Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

High Yield Ekspression af rekombinant human Proteiner med transient transfektion af HEK293-celler i suspension

Published: December 28, 2015 doi: 10.3791/53568
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

ERRATUM NOTICE

Abstract

Kunsten at producere rekombinante proteiner med komplekse post-translationelle modifikationer er en stor udfordring for studier af struktur og funktion. Den hurtige etablering og høj nyttiggørelse fra kortvarigt transficeret pattedyrcellelinier adresser denne barriere, og er et effektivt middel til at udtrykke proteiner, som er naturligt kanaliseres gennem ER og Golgi-medieret sekretorisk vej. Her er en protokol for proteinekspression anvendelse af den humane HEK293F og HEK293S cellelinier transficeret med en mammal ekspressionsvektor konstrueret til høje proteinudbytter. Anvendeligheden af ​​dette system demonstreres ved hjælp af tre repræsentative glycoproteiner, der har givet udtryk for med udbyttet mellem 95-120 mg renset protein udvundet per liter kultur. Disse proteiner er den humane FcγRIIIa og rotte α2-6 sialyltransferase ST6GalI, begge udtrykt med en N-terminal GFP fusion, samt umodificeret humant immunoglobulin G1 Fc. Denne robust system UTIlizes et serum-frit medium, der er passende til ekspression af isotopisk beriget proteiner og kulhydrater til strukturelle studier ved hjælp af massespektrometri og kernemagnetisk resonansspektroskopi. Desuden kan sammensætningen af ​​N-glycan indstilles ved tilsætning af et lille molekyle for at undgå visse glycan ændringer på en måde, der ikke mindsker udbyttet.

Introduction

Producerer høje udbytter af passende foldede og posttranslationelt modificerede humane proteiner til detaljeret analyse af struktur og funktion er fortsat en stor udfordring. Et stort antal ekspressionssystemer er tilgængelige, der producerer rekombinante proteiner med nativ-lignende funktion og opførsel. Bakterielle ekspressionssystemer, hovedsagelig Escherichia coli stammer, repræsenterer de mest tilgængelige og almindeligt anvendte værktøjer i forskning arena, på grund af enkelheden af disse ekspressionssystemer, selvom gær-, plante-, insekt- og mammale systemer er også beskrevet 1-4. Men de fleste af disse systemer er i stand til passende post-translationel modifikation af målproteiner. En grundlæggende interesse for Barb og Moremen laboratorier producerer eukaryote proteiner med passende glycosylering. Mange humane proteiner kræver passende glykosylering for korrekt funktion (se 5).

Den eukaryoteglycosylerings maskiner er omfattende og i stand til at gøre en bred vifte af ændringer, herunder både asparagin (N) - og serin / threonin (O) -bundet komplekse glykaner 6. Det anslås, at> 50% af humane proteiner er N-glycosyleret 7. Glykaner er væsentlige elementer i mange proteiner, herunder terapeutiske monoklonale antistoffer, erythropoietin, og blod koagulationsfaktorer som faktor IX, for at nævne et par stykker. Selvom flere metoder eksisterer for at forberede passende N-glycosylerede proteiner og spænder fra rent syntetisk 8-10, at chemoenzymatic 11-14 eller nyttiggørelse fra manipuleret rekombinante systemer 15-20, ikke overraskende, har menneskelige ekspressionssystemer hidtil vist sig at være den mest robuste metoder til at generere humane proteiner.

Mange terapeutiske humane glycoproteiner fremstillet i rekombinante systemer, der anvender pattedyrceller. Systemer af note er den kinesiske hamster ovarie (CHO), musemyelom (NS0), Baby Hamster Kidney (BHK), humane embryonale Nyre (HEK-293) og human retinale cellelinier, der er ansat i vedhæftning eller suspension kultur til proteinproduktion 4,21,22. Imidlertid har pattedyrprotein ekspressionssystemer kræves dannelse af stabile cellelinier, dyre vækstmedier og substrat assisteret transfektion procedurer 23.

Pattedyrcelle transfektion opnås ved hjælp af talrige midler, herunder calciumphosphater 24,25, kationiske polymerer (DEAE-dextran, polybren, polylysin, polyethylimin (PEI)) eller positivt ladede kationiske liposomer 26-29. PEI er en polykationisk, opladet, lineær eller forgrenet polymer (25 kDa) 26, der danner et stabilt kompleks med DNA og endocytose. Efter syrning af endosomet, er PEI syntes at svulme op, hvilket fører til sprængning af endosomer og frigivelse af DNA'et i cytoplasmaet 26,30.

Indtil for nylig, forbigående transfektion i suspensiom kultur blev udført ved forudgående DNA / PEI kompleksdannelse efterfulgt af tilsætning til cellekulturen 29. Men Würm og medarbejdere rapporterede en yderst effektiv protokol optimeret til rekombinant proteinproduktion i HEK293-celler, der dannede et DNA / PEI-kompleks in situ 31,32. Dette undgås fremstilling, sterilisering af komplekset, og bufferudskiftning i et dyrkningsmedium. Yderligere optimering ved at inkludere udtryk-styrke plasmider førte til betydelige rentestigninger 33. Heri er en fremgangsmåde, der bygger på disse fremskridt og er bredt anvendelig. Ekspressionsbetingelser kan også ændres for at påvirke den N-glycan sammensætning.

Den HEK293S cellelinje, med en gendeletion der stopper N-glycan behandling på et mellemstadium, fører til ekspression af proteiner med ensartede N-glycaner bestående af 2 N-acetylglucosamin rester plus fem mannoserester (Man 5 GIcNAc 2) 34, 35. Disse cellermangler den N-acetylglucosaminyltransferase I (GNTI) gen, som er nødvendig for downstream N-glycan behandling 36,37. Anvendelsen af glycosyltransferase inhibitorer herunder kifunensine, sialinsyrereceptorer analoger og fucose analoge og 2-deoxy-2-fluor-fucose har lignende virkninger, og grænser N-glycan forarbejdning 38-41.

Protokollen rapporterede her anvender pGEN2 vektoren som vist i figur 1 42,43, PEI assisteret transient transfektion i mammale cellelinjer (HEK293F eller HEK293S celler), og genvinding af høje udbytter af passende glycosyleret protein. Dette system er robust og kan rumme forskellige faktorer, herunder isotop mærkning og glycan teknik til produktion af store titere af rekombinante proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol er tilstrækkelig til udtryk ved hjælp af enten HEK293F eller HEK293S celler.

1. Cell Etablering

  1. Kultur Podning
    Bemærk: Alle manipulation procedurer kultur skal udføres i en BSL-2 facilitet og hvert element bringes ind i biosikkerhed kabinet skal steriliseres ved at sprøjte med en 70% ethanol i vand løsning.
    1. Betjene inkubatorryster ved 135 rpm, 80% fugtighed og ved 8,0% CO2 og 37 ° C. Slå "on" UV-lampen i biosikkerhed kabinet mindst 1 time før arbejde. Forvarm de forseglede Medium A og mellemstore B flasker i vandbad ved 37 ° C i 1 time.
    2. Sterilisere 125 ml Erlenmeyer-vækst kolber med en ventileret hætte, pipetter, pipetter og forvarmede Media flasker ved at sprøjte med 70% ethanol i vand løsning. Placer disse emner i biosikkerhed kabinet. Bemærk: Steriliseres kun den ydre plast dækker 125 ml Erlenmeyer-kultur kolbe, og fjern derefter kun når det jegs inde i biosikkerhed kabinet.
    3. For en 30 ml kultur, trække 26 ml medium A og 3 ml medium B (10% af den endelige kultur) og overføres til 125 ml Erlenmeyer-kolbe og kultur bland forsigtigt ved omrystning (herefter betegnes som frisk dyrkningsmedium).
    4. Overførsel et hætteglas af celler, der indeholder HEK293F celler, nedfrosset ved -80 ° C, på is, og flytte til kulturen værelse. Bemærk: HEK293F celler leveres ved en densitet på 1 x 10 7 celler / ml.
    5. Varm hætteglasset forsigtigt i vandbad ved 37 ° C for delvis at tø cellerne (det tager cirka en minutter og cellerne bør ikke være helt optøet). Steriliser ydersiden af ​​hætteglasset med 70% ethanol i vandig opløsning og flytte den ind i det biosikkerhed kabinettet.
    6. Anvendelse af 1 ml pipette, trække cellesuspensionen (ca. 0,7 ml) og overføres til 125 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende 29 ml frisk dyrkningsmedium. Luk dækslet af kulturen kolben og flytte den ind i det inkuberet rysteapparat.
    7. Cell Vedligeholdelse: Kontroller celle Density, levedygtighed og cellepassager
      1. Kontroller celler tæthed efter 24 timer af optøning af kulturen ved at følge protokollen nedenfor. Note: Celler dyrkes i 24 timer efter optøning for at sikre væsentlige celler vækst og levedygtighed> 80%.
      2. Steriliser dyrkningskolben med 70% ethanol i vandig opløsning og flytte den ind i det biosikkerhed kabinettet.
      3. Anvendelse af en 1 ml pipette og pipette, langsomt trække 100 pi suspensionskultur og overførsel i en steril 0,5 ml eppendorfrør. Luk og dyrkningskolben overføre tilbage i shaker så hurtigt som muligt.
      4. Bland 7,5 pi af en Trypan blå opløsning med 7,5 pi celler. Bland grundigt med 7,5 pi af celle / Trypanblåt blandingen og overføre den til at tælle slide.
      5. Aktiver den automatiske celletalsmåleren og placer optælling glide ind lastning kammer. Den automatiske læser aktiveres, og cellerne tælles automatisk i enhederneaf antallet af celler pr ml og procent levedygtighed
      6. Bestemme mængden af donor kultur nødvendig for overførsel til en frisk dyrkningsmedium ved celler tæthed på 0,3 x 10 6 levende celler / ml.
        Bemærk: Se en beregning prøve i supplerende materiale.
      7. Gentag trin 1.1.2 og 1.1.3 i "1.1 Kultur Podning" protokol ovenfor for at forberede materialer, der kræves for frisk dyrkningsmedium.
      8. Overførsel medium A (23 ml) og Medium B (3 ml) til en frisk 125 ml dyrkningskolbe. Fjern bestanden flasker medium A og Medium B fra biosikkerhed kabinet.
        Bemærk: Lagre af medierne flasker bør ikke opbevares i biosikkerhed kabinet på samme tid som HEK 293F cellerne. Dette begrænser muligheden for forurening af bestanden mellemstore flasker.
      9. Fjern HEK293 cellekultur fra inkubatoren og spray med 70% ethanol i vandig opløsning. Ved hjælp af en ny pipette trække portion af celler (4 ml, blev denne mængde bestemmes efter to trin 1.2.6) fra kulturen og overføre den til kolben indeholdende frisk dyrkningsmedium.
      10. Overfør både kulturer fra biosikkerhed kabinet til inkubatoren shaker indstilles i henhold til 1.1.1. Grow celler til en omtrentlig densitet på 2-3 x 10 6 levende celler / ml.
        Bemærk: Den omtrentlige fordobling tid af celler er 32 timer. Det vil tage 3-4 dage at nå denne tæthed. Inkubér cellerne i 3-4 passager for at have stabile vækstmønster af celler forud for den første transfektion.

    2. Forbered Materialer til transfektion

    1. Forberedelse HEK293-celler (dag 1)
      1. Subkultur celler til en densitet på 1 x 10 6 celler / ml i frisk medium B 24 timer før transfektion i overensstemmelse med Trin 1.2.
        Bemærk: volumenet af transfektion kultur vil være afhængig af antallet af celler. Større transfektion mængder (> 20 ml) vil kræve en større mængde kultur på dette tidspunkt.
    2. Forberedelse Stocks af Materialer
      1. Forbered stamopløsning af lineære polyethylenimin (PEI) i en koncentration på 1 mg / ml i en buffer indeholdende 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) og 150 mM NaCl (pH 7,5). Opløs PEI helt; dette kan tage 30-60 minutter ved stuetemperatur. Der steriliseres ved 0,22 uM sprøjtefilter og opbevares ved -20 ° C til lang tids brug.
      2. Fremstille sterile plasmid-DNA (ifølge trin 2.2.2.1-2.2.2.4). Proceduren plasmidet konstruktion er beskrevet andetsteds 42. En kort fremgangsmåde til DNA-fremstilling er forklaret her:
        1. Dyrk en kultur af kemisk kompetente Escherichia coli celler transformeret med vektoren pGEN2 i 1 liter LB-medium (Tryptone- 10 g / l, gær udledning af de 5 g / l og natrium chloride- 10 g / l) suppleret med 100 ug / ml ampicillin. E. coli dyrkes ved 37 ° C i en ikke-befugtet, rysteinkubator.
        2. Oprense pGEN2 vektor, der koder målplasmidet DNA ifølge manukantens DNA oprensningsprotokol.
        3. For at sikre fuldstændig sterilitet af plasmid-DNA'et, foretage den afsluttende isopropanoludfældning og resuspension trin af DNA ekstraktionsmetoder inde i biosikkerhed kabinet.
        4. Tilsæt volumen isopropanol (specificeret i plasmidpræparat kit) til det eluerede DNA og centrifugeres ved 10.000 x g i 10 minutter. Steriliser ydersiden af ​​DNA beholder med 70% ethanol i vandig opløsning og overføre den inde i kabinettet biosikkerhed. Kassér isopropanol supernatanten under anvendelse af en pipette og lufttørre DNA-pelleten. Når det er tørt, pellet resuspenderes i sterilt 10 mM Tris-buffer, pH 8,0.
      3. Forbered stamopløsning på 220 mM valproinsyre (VPA) syre i vand og der steriliseres ved passage gennem et sterilt 0,22 um filter. Opløsningen opbevares ved -20 ° C indtil yderligere anvendelse.

    3. Etablering af en kortvarig transfektion

    1. Transfektion (dag 0)
      1. Tjek celledensiteten ved at følge trin 1.2.2 gennem 1.2.5 af ovenstående "1.2. Cell Vedligeholdelse". Bestem mængden af celler til transfektion (2,5-3,0 x 10 6 levende celler / ml med levedygtighed> 95%). Se en beregning prøve i supplerende materiale.
      2. Overfør mængden af ​​suspensionskultur celler beregnet i det foregående trin (her 67 ml) til en 250 ml centrifugerør under anvendelse af en steril pipette serologisk. Indsamle cellerne ved centrifugering i 5 minutter ved 100 x g.
      3. I mellemtiden forbereder en frisk transfektion dyrkningsmedium efter trin 1.1.3 i henhold til "1.1. Kultur Podning" ovenfor. Se supplerende materialer til en beregning prøve. Også, overføres 5 ml af frisk dyrkningsmedium til et sterilt 15 ml rør og afsat.
      4. Overfør rør indeholdende de pelleterede celler i biosikkerhed kabinettet efter sterilisering ydersiden af ​​rørene med 70% ethanol i vandig opløsning og bruge en steril pipette at dekantere the supernatant bestående af brugt dyrkningsmedium.
      5. Kraftigt resuspendere pelleterede celler ved pipettering op og ned ved 10 ml frisk dyrkningsmedium og overførsel til kolben med frisk transfektion dyrkningsmedium (fremstillet i trin 3.1.3 ovenfor). Skrue hætten på den ventilerede cellekultur og kolben flytte til inkubatoren (som angivet i 1.1.1) i 15 min-1 time med omrystning.
      6. I løbet af denne tid fortyndes plasmid-DNA og PEI lagre ved hjælp af frisk dyrkningsmedium (ved hjælp af 5 ml volumen udtages fra trin 3.1.3 ovenfor) til en slutkoncentration på 0,5 ug / ul. Se eksempler beregninger i supplerende materialer til at bestemme mængden af ​​DNA og PEI. Dyrkningskolben Overfør med spredte celler ind i biosikkerhed kabinet.
      7. Tilføj plasmid DNA (300 pi 0,5 pg / pl) til kulturen ved hjælp af mikro-pipette og bland ved forsigtig manuel rystning. Tilføj PEI (900 pi 0,5 pg / pl) til kulturen, blandes ved forsigtigt at ryste. Tilføj 3,8 ml frisk cultur medium fra trin 3.1.3, ovenfor og overføringskolben til inkubatoren rysteapparat i 24 timer.
      8. Rengør biosikkerhed kabinet ifølge trin 1.1.
    2. Fortynding (dag 1) (For en 50 ml transfektion volumen)
      1. Inkubér transficerede kultur i 24 timer.
      2. Udtag 1 ml forvarmet 220 mM valproat (VPA, fremstillet i overensstemmelse med trin 2.2.3.) Ved hjælp af en steril 1 ml serologisk pipette og overføre det til et sterilt 50 ml rør.
      3. Træk 5,0 ml forvarmet medium B og 44 ml forvarmet medium A og tilføje dette til APV opløsning under anvendelse af en steril pipette serologisk at forberede 50 ml frisk dyrkningsmedium med en slutkoncentration på 4,4 mM af VPA.
      4. Flyt transficerede kultur i biosikkerhed kabinettet efter sterilisering ydersiden af ​​kolbe med en 70% ethanol i vandig opløsning, tilsæt den forberedte fortynding medium og overføre kolben tilbage til inkuberet rysteapparat.
    3. Udtryk og Harvest (dage 2-6)
      1. Inkubér cellerne i yderligere 4-5 dage (5-6 dage alt eftersom transfektion).
      2. Udtag prøver af dyrkningsmedium efter trin 1.2.2. til 1.2.5. beskrevet i "1.2. Cell Vedligeholdelse," ovenfor bruge en steril 1 ml serologisk pipette til at overvåge celler levedygtighed og gem portioner til at analysere proteinekspression ved hver dag ved SDS-PAGE (se afsnit 5 nedenfor).
      3. Harvest celler efter 5-6 dage ved centrifugering af celler plus medium ved 1.000 g i 5 minutter. Derudover høste supernatanten, hvis cellelevedygtigheden falder under 50% (se trin 1.2.2-1.2.5).
      4. Hæld supernatanten, der indeholder secerneret protein. Der tilsættes 5 ml af en 10% blegemiddel til HEK cellepelleten og kassér som biohazard.

    4. Protein Purification

    1. Forbered en kolonne med 5 ml protein-A sepharose. Ækvilibrering af søjlen med søjlevolumener af puffer A (20 mM 3- (5 N-morpholino) propansulfonsyre (MOPS), pH 7,4, 100 mM NACl).
    2. Centrifugeres indsamlet supernatanten med udtrykt protein ved høj hastighed (14.000 g i 10 minutter) for at fjerne eventuelle resterende celledebris. Saml ved dekantering i et frisk rør. Kassér pillen som en biohazard.
    3. Saml en 10 pi alikvot af supernatanten og desuden indsamle en lille prøve på hvert protein oprensningstrin analysere prøverne ved SDS-PAGE (beskrevet i afsnit 5). Indlæse klarede supernatant og indsamle gennemstrømningen.
    4. Kolonnen udvaskes med 3-søjlevolumener af puffer A og eluering af proteinet med 5-søjlevolumener 100 mM glycin, pH 3,0. Eluatet opsamles i rør indeholdende det halve volumen af ​​1 M TRIS-buffer, pH på 8,0 til hurtigt at neutralisere pH.
    5. Kolonnen udvaskes med kolonnevolumener buffer A og lagre til senere brug 10.
    6. Bufferudveksling det eluerede protein med mindst 10-fold overskud af puffer A under anvendelse af 10 kDa molekylvægt cut-off centrifugalfiltre. Bemærk: Du må ikke koncentrere eluerede prøve tilen meget lav mængde (<2 ml) i den eluerede buffer. Brug centrifugal filtrene til at udveksle bufferen med buffer A.
    7. Store oprenset protein ved 4 ° C indtil næste anvendelse.
      Bemærk: Protein udtrykt i supernatanten kan oprenses ved affinitetssøjler udvalgt på grundlag af proteinets egenskaber eller anvendelse af affinitetsmærker. For en typisk oprensningsprocedure, Protein A-søjle kan anvendes til IgG eller Fc-fragmenter eller nikkel kolonne kan anvendes til proteiner udtrykt med en poly-histidin-tag. Her er en beskrivelse af de oprensningstrin for IgG1-Fc ved hjælp af en Protein A-søjle.

    5. Analyse af protein ved SDS-PAGE

    1. Fortynd de portioner (7,5 pi) af hver prøve med et lige så stort volumen af ​​2X loading buffer (0,125 M Tris, pH 8,0, 4% SDS, 10% β-mercaptoethanol, 20% glycerol og 0,01% bromphenolblåt).
    2. Blandingen koges ved 90 ° C i 5 minutter under anvendelse af en varmeblok eller vandbad. Centrifugeres prøverne ved 10.000 g for 1 min. Læg den forberedte gel med 5 pi markørproteinet og 14 pi prøver til analyse ved hjælp af en 20 gl pipette med en engangs spids.
    3. Kør en gel ved 25 milliampere i 60 min. Når elektroforese trin er fuldført, overføres gelen til en beholder med 1 liter vand og mikroovn i 5 min.
    4. Farv gelen med farveopløsning (40% ethanol, 10% eddikesyre og 0,1% coomassie brilliant blue) i 2 timer og affarvning i vand.

    6. Glykaner Analyse af massespektrometri

    1. Analyser glykaner som beskrevet tidligere 44. Kort fortalt blev 75 ug IgG1-Fc trypsiniseret, derefter behandlet af PNGaseF for frigivelse af glykaner 45. Løst glycaner blev permethyleret og analyseret ved hjælp af matrix-assisteret laser-desorption ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF-MS).

    7. Protokol Reguleringer for Særlige Scenarier

    1. Mærkning af proteiner med 15 N-mærkede aminosyrer (for en 50 ml transfektion volumen)
      1. Dispensér 5 mg af hver aminosyre i en enkelt steril hætteglas. Resuspender med 4 ml autoklaveret vand (bemærk Tyr ikke fuldstændigt opløse modsætning Lys og Phe). Steriliser opløsningen ved autoklavering ved 121 ° C i 15 min. Lad opløsningen afkøle til ca. 50-60 ° C.
      2. For en 50 ml transfektion volumen, skal du følge trin 3.1.3 i henhold til "3.1 Etablering af en kortvarig transfektion". Se afsnittet supplerende materialer for et eksempel med passende mængder.
      3. For transfektion, følg trin "3. Etablering af en kortvarig transfektion" ved hjælp af frisk dyrkningsmedium substitueret med mærkede aminosyrerester som fremstillet ovenfor.
      4. Efter 24 timer af transfektion, på dagen for kultur fortynding trække 5,0 ml forvarmet medium B, 40 ml forvarmet medium A og en frisk autoklaveret 4 ml alikvot af aminosyren blanding (fremstillet som i trin 7.1.1. Ovenfor) og der tilsættes 1ml forvarmet stamopløsning af VPA-opløsning til fremstilling af 50 ml frisk fortynding dyrkningsmedium med en slutkoncentration på 4,4 mM af VPA. Tilføj dette medium til transfektion kultur anvendelse af en steril pipette serologisk.
      5. Overfør det transficerede kultur i biosikkerhed kabinettet efter sterilisering ydersiden af ​​kolbe med en 70% ethanol i vandig opløsning, tilsæt den forberedte fortynding medium og overføre kolben tilbage til inkuberet rysteapparat.
        Bemærk: Medium A er et kemisk defineret, serumfrit medium. Det er således muligt at fremstille en anden formulering. Kontakt leverandøren for at få en brugerdefineret Medium Et præparat, der mangler visse aminosyrer. Det er muligt at have alle aminosyrer udeladt, men vi foretrækker at bruge medium, der mangler kun få udvalgte rester, fordi en komplet frafald medie ville kræve justering af osmolaritet efter tilskud. Vi valgte en Lys-Tyr-Phe dropout medium, der kan suppleres og kræver ikke osmolaritet justering. Furthermore, Medium En leverandør ikke frit deler koncentrationerne af mellemstore komponenter; vi anvendte 100 mg / L hver for Lys, Tyr og Phe med succes. Volumener af transfektion og ekspression medium skal justeres for at tage højde for de tilsatte aminosyrer. Her er de justeringer af ovennævnte protokol til isotop mærkning
    2. Supplere transfektion med et lille molekyle
      1. Forbered 100 mM stamopløsning af 2-deoxy-2-fluor-l-fucose hjælp autoklaveret vand og sterilisere denne opløsning under anvendelse af et 0,22 um filter.
      2. For en 50 ml kultur, tilsættes 125 pi (ved 250 uM) af fucose analog løsning på transfektion og fortynding medier. Bemærk: Vi forsømt at udføre yderligere justering af lydstyrken, fordi tilføje substituent ved denne koncentration udgør kun 0,25% af den samlede kultur volumen .Det er muligt at ændre udtrykket ved hjælp af små molekyler hæmmere af glycan behandling. Her beskriver vi betingelserne for herunder 2-deoxy-2-fluor-l-fucose, en inhibitor af glycan fucosylering. Vi fandt> 90% reduktion i fucosylering ved tilsætning af fucose analog i en koncentration på 250 uM i transfektion og fortynding medier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Højt niveau proteinekspression og renhed

Denne optimerede ekspressionssystem gav et højt udbytte af glycosylerede proteiner. Et typisk mønster er vist i ekspressionen af IgG1-Fc (figur 1). I dette tilfælde Dag 0 er transfektion dag, efterfulgt af dag 1 (fortynding) og efterfølgende kultur dage op til dag 5. Protein ekspression analyseret ved anvendelse af opløselige fraktion ekspression i rå medium. En meget lille mængde af protein-ekspression blev observeret i dag 1 som kulturen portion blev udtaget 3 timer efter dyrkning fortynding. Det er nemmere at visualisere GFP-med mærkede proteiner, der viser en tydelig grøn farve i dyrkningsmediet. En sådan stigning blev observeret i ekspression af GFP-FcγRIIIa og GFP-ST6GalI fra dag 2 til dag 5. Ingen signifikant stigning i udtrykket blev observeret mellem dag 4 og dag 5. På dag 5 blev cellerne <50%levedygtig og dermed kultur blev høstet for at begrænse proteolyse. Affinitetsoprensning under anvendelse af en protein A-søjle for IgG1 Fc eller nikkel kolonnen for GFP-FcγRIIIa resulterede i proteiner med høj renhed (> 99%; figur 2), udbytte (tabel 1) og fuldstændig glycosylering (data ikke vist).

15 N eller 13C isotopmærkning af proteiner og glycaner

Dette system udtrykt effektivt isotopisk beriget IgG1 Fc ifølge den beskrevne protokol. Selv en lille reduktion i proteinudbytte blev observeret (25-50%), blev godt dispergerede signaler set i et 2d NMR-spektrum, der korrelerer resonansfrekvens 1 H-atomer og direkte bundet amid 15 N-atomer (Figur 3). Dette niveau af udtryk muliggør effektiv proteinproduktion på skalaen kræves for struktur-baserede studier (typisk 2-20mg protein), og illustrerer den vellykkede inkorporering af de mærkede isotoper i proteinet. Den høje grad af lighed mellem dette spektrum og offentliggjort spektre indikerer en høj grad af protein mærkning forekom med minimal scrambling af de 15 N etiketter 43.

Fremstilling af proteiner med forskellige N-glycaner

Forskellige glycoformer blev produceret med HEK293F og HEK293S celler. Matrix-assisteret laser desorption ionisering massespektrometri (MALDI-MS) analyser af enzymatisk frigivet N-glycaner viste de forventede glycoformer (figur 4). Proteinerne udtrykt fra HEK293S celler nærede N-glycaner, der var i Man 5 GlcNAc 2 formular og ikke indeholdt fucose (figur 4). Glycaner fra HEK293F udtrykt materiale var komplekse type, biantennær former med kernefucose og for det meste med terminaleN-acetylglucosamin (GlcNAc) eller lille andel af mono- eller di-galactosyleret (Gal) former. Selvom det ikke er, hvad de native N-glycaner af ST6GalI og FcγRIIIa er, jo glycan profil for IgG1 Fc er meget lig IgG1 Fc oprenset fra humant serum 46. De vigtigste forskelle omfatter graden af ​​modifikation IgG1 Fc fra humant serum viser en højere grad af galactosylering end observeret for HEK293F ekspression. Tilsætning af 2-deoxy-2-fluor-l-fucose, en inhibitor af glycan fucosylering, til et udtryk udført ved anvendelse af HEK293F cellelinje viste en dramatisk> 90% reduktion i fucose inkorporering (figur 4).

Figur 1
Figur 1: høje udbytter af rekombinante proteiner udvindes ved at udtrykke fra pGEN2 vektoren. (A - B) To udtryk vectors anvendt i denne undersøgelse blev genereret fra en pIBI30 plasmid, der indeholder en forstærker R kassette og en E. coli replikationsstartsted. (C) Ekspression af den udskilte IgG1 Fc-protein efter transient transfektion af celler HEK293F. SDS-PAGE analyse viser ophobningen af udtrykte proteiner fra dag 0 til dag 5 og er angivet med pilen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Udvinding af udtrykt protein fra dyrkningsmediet. (A) IgG1-Fc, (B) GFP-FcγRIIIa. "Medium" henviser til dyrkningsmediet efter centrifugering; FT = gennemstrømningsfraktionen fra oprensningssøjle. SDS-PAGE prøver er pr epared i ikke-reducerende betingelser uden β-mercaptoethanol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Aminosyre selektiv mærkning af IgG1 Fc 1 H 15 N heteronuclear enkelt kvante sammenhæng spektrum af [15 N-Tyr, 15 N-Lys] -mærket IgG1 Fc udtrykt ved hjælp HEK293F celler i brugerdefinerede Medium A suppleret med (15 N ) mærket L-Tyr og L-Lys. Crosspeaks blev tildelt på grundlag af tidligere rapporter 43,47. Klik her for at se en større version af dette tal.

_upload / 53568 / 53568fig4.jpg "/>
Figur 4:. Protein ekspression i nærvær af små molekyler modulatorer af glycan præparat N-glycan profiler af IgG1 Fc udtrykt i HEK293-celler under anvendelse af forskellige dyrkningsbetingelser. Den øverste spektrum blev fremstillet under anvendelse glycaner isoleret fra IgG1 Fc udtrykt i HEK293S celler. Centret spektrum afslører IgG1 Fc glycoformer fra materiale udtrykt i HEK293F celler og bunden spektrum blev fremstillet på lignende forvente celler blev dyrket i nærvær af en inhibitor af BNP-fucose biosyntese, 2-deoxy-2-fluor-l-fucose. N-glycaner præsenteres som tegneserie diagrammer efter CFG konventionen 5: N- acetylglucosamin (GIcNAc), blå firkanter; Mannose (Man), grønne cirkler; Fucose (fuc) røde trekanter; Galactose (Gal), gule cirkler. Klik her for at se en større version af dette tal.

<tbody>
Protein Udbytte (mg / L)
IgG1 Fc 120
GFP-FcgRIIIa 100
GFP-ST6GalI 95

Tabel 1: Udbytte for forskellige proteiner udtrykt i HEK293F celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol illustrerer proteinekspression via transient transfektion af HEK293F eller S-celler. De optimale transfektion betingelserne i Barb og Moremen labs ansætte en kritisk kombination af celle tæthed og reagenskoncentrationer at opnå høj effektivitet transfektion. Kritiske overvejelser, når anvendelsen af ​​denne protokol omfatter: opretholde en stabil kultur forud for transfektion (med konsekvent kultur fordobling gange); transfektion af aktivt voksende celler (opnået ved at fortynde celler til 1 x 10 6 celler / ml 24 timer før transfektion) med cellelevedygtighed på mere end 95%; celledensitet på transfektion skal være mellem 2,5-3,0 x 10 6 levende celler / ml med en levedygtighed> 95% (transfektion densitet) i en kultur indeholdende 90% Medium A og 10% Medium B; og ved at tillægge DNA før PEI tilsætning ved 3 ug / ml og 9 ug / ml, henholdsvis 31; ved 24 timer efter transfektion kulturen fortyndet 1: 1 i medium containing 4.4 mM valproinsyre at resultere i en koncentration på 2,2 mM valprioc syre i den fortyndede kultur; vækstfasen produktionen fortsætter derefter i en befugtet rystekolbe ved 37 ° C og 8% CO2 i yderligere 4-5 dage. Den her beskrevne vektor er optimeret og et vigtigt træk af den opløselige protein-ekspressionssystem 32,42.

Hvis et målprotein ikke at udtrykke, i tillæg til de ovennævnte faktorer, kan flere andre variabler bidrager til lave udbytter. Sørg for DNA-sekvensen protein-kodende indeholder codon optimeret til humane celler. Dette kan vurderes med flere online ressourcer. Sterilitet hele proceduren er altafgørende. Et aktivt voksende og renkultur af HEK293F celler skal vises en anelse kornet med det blotte øje, og mediet skal være overvejende klart (især ved celledensiteter <1,0 × 10 6 celler / ml).

Kulturer forurenet med bakterier eller svampe skalstraks fjernes for at forhindre spredning. Er det vigtigt at opretholde en sund stamkultur. Dette opnås ved podning disse kulturer ved en densitet på celler 0,3 x 10 6 celler / ml. Lavere podning densiteter kan bremse væksten ved at begrænse levering af forskellige vækstfaktorer, der er nødvendige for cellevækst og deling 48. Som kulturer er blevet passeret i mere end 25 eller 30 gange, blev et fald i udtryk overholdes. Af denne grund, kulturer passeret mere end 30 gange kasseres.

Det er muligt proteinet at blive nedbrudt i udtrykket medium, eller ekspressionen tidsramme er for lang, hvilket fører til proteinnedbrydning. Af disse grunde er det anbefales at overvåge levedygtighed kultur og proteinekspression ved hver dag for at bestemme en optimal ekspression tidsramme. Det er vigtigt at oprense proteiner så hurtigt som muligt efter høst mediet. For nogle proteiner, er det nyttigt at inkludere proteaseinhibitorer during oprensning. I alt har disse justeringer forbedret inddrivelse af proteiner i Barb og Moremen laboratorier 42,43.

Den forbigående transfektion af HEK293-celler har vist stor anvendelighed til fremstilling af opløselige proteiner og proteindomæner, der er naturligt målrettet mod den sekretoriske pathway. Det er sandsynligt, at produktion af cytoplasmatiske eller integrale membranproteiner vil kræve yderligere optimering. En primær fordel ved dette system er de indfødte substrater og maskiner til proteinproduktion er til stede og tilgængelig i HEK293 celler 49. Dette forklarer i vid udstrækning til sine fordele i forhold til andre rekombinante protein produktionsmetoder såsom bakterier med ingen eller begrænsede post-translationelle modifikationer, eller gær- og baculovirussystemer med korrekt foldet, men forskellige N-glycoformer indarbejdet 1,50,51.

Endvidere protokollen beskrevet her viser den ekstra kapacitet kan omfatte lavmolekylære compounds såsom mærkede aminosyrer, mærket glucose eller små molekyler til formål at ændre den N-glycan sammensætning. De HEK293 celler også vise sig dygtige til udtryk af ikke-pattedyr proteiner, herunder plante enzymer og understøtter co-ekspression af flere polypeptider til genopretning af proteinkomplekser (data ikke vist).

Den strukturelle og funktionelle karakterisering af glycoproteiner vanskeliggøres ofte af prøven produktions- udfordringer. Den proteinekspression her beskrevne system overvinder denne ulempe ved varetagelse posttranslationelle modifikationer ved hjælp af naturligt supplement af avancerede intracellulære glycan forarbejdning enzymer 6. Denne robuste og enkle protokol er bevist for forbigående transfektion af suspension humane HEK293 celler. Denne metode viste signifikant glycoprotein udbytte (> 95 mg / l) med tre N-glycosylerede proteiner og kan rumme kosttilskud såsom mærkede aminosyrerester eller de små molekyler kemiske inhibitor 2-deoxy-2-fluor-l-fucose. De udtrykte glycoproteiner kan yderligere remodeled post-rensning til fremstilling af en lang række definerede glycoformer 52.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af de tilskud K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) og P01GM107012 (KWM) fra National Institutes of Health, og ved midler fra Roy J. Carver Institut for Biokemi, Biofysik & Molekylær Biologi på Iowa State University . Indholdet af dette arbejde er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety cabinet  NuAire, Inc. CellGard ES NU-S475-400 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shaker INFORS HT Multitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium  Life Technologies 12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium  SIGMA 14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431144
FreeStyle HEK 293F Cells Life Technologies R790-07
1 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10B
10 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10J
25 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP) Drummond Scientific 161263
Trypan Blue Solution  Thermo Scientific  SV30084.01
Counting slides  Bio-Rad 145-0011
TC20 Automated Cell Counter  Bio-Rad  145-0102
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc. 23966 Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) EMD Chemicals Inc. 7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM Fisher Scietific 09-719A
Trisaminomethane (Tris base) Fisher Scietific BP152-1
XL1-Blue Stratagene 222249
Trypton Fisher Scietific BP1421-2
Yeast extract Fluka Analytical  92144
Sodium chloride BDH chemicals BDH8014
Plasmid Purification Kit QIAGEN 12145
Valproic (VPA) SIGMA P4543 Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
Centrifuge Thermo Scientific  EW-17707-65
Protein A-Sepharose column SIGMA P9424
Ni-NTA superflow QIAGEN 30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Fisher Scietific BP308-500
Glycine Fisher Scietific BP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters  Millipore UFC901096
Sodium dodecyl sulfate ALDRICH L3771
Beta-mercaptoethanol ALDRICH M6250
Glycerol SIGMA G5516
Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad 161-0373
Acetic Acid, Glacial  Fisher Scietific 64-19-7
coomassie brilliant blue  Bio-Rad  161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO  Applied Biosystems
15N labeled L-Tyrosine ALDRICH 332151
15N labeled L-Lysine ALDRICH 592900
Unlabeled L-Phenylalanine SIGMA-ALDRICH P2126
13C6-Glucose ALDRICH 389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose  SANTA CRUZ Biotechnology sc-283123

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. Essentials of Glycobiology. , Second edition edn, Cold Spring Harbor . (NY). (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine--glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. Makrides, S. C. 38, Elsevier. 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).

Tags

Cellular Biology glycoprotein immunoglobulin G Fc receptor rekombinante proteiner human HEK293F og HEK293S celler

Erratum

Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 09/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

High Yield Ekspression af rekombinant human Proteiner med transient transfektion af HEK293-celler i suspension
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Subedi, G. P., Johnson, R. W.,… More

Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. W. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (106), e53568, doi:10.3791/53568 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter