus från detta steg framåt för att undvika fotoblekning av fluorescerande färgämnen.
  7. Såsom i steg 5,5, tvätta vävnaden genom sköljning i 1,5 ml eller mer Triton buffert, minst 3 gånger i 15 min, på ennutator med ökad omrörning. Förvara proverna i PBS vid 4 ° C tills den ska montera.

6. Antikropp Selection

OBS: Källan rekommenderade antikroppar och deras utspädningar listas i tabellen av specifika material och utrustning. Utför inkubationer antikropps som beskrivs i avsnitt 5.

  1. Att visualisera mikrotubuli baserade kinocilium, använd en ciliär axoneme markör såsom anti-Arl13b (1: 1000) eller anti-acetylerad-α-tubulin (1: 800). Visualisera den basala kroppen med hjälp av en antikropp mot γ-tubulin (1: 200) eller någon annan centrosomal markör.
  2. Att visualisera aktin filamentrika stereociliary buntar, tillsätt phalloidin (1: 300 - 1000) konjugerad till en av flera olika fluoroforer till den sekundära antikroppen inkubation. Phalloidin etiketter även andra fintrådiga aktin strukturer inklusive de kortikala aktinfilament som omger periferin av varje epitelceller hårceller. Detta är till hjälp vid fastställandetkonturerna av varje hårstrå cell. Använd en alternativ membranmarkör såsom anti-Zo-1 (1: 500) om det behövs.
  3. Märk cochlea hårceller med hjälp av antikroppar mot myosin VI (1: 1000) eller myosin VIIa (1: 1000). Dessa kan användas om bedömningen snäckan längd.

OBS: Använd lämpliga fluorescerande färgämne-konjugerad sekundära antikroppar optimerade kraven mikroskop.

7. Montering och Imaging

  1. Placera provet i en svart silikon elastomer skål innehållande PBS. Med fin pincett, ta bort vestibulära region från cochlea spiralen.
  2. Mycket försiktigt bort den underliggande brosk och mesenkym från cochlea spiralen. Den återstående cochlea spiralen innehåller inre sulcus, Cortis organ och yttre sulcus.
  3. Överföra cochlear spiral i en droppe PBS placerades på ett objektglas. Om så önskas, separera cochlea spiralen i bitar motsvarande ett varv. Detta steg är inte nödvändigt dock, och kan leda till loss av vävnaden. Apikala yta (stereocilier sidan) av cochlea hårcellerna ska vara vänd uppåt mot täck.
  4. Veke bort PBS med ett adsorberande vävnad eller bit filterpapper och försiktigt flytta cochlea spiralen om epitel har skiftat och överlappar på sig själv.
  5. Tillsätt en droppe monterings media direkt på snäckan provet och försiktigt placera ett täck på toppen, var noga med att undvika luftbubblor. Inga distanser krävs; placera täckglas direkt på provet. Ett vattenlösligt, icke-fluorescerande, semi-permanent monteringsmedel som inte kräver ytterligare åtgärder för att hålla täckglaset på plats rekommenderas. Monterings media och täck tjocklek bör anpassas till mikroskop specifikationer.
  6. Använd en epifluorescent eller laserskanning konfokalmikroskop utrustad med hög förstoring (63 - 100X), hög numerisk bländare (1,2-1,4) mål för att ta bilder av den apikala ytan av cochlea hårceller. användning lower mål (5 - 20X) för att ta överlappande bilder av cochlea spiralen att kvantifiera längden av cochlea kanalen. Match excitation laser och emissionsfilter till fluoroforer som används för sekundära antikroppar.

8. Svepelektronmikroskopi

  1. Fortsätt från avsnitt 4.3. Efter tvättning SEM fasta prover i Hepes buffert, utföra följande stegen under ventilation. Följande protokoll fungerar bra för cochlea vävnad och undviker användningen av sputterbeläggning med en ledande metall.
  2. Post-fix i 1% OSO4 i Hepes-buffert under 1 h, följt av 3 tvättningar med 1 ml destillerat vatten i 5 min vardera. Den minsta volymen av OSO4, som fullständigt omsluter den vävnad bör användas för att minimera giftigt avfall. Någon agitering krävs.
  3. Inkubera proverna vid RT i var och en av följande lösningar för en timme med 3 tvättar med 1 ml destillerat vatten i 5 minuter vardera i mellan steg: 1% Garvsyra nybakade i vatten och filtrerade före användning; 1% OSO4 i vatten, 1% garvsyra i vatten, 1% OSO4 i vatten.
  4. Torka prov genom en graderad etanolserie genom inkubation under 10 minuter i vardera av följande utspädningar: 30, 50, 70, 90, och 95%. Någon agitering krävs.
  5. Överför prov genom tre förändringar, 5 minuter vardera, av 100% etanol (från en nyöppnad flaska av 200 proof etanol).
  6. Köra proverna though en kritisk punkt tork följande tillverkarens instruktioner.
  7. Montera prover med ledande kol lim ovanpå en SEM stöta före avbildning på ett elektronmikroskop. Under en stereomikroskop, använd ett par fina pincett och en pensel för att försiktigt placera provet med cochlea epitel uppåt. Använd vestibulära del av provet till "ankare" vävnaden till stubben. Förvara proverna i en exsickator tills avbildning. Utför SEM avbildning som beskrivs i Jones (2012) 21.

9.Kvantifiering

  1. Efter immunohistokemi förberedelse förvärva bilder med hjälp av en epifluorescent eller laserskanning konfokalmikroskop. Efter förberedelse för SEM, använda ett svepelektronmikroskop för att avbilda proven. Bild den apikala ytan av organ Corti med de exponerade cochlea hårceller och inskjutna stödceller.
  2. Definiera specifika positioner längs cochlea kanalen, såsom 25, 50, och 75% från basen och använda dessa för att jämföra cochlea regioner mellan muterade och kontrollprover. Analysera och jämföra flimmerhår mutanter med sina kull kontroller, eftersom skillnaderna i genetisk bakgrund kan ändra cochlea fenotypen.
    OBS: organ Corti utvecklar i en gradient som sträcker sig från mitten av basen mot både spetsen och basen. I musen är utvecklingen inte fullständig förrän P14, så det är viktigt att jämföra regioner på liknande utvecklingsstadier och positioner.
  3. Ta bilder med programmet som medföljer mikroskopet som allow för kvantifiering av den speciella fenotypen efter behov (se nedan). Använd mjukvara för bildanalys som Bild J eller mjukvara medföljer mikroskop för att mäta längder, räkna celler och bestämma proteinlokalisering som beskrivs nedan. Diagram dessa data som ett stapeldiagram, punktdiagram, box blot eller histogram jämföra mutant jämfört med kontrollen.
  4. Total längd på cochlea kanalen (Figur 3A):
    1. Med hjälp av en hår cellmarkör eller falloidin, (som markerar stereociliary buntar), bestämma och mäta där sensoriska epitel börjar och slutar. Längden på cochlea kanalen ofta förkortas flimmerhår mutanter.
  5. Stereociliary bunt abnormaliteter (Figur 3B, D, E, G):
    1. Mäta bunt konvexitet (höjd) som det kortaste avståndet mellan vertex av knippet och den linje som sträcker sig genom båda ändarna av bunten 'armar' såsom visas i fig 3G, vänster. Alternativt, kvantifiera områdetomfattas av armarna på yttre hårceller stereociliary bunt som visas i figur 3G, höger. Om hårcellerna med cirkulära stereociliary buntar kan identifieras räkna dessa som en procentandel av den totala hårceller.
      OBS: I många ciliära mutanter kan observeras oavsett bunt orientering bunt avvikelser. Det är svårt att exakt kvantifiera stereociliary bunt abnormaliteter.
  6. Orienteringen av de stereociliary knippen (figur 3B, C, G):
    1. Bedöma orienteringen av varje enskild bunt i förhållande till en linje som sträcker sig vinkelrätt mot raden av pelaren celler som separerar de inre och yttre hårceller. Celler med en normal orientering är inriktade utmed denna vinkelräta axlar och så har en rotation av 0 °. Bestäm rotationsvinklar med hjälp av antingen en 360 ° notation eller som absoluta avvikelser från 0 °.
  7. Kinocilia positionering eller stereociliary bunt positionering (Figur3B, F, H):
    1. Räkna den procentuella andelen celler i vilka kinocilia saknas. Mäta avståndet från den kinocilium till "vertex" eller centrum av knippet. Den "vertex" av bunten kan inte vara lätt att definiera om buntar är onormal, och så i mitten av bunten kan användas i stället.
  8. Kvantifiera positionen för kinocilia och stereociliary buntar på den apikala hår cellytan, genom att överlagra en positions gallret på varje hårstrå cell och som markerar platsen för antingen basen av kinocilium eller vertex / centrum av den stereociliary bunt. Visa data som en andel av varje kategori som ligger inom en specifik region av nätet, och genom att lägga platserna för varje markering på en positions rutnät.
    OBS: I kontrollvävnader, kinocilia alltid fäst vid vertex stereociliary bunt. I cilier mutanter är kinocilia ofta saknas, mislocalized ändå fäst, eller helt fristående från stereociliary bunt.
  9. Kinocilia längd (Figur 3I):
    1. Mät längden på kinocilium genom att märka med en flimmer axoneme markör. Bara mäta kinocilia som ligger plant i en 1,5 um konfokala plan. Bekräfta att cilier är ligger platt genom att observera ett tvärsnitt av den scannade vävnaden. Jämföra åldern matchade prover från samma region av snäckan eftersom kinocilium dras tillbaka under utvecklingen.
  10. Mislocalization av polaritet proteiner:
    1. Efter immunhistokemi med användning av antikroppar mot polaritet proteiner såsom Vangl2 och Gαi3, bestämma lokalisering via avbildning.

OBS: I vissa cilier mutanter, är lokalisering av polaritet proteiner störs. Dessa inkluderar Vangl2 och Gαi3, vilka har visats att avbrytas i Ift20, Bbs8 och Bbs6 mutant snäckan.

OBS: Ytterligare exempel på hur man kan kvantifiera och visa hårceller Polarity kan återfinnas i följande papper. Curtin, et al. (2003) Current Biology 22, Montcouquiol, et al. (2003) Nature 7, Wang, et al (2006) The Journal of Neuroscience 23, Montcouquiol, et al. (2008) Methods in Molecular Biology 24, maj-Simera, et al. (2012) Methods in Molecular Biology 25, Yin et al (2012) PLoS ONE 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cochlea Dissection och Vävnadsberedning

Efter avlägsnande av hjärnan, post mittlinje sagittala dissektion av en P0 mus huvudet, benlabyrinten, sedd bakifrån, kan visualiseras (figur 1 A, vit pil) och tas bort. Figur 1B visar de isolerade beniga labyrinter med cochlea hår uppåt, ventrala, (vänster) och bakifrån, rygg (till höger). De vita pilen pekar på det ovala fönstret från vilken man kan börja ta bort den yttre brosk. När den yttre brosk har tagits bort, fortfarande intakt, kan observeras (Figur 1C) den exponerade cochlea kanalen,. Positionering av en tapp genom det vestibulära regionen för att bistå dissektion visas. Två stift, lämnade i olika vinklar kan också användas för att förankra vävnad. Figur 1D visar cochlea kanalen efter avlägsnande av Reissner '; S membran och takhinnan (vänster) och den isolerade cochlear epiteliala spiral när det väl har isolerats från det vestibulära regionen som förberedelse för montering för immunohistokemi (höger). För att ge en allmän uppfattning om vad den exponerade cochlea hår ser ut som en intakt SEM preparatet visas i figur 1E.

Morfologi och Immunofluorescens på Kontroll Cochlea

Efter framställning av cochlea vävnaden, är den dorsala ytan av cochlea kanalen innehåller organ Corti exponerade och kan visats via SEM eller immunofluorescerande färgning. Totalt sett monterade förberedelse, kan de fyra raderna av mechanosensory hårceller (en rad av inre hårceller och tre rader av yttre hårceller) urskiljas. Figur 2A visar en låg förstoring bild av basal varv från en embryonal mus snäckan , beredd feller SEM. Notera enhetlig orientering och inriktning av aktin baserade stereociliary buntar. Dessutom morfologin hos stereociliary knippena är konsekvent, varje bunt har den klassiska ")" (på inre hårcellerna) eller "W" (på yttre hårceller) form. Vid närmare förstoringen i den här åldern ytterligare mikrovilli kan ses inte bara på den apikala ytan av hårcellerna, men också i-mellan hårcellerna på stödjande celler (Figur 2B). Dessa kommer att avta vilket innebär att endast tre rader av stereociliary buntar på de yttre hårcellerna och två på de inre hårcellerna hos vuxna. Såsom kan ses i figur 2C (vit pil) används en enda mikrotubuli baserad kinocilium (en sann primär cilium) belägen intill den högsta raden av sinneshår vid vertex av varje stereociliary bunt. Dessa är kopplade till bunten via kinocilia länkar.

Fluorescerande märkning med falloidin, vilket labels aktin belyser enhetlig orientering och form av buntarna i kontrollvävnad (Figur 2D). Kortikala aktin är också märkt, vilket är användbart för att bestämma den apikala omkretsen av varje enskilt hårstrå cell. Co-märkning med falloidin och en antikropp mot myosin 7a (figur 2E), en hårceller markör, bidrar också till att skilja mellan hårceller och stödceller. Myosin 7a är också en användbar markör för att mäta cochlear kanalförlängningen (se figur 3A). En antikropp mot acetylerade-α-tubulin är vanligen används för att identifiera den mikrotubuli baserade kinocilium (Figur 2F). Som stödceller hyser också primära cilier, är det viktigt att skilja mellan cilier härrör från hårcellerna vs. interkalerande stödceller. En ytterligare membran markör såsom antikroppar mot ZO-1 (Zona occludens 1), som tydligt beskriver mosaik mönstring av det apikala membranet i cochlea kanalen, är därför bra (<strong> Figur 2F). Av ytterligare övervägande är att antikroppar mot acetylerade-α-tubulin märka också interna mikrotubuli och så försiktighet bör iakttas när avbildning att fokusera på håret cell apikala ytan. Mikrotubuli i pelaren celler är särskilt täta (figur 2G, vit asterisk). En kombination av falloidin och anti-acetylerade-α-tubulin märkning används ofta för att samtidigt identifiera stereociliary buntar och grann kinocilia (figur 2G, vit pil).

Cochlear fenotyp i Cilia mutanter

Förlängning av cochlea kanalen är ett av de bästa avläsningar av konvergens- och förlängnings defekter, och förkortade cochlea kanaler är vanliga i klassiska mutanter PCP. Snäckan i ciliära mutanter ofta förkortat cochlea ledningar och visar en markant breddning av sensoriska epithelia vid spetsen, som kan setts i Ift20 cko / CKO-möss (Figur 3A). En annan klassisk PCP fel är störningar i enhetlig orientering av cochlea hårceller, som kan ses i Bbs8 - / - möss både med immunohistokemi (Figur 3B, höger pil) och SEM (Figur 3C). Förutom mis-orienterade knippen, tillplattade och deformerade knippen också vanligt förekommande (Figur 3B, mitt pil; Figur 3D). Ofta gånger cirkulära knippen, som kan setts i Figur 3E, är närvarande, särskilt i hårcellerna helt saknar kinocilia. Mis-lokalisering av kinocilium är också vanligt.

Mis-lokaliserade kinocilium kanske eller kanske inte vara fäst vid stereociliary bunt (Figur 3B, vänsterpil, Figur 3F). Exempel på hur man kvantifiera bundle orientering och kinocilia eller bunt placering visas i figur 3G och 3H. Orienteringen av varje individuellt knippe kan sedan bedömas genom att bestämma rotationen av den av knippet i förhållande till en linje som sträcker sig vinkelrätt mot raden av pelaren celler som separerar de inre och yttre hårceller. Celler med en normal orientering är i linje längs denna vinkelräta axeln och så har en rotations 0 ° (figur 3G). Placeringen av kinocilium, eller mitten av stereociliary bunt, kan ritas genom att lägga en läges rutnät på lumenytan av hårceller och sedan bestämma placeringen av kinocilia eller bunt i nätet (Figur 3I). Mutationer i flimmerhår gener påverkar ofta cilier längd, och så kan bedömas längd kinocilium. I Cep290 rd16 / rd16 mutanter, kinocilia är längre än i kontrollerna (figur 3J). Som cilium inåt,det är viktigt att ha åldersmatchade kullsyskon och för att göra mätningar från samma region av snäckan. För att få bra bilder för analys och kvantifiering, både immunohistokemi och SEM, är det viktigt att ta bort takhinnan. Figur 3F visar en SEM där takhinnan inte har tagits bort helt.

Figur 1
Figur 1. Dissekering av ett utvecklings mus Cochlea (P0). (A) mittlinje sagittala dissektion av P0 mus huvudet med hjärnan bort. De vita pilen pekar på positionen för benlabyrinten. (B) ventrala (vänster) och rygg (höger) utsikt över dissekerade beniga labyrinter. Snäckan ligger mot toppen med vestibulära delen längst ner vit pil pekar på den ovala fönstret. (C) Den benlabyrinten akteruter avlägsnande av yttre brosk av snäckan. Ett stift har placerats genom vestibulära systemet. (D) Vänster, samma vy som i C efter avlägsnande av Reissner membran och takhinnan. Höger, isolerad cochlea kanal redo för montering. (E) Svepelektronmikrofotografi av en intakt, exponerad cochlear spiral exponera golvet i cochlea kanalen, inklusive det sensoriska epitelet. Skala bar är 100 pm. . (A - D) anpassad från maj-Simera et al, 2012 25 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Morfologi och immunofluorescens på Kontroll Cochlea (A - C). Svepelektronmikrofotografier av de basala turn i embryonala (E18.5) vildtyp hörselsnäckor. En rad av inre hårceller (botten) och tre rader av yttre hårceller (överst) separeras och inskjutna av stödceller. V-formiga stereociliary buntar orientera likformigt mot den laterala kanten av varje hårceller (övre kanten av bilden). Vid E18.5 ytterligare mikrovilli täcka de apikala ytorna av hårceller, nedanför stereociliary buntar, och inskjutna stödceller (B). (C) En enda mikrotubuli-baserad kinocilium (vit pil), ligger vid vertex bunten, som visas här från sidokanten. (D - G) immunofluorescerande färgning av basala tur postnatal dag 1 (P1) vildtyp hörselsnäckor. Falloidin etiketter filamentöst aktin i stereocilier och kortikala aktin vid cellperiferin (D, E, G). Myosin 7a är en markör för inre och yttre hårceller (E). Zo_1 märker tight junctions i-mellan celler, vilket gör det till ett utmärkt markör för att särskilja cell boundaRies (F). Acetylerade α-tubulin användes som en markör för kinocilium vid vertex av knippet (F, G vit pil). Interna mikrotubuli är också märkt av acetylerade α-tubulin, som är särskilt rikligt förekommande i pelaren celler (G vit asterix). Skala barer A: 10 pm, B: 5 pm, C: GD 1 pm,. 5 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Cochlear Fenotyp i Cilia Mutanter. (A) Märkt förkortning av Ift20 cko / CKO cochlear kanaler jämfört med kontroll. Dissekerade cochlear kanaler vid E18.5 färgas med acetylerad tubulin. (B Bbs8 - / - mutant (P0). Falloidin-märkt fintrådiga aktin, sinneshår (röd), acetylerad tubulin, kinocilia (grön). Stereociliary buntar i Bbs8 - / - hörselsnäckor är variabelt roteras (högerpil), tillplattad och / eller mislocalized (mitten pil). Kinocilia är mislocalized eller axonemes saknas (vänster pil). (C - F) Högre förstoring SEM av stereociliary buntar och kinocilia i Bbs8 - / - OHCs. I C, roteras buntar, i D, tillplattade knippe, i E, cirkulära knippen och i F mislocalized kinocilia. (G - I) schematiska representationer av bunt abnormitet kvantifiering. (G) Vänster, bunt konvexitet (höjd); det kortaste avståndet mellan vertex av knippet och den linje som sträcker sig genom båda ändarna av bunten 'vapen ". som depicted med den heldragna svarta linjen. Höger, området under bunten; området. (H) schematiska representationer av de kriterier som används för att kvantifiera orientering stereociliary buntar. Rotationsvinkeln av bunten beräknas i förhållande till en linje som sträcker sig vinkelrätt mot raden av pelaren celler. (I) Schematisk representation av kriterierna för positions analys av kinocilia och stereociliary buntar. En segmenterad galler läggs över omkretsen av håret cellen och positionen noterades. (J) Högre förstoring bild av falloidin-märkt stereocilier buntar (röd) och acetylerade tubulin-märkta kinocilia (grön) av yttre hårceller i P0 snäckan. I den intilliggande monokromatisk panel, röda linjer identifiera kinocilia, som är längre i Cep29 rd16 / rd16 mutanter jämfört med kontroll (vita pilar). (K) SEM-mikrograf av embryonala snäckan med ofullständigt avlägsnande av takhinnan. Skalabarer A: 100 um, B: 5 pm, C - F: 2,5 pm, I: 5 pm, J: 50 pm. (A - F)... Modifierad från maj-Simera et al, 2015 8, J Reprint med tillstånd från Rachel et al, 2012 27 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vid framställning av cochlea vävnad för analys, finns det några viktiga punkter att tänka på. För det första kan skillnader i genetisk bakgrund ändra cochlea fenotypen, vilket gör det nödvändigt att analysera och jämföra endast kull kontroller. För det andra är fullständigt avlägsnande av takhinnan krävs för att uppnå de bästa bilderna med immunohistokemi och är avgörande för SEM. Takhinnan är en ogenomskinlig struktur och kan skymma cellerna i det sensoriska epitelet direkt under den, vilket gör avbildning mer utmanande. Då och då under bearbetning, kan takhinnan krympa tillbaka, avslöja hårcellerna. Även i dessa fall avlägsnande rekommenderas starkt. Detta steg kräver tålamod och praxis. För det tredje kan immunohistokemi med användning av antikroppar mot ciliära proteiner, i synnerhet de som lokaliserar till högkompakterad basala kropps, vara utmanande och kräver optimering. Överväga att utföra antigenåtervinning, intensifiera permeabilsation steg, eller minskning av koncentrationen eller tidpunkten för fixering. Slutligen, när avbildning av kinocilium (den primära cilium finns på cochlea hårceller) tänk på att det börjar att dra tillbaka från P0 - P1 framåt i en bas-till-apex gradient. Därför är det viktigt vid mätning av längden av kinocilium att jämföra hårcellerna från samma region av snäckan och i åldersmatchade djur. De inskjutna stödceller har också primära cilier, som inte dras. Man måste vara försiktig för att skilja mellan stöd cell cilier och hårceller kinocilia.

Som möss mognar, blir det allt svårare att rent isolera cochlea sensoriska epitel, på grund av förkalkning i tiden ben och beniga labyrinter. Avkalkning av vävnaden krävs, vilket inte alltid är förenliga med ytterligare immunlokalisering tekniker men tillåter för undersökning av brutto fenotyp och är även kompatibel med SEM förberedelse. Inavlad mus strains uppvisar ofta hörselskador såsom hårceller förlust eller förhöjda auditiva hjärnstammen svar (ABRS), på grund av mutationer i kända hörsel gener eller modifieringsgener. Därför är det viktigt att jämföra åldersmatchade kullkontroller eller avla på en alternativ genetisk bakgrund.

En av begränsningarna av denna analys är att, i möss, börjar kinocilium att dra tillbaka efter förlossningen och inte längre föreligger på vuxna hårceller. Av denna anledning kinocilia mätningar endast kan göras för att utveckla vävnad. Det är också nödvändigt att noggrant välja åldersmatchade kontroller för jämförelser mellan muterade och kontrollprover. En annan begränsning är att strålkroppen muterade möss analyseras hittills inte visa allvarlig hörsel dysfunktion (dvs., Auditiva hjärnstammen svar, ABRS eller otoakustiska emissioner, OAEs) även när cochlea utveckling försämras. I överensstämmelse med detta, hörsel defekter är inte ett vanligt humant ciliopathy fenotyp. I undantagsfall, förlust av hörseg är en av de primära funktionerna i Alströms syndrom, som orsakas av mutationer i de basala kroppsproteinet ALMS1 28,29. Detta tyder på att stereociliary bunt morfologi inte nödvändigtvis knuten till hörsel dysfunktion hos cilier mutanter, sannolikt på grund av korrigerande omorientering av buntar senare i utvecklingen som har rapporterats för Vangl2 CKO mutanter 30. Om ciliopathy spektrumet vidgas till att omfatta Usher syndrom är den vanligaste medfödda orsaken till dövblindhet, då hörsel dysfunktion blir mycket relevant. Nya data har visat att flera proteiner i samband med Ushers syndrom lokalisera också till cilium och är involverade i ciliära relaterade processer 31, men om dessa proteiner avser PCP signalering har ännu inte granskats.

Fram till nu har de flesta ciliär mus mutanter analyserades för cochlea PCP fel har endast vagt undersökts. De tekniker som beskrivs i detta manuskript möjliggöra en omfattande detaljer avcochlea fenotyp, som utan tvekan kommer att leda till en mer exakt förståelse av ciliär inblandning i upprättandet ryggradsdjur PCP signalering. Trots det stora antalet modeller ciliopathy mus som har förvånansvärt få analyserats i termer av cochlea PCP defekter. En vanlig fallgrop i samband med dessa modeller är embryonal dödlighet. Eftersom emellertid den utveckla snäckan kan undersökas i embryonal rollen av cilier i PCP i utvecklings örat kan fortfarande undersökas. Vidare kan mycket tidig embryonal dödlighet kringgås med användning av villkorliga knockouts. Foxg1 Cre 32 möss, tillgängliga från JacksonLaboratories, används vanligtvis för att inactivategenes av intresse i thedeveloping innerörat från E8.To Hittills har ansträngningarna fokuserat primärt på att undersöka sjukdomsalstrande ciliopathy gener men utforskning av andra cilier relaterade proteiner och hur dessa påverkar PCP signalering under utveckling kan ge större insikt i CILia biologi och funktion.

Om man misstänker en auditiv fenotyp i musmodeller som analyseras, eventuella ytterligare analyser inkluderar hörselprov av ABRS 33 eller OAEs 34. Cochlear explantatet förlängningsanalyser (såsom beskrivs i May-Simera et al., 2012 25), kan också utföras och möjliggöra identifiering av konvergenta förlängnings defekter i tidigare utvecklings tidpunkter. Odling av cochlea explants möjliggör också behandling med olika signal aktivatorer eller hämmare, som kan ändra explantation förlängning och därigenom bidra till mekanistisk förståelse av utvecklings processerna. Även om det är känt att den kinocilium dras tillbaka efter födseln 11,13,14, denna indragning har inte blivit grundligt behandlats i samband med ciliära mutanter. Det skulle vara intressant att ta tidsspecifika mätningar av kinocilia uppkomst och indragning av cilier mutants.Considering att en primär roll för ciliär proproteiner är transport av gods längs mikrotubuli, det är mycket troligt att dessa proteiner också kan reglera aspekter av intracellulära handel längs cytoskelettet 35-37. En undergrupp av cilier proteiner har visats påverka trafficking och asymmetrisk lokalisering av PCP molekyler 8. Lokalisering av immunohistokemi av PCP-molekyler, speciellt membranassocierade proteiner såsom Vangl2, Frz3 och Dsh, rekommenderas därför att fastställa om PCP molekyler mislocalized. Fastställande av polaritet verkar vara en mångfacetterad angelägenhet, och det finns allt starkare bevis för en extra cell autonom väg, vilket också krävs för korrekt PCP i sensoriska hårceller 38. En nyligen papper visade att G-proteinberoende signalering styr migreringen av cilie i en cell-självständigt sätt 39. I överensstämmelse med en roll för ciliära proteiner i lokaliseringen av polaritet molekyler, hetero G-protein alfa-i subenheten 3 (Gαi3) localization störs i Bbs8 och Bbs6 knockout cochlea 8,39.

Skilja roll enskilda ciliära komponenter och deras distinkta effekter på PCP-signalering kommer att ge oss större insikt i den roll som cilie i upprättandet korrekt polaritet. Av särskild betydelse är att skilja mellan ciliära proteiner fungerar i en flimmer sammanhang, jämfört med icke-ciliära funktioner av tradition ansetts ciliära proteiner, såsom deras roll i regleringen av icke-ciliary relaterade intracellulära handel. Den höga graden av regelbundenhet i många aspekter av cochlea struktur, inbegripet cell mönstring och stereociliary bunt orientering, gör det möjligt att upptäcka subtila förändringar i utvecklingen av PCP som svar på antingen genetiska eller molekylära störningar i cilier relaterade proteiner. Med tanke på att det finns många modeller ciliär mus tillgängliga, och att utveckla musen snäckan är ett av de bästa ställena att undersöka PCPsignalering, är det av stort intresse att lära sig i vilken utsträckning enskilda proteinmutationer störa cochlea utveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Författaren vill tacka Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer och Zoe Mann och för kritisk bedömning av manuskriptet. Detta arbete har finansierats av Sofja Kovalevskaya Award (Humbodlt Foundation) och Johannes-Gutenberg University Mainz, Tyskland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tools/Equipment
Silicone elastomere - Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761028-5EA See Note 2
Micro dissecting scissors-straight blade Various
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps Various
Dissecting microscope. Various
Uncoated glass microscope slides Various
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) Various
Transfer pipettes Various
Minutien pins  Fine Science Tools 26002-10
SEM sample holder tousimis 8762
Scanning electron microscopy studs TED PELLA 16111
PELCO Tabs: Carbon adhesive TED PELLA 16084-3
Fluorescent Microscope Various
Critical Point Dryer Various
Scanning Electron Microscope Various
Glass microscope slides Various
Glass coverslips Various
Kimwipe Tissue  Various
Fine Paint Brush
Reagents
1× Phosphate buffered saline (PBS) Gibco/Life Technologies 10010023
Paraformaldehyde  (PFA) (EM Grade Required for EM) Various Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM.
2.5% Glutaraldehyde Grade1 Sigma-Aldrich G5882
Tris-HCl (pH 7.5) Various
NaCl Various
CaCl 2 Various
Triton X-100 Various
Normal Goat Serum Various
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-007-003
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech 0100-01
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco/Life Technologies 14065
Hepes Gibco/Life Technologies 15630-080
Osmium tetroxide (OsO4 ) Sigma-Aldrich/Fluka Analytical 75632
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Ethanol 200 proof Various
Antibodies
anti Arl13b Protein Tech 17711-1-AP Suggested concentration 1:1,000
anti acetylated tubulin (611-B1) Sigma-Aldrich T6793 Suggested concentration 1:800
anti gamma tubulin (GTU-88) Sigma-Aldrich T6557 Suggested concentration 1:200
anti Zo_1  Invitrogen 40-2300 Suggested concentration 1:500
Myosin VI Proteus Biosciences 25-6791 Suggested concentration 1:1000
Myosin VIIa Proteus Biosciences 25-6790 Suggested concentration 1:1,000
anti Vangl2 Merk Millipore ABN373 Suggested concentration 1:250
anti Gαi3 Sigma-Aldrich G4040 Suggested concentration 1:250
Alexa Fluor® 488 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12379 Suggested concentration 1:300 - 1,000
Alexa Fluor® 568 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12380 Suggested concentration 1:300 - 1,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  2. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1, 7 (2012).
  3. Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).
  4. Ezan, J., Montcouquiol, M. Revisiting planar cell polarity in the inner ear. Seminars in cell & developmental biology. 24, 499-506 (2013).
  5. Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways. Cell. 131, 1378 (2007).
  6. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37, 980-985 (2005).
  7. Montcouquiol, M., et al. Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals. Nature. 423, 173-177 (2003).
  8. May-Simera, H. L., et al. Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea. Development. 142, 555-566 (2015).
  9. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nat Genet. 40, 69-77 (2008).
  10. Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hearing research. 22, 117-146 (1986).
  11. Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Development of the hair bundle and mechanotransduction. The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).
  12. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse. J. Neurocytol. , 821-835 (1999).
  13. Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates. Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).
  14. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse. Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).
  15. van Dam, T. J., et al. The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium. Cilia. 2, 7 (2013).
  16. Blacque, O. E., Sanders, A. A. Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease. Organogenesis. 10, 126-137 (2014).
  17. Wallingford, J. B., Mitchell, B. Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia. Genes & development. 25, 201-213 (2011).
  18. Borovina, A., Ciruna, B. IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development. Cell reports. 5, 37-43 (2013).
  19. Huang, P., Schier, A. F. Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia. Development. 136, 3089-3098 (2009).
  20. Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo. PloS one. 4, e6839 (2009).
  21. Jones, C. G. Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM. Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).
  22. Curtin, J. A., et al. Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse. Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).
  23. Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).
  24. Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).
  25. May-Simera, H., Kelley, M. W. Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).
  26. Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development. PloS one. 7, e31988 (2012).
  27. Rachel, R. A., et al. Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis. J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).
  28. Jagger, D., et al. Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity. Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).
  29. Collin, G. B., et al. The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway. PloS one. 7, e37925 (2012).
  30. Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).
  31. Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies. Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).
  32. Hebert, J. M., McConnell, S. K. Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures. Dev Biol. 222, 296-306 (2000).
  33. Willott, J. F. Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B (2006).
  34. Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C (2006).
  35. Finetti, F., et al. Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse. Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).
  36. Sedmak, T., Wolfrum, U. Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina. J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).
  37. Yuan, S., Sun, Z. Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia. Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).
  38. Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells. Developmental cell. 27, 88-102 (2013).
  39. Ezan, J., et al. Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton. Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).

Tags

Medicin Primary Cilia Kinocilium Planar Cell polaritet Cochlea mus hårcellerna sinneshår Wnt signalering
Utvärdering av Planar-Cell-polaritet fenotyper i Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

May-Simera, H. Evaluation of… More

May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. J. Vis. Exp. (108), e53559, doi:10.3791/53559 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter