Generera Primär fibroblastkulturer från mus Öron och Tail Vävnader
Summary
Vi beskriver en enkel och snabb försöksförfarande för generering av primära fibroblaster från öronen och svansar av möss. Förfarandet kräver ingen speciell djurträning och kan användas för generering av fibroblastkulturer från öronen som lagrats vid rumstemperatur under upp till 10 dagar.
Abstract
Primärceller härrör direkt från vävnad och tros vara mer representativ för den fysiologiska tillstånd av celler in vivo än etablerade cellinjer. Men primära cellkulturer har oftast en begränsad livslängd och måste ofta återinföras. Fibroblaster är en lättillgänglig källa av galvaniska element. Här diskuterar vi ett enkelt och snabbt experimentella förfarande för att fastställa primära fibroblastkulturer från öron och svansar av möss. Protokollet kan användas för att etablera primära fibroblastkulturer från öronen lagrade vid RT under upp till 10 dagar. När protokollet följs noggrant, är osannolika trots användningen av icke-steril vävnad lagras under längre tid i vissa fall föroreningar. Fibroblaster förökar sig snabbt i kultur och kan utökas till betydande antal innan de genomgick replika åldrande.
Introduction
Primära celler härrör från levande vävnad och odlas under in vitro betingelser. Det antas allmänt att primära celler liknar närmare det fysiologiska tillståndet och genetisk bakgrund av den vävnad från vilken de härrör än odödliga eller tumörcellinjer 1. Av den anledningen, galvaniska element utgör en användbar modell för att studera biologiska frågor 2,3. Men till skillnad från etablerade cellinjer som växer på obestämd tid, primära celler genomgå småningom åldrande i kultur och måste ofta återinföras.
Vanligen använda primära celler innefattar fibroblaster, epitelceller, endotelceller, T-celler, B-celler, benmärgshärledda makrofager (BMDM) och benmärgshärledda dendritiska celler (BMDC). Fibroblaster är ofta utnyttjas som primär cellkulturmodell. De erbjuder viktiga fördelar jämfört med andra primära celler. Cellkulturer lätt etablerade, lätt underhållna och kräver ingen purification av celler före odling. De har snabb initial spridning och inga krav på specialiserade medium eller aktiveringsprotokoll. Fibroblaster kan effektivt transfekteras med hjälp av biologiska, kemiska och fysikaliska protokoll 4,5. Det finns en möjlighet att lagra öron för upp till 10 dagar vid RT före upprättandet cellkulturer. Fibroblastkulturer bidrar till visualisering av cytoplasmatiska processer och lämpar sig för omprogrammering i inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) 6.
Fibroblaster är viktiga celler i bindväv som utsöndrar kollagen proteiner och extracellulära matrix 7. De ger den strukturella ramen i många vävnader 8 och spelar en viktig roll vid sårläkning och vävnadsreparation 9,10.
Här beskriver vi en enkel och snabb (<4 h) protokollet för att upprätta fibroblastkulturer från öron och svansar av möss 11. Protokollet kräver minimal muserfarenhet för att skörda vävnader (i motsats till andra protokoll 12,13) och kan användas för att etablera kulturer från öronen lagrade i medium vid RT under upp till 10 dagar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här ger vi en enkel, billig och snabb experimentella förfarande för att fastställa primära fibroblastkulturer från öron och svansar av möss. Extraktionen bör resultera i vidhäftande och snabbt delande fibroblaster inom 3 dagar efter isolering av vävnaden. En viktig begränsning av galvaniska element är åldrande, en permanent tillväxtstopp 15. Med hjälp av protokollet, kan fibroblastkulturer passerats i 5 till 6 gånger innan fibroblaster blir åldrande, vilket indikeras av en flackare celler, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE – Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.
Materials
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. J Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
- Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).
- Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).
- Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
- Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
- Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).
- Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
- Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).
